烟草培养方法以及转基因方法
转基因烟草
●生产抗艾滋病病毒药物
在欧盟资助的一个针对艾滋病的专项研究中，研究人员 成功地从转基因烟草中获取了防艾滋病病毒抗体2G12， 这种抗体与病毒表面的蛋白质结合后，可以阻止病毒进 一步侵入人体的免疫细胞。 从转基因烟草中提取抗体，可以极大地降低抗艾滋病药 物的成本，这个专项研究由欧盟国家的39个研究机构和 企业共同参与。
植物表达载体的改造和农杆菌的转化
烟草的转化及再生
植物DNA的分析 转基因植物的Northem印迹分析 转基因植物的抗虫试验
抗虫转基因植株的子代遗传分析
研究进程
作为基因工程研究的模式植物，烟草是进行转基因 研究最早，也是转基因种类较多的经济作物
英国 俄国
德国
中美
• 俄国 俄国专家日前培育出了一种转基因烟草， 能够合成与蛛丝蛋白类似的蛋白。 俄科学 院瓦维洛夫普通遗传学研究所专家不久前 获得了一种能够编码类似蛛丝蛋白的基因 。在研究中，他们将这种基因植入在烟草 中生存的一种细菌，并在营养条件下培养 烟草细胞。随著烟草细胞分裂，携带新基 因的细菌DNA 片段会进入烟草细胞，研究 人员利用这种烟草细胞培育出了转基因烟 草。
转基因烟草
程蕾 张润草 门聪 薛瑛
要点
简介背景 原ຫໍສະໝຸດ 研究进程 具体应用• 转基因烟草：
顾名思义，即利用转基因技术种 植而成的烟草。
转基因烟草，商业上有三种主要 的转基因烟草种植：
• 中国式的农艺：防病毒和抗虫性 • 维克托烟草在美国和其他国家生 产的转基因烟草，具有低尼古丁 的特点 • 用于提炼药物和烟草的替代产品
原理
—高效抗虫转基因烟草的研究
● 材料
1.菌种和质粒含有B.t.CrylA(c)完整基因的质粒pB48.ll0和 表达载体pBin437，农杆菌LBA4404和质粒pRAJ275 2.温室培养或无菌培养的生产品种烟草NC89 3.生化试剂 限制性内切酶及其它核酸修饰酶 4.测试昆虫 烟青虫
农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究
转化技术体系, 为分子生物学和植物基因工程的研 究提供较好的技术基础。
1 材料与方法 1. 1 实验材料 1. 1. 1 植物 材料 四 倍 体烟 草 ( Nicotiana tabacum ) 品系 NT12 的无 菌 试 管 苗, 以 MS 为 基 本 培 养 基[ 3] , 附加 3% 蔗糖, pH 5. 8, 于 24 e 、自然光下培
平均阳性 植株数 ( 株/ 块)
阳性植株 频率 ( %)
1. 5 cm @ 1. 5 cm
23
7
30. 4
1. 0 cm @ 1. 0 cm
20
11
55. 0
0. 5 cm @ 0. 5 cm
4
2
50. 0
2. 2 预培养对转化率的影响 实验结果表明, 无论是经过 3 d 预培养的烟草
叶盘, 还是 未经预培养而直接 侵染的叶盘, 都约在 1421 d 后从表面创伤处及边缘出现芽点, 并逐渐长 大成为有几片幼叶的小芽。二者的分化时间、再生 芽的频率没有明显差异。所以, 为了缩短转化时间, 烟草叶盘转化可省去预培养。 2. 3 侵染时间对转化率的影响
图 2 部分转基因植株 PCR 检测结果 M: DNAmarker,K- EcoT 14I digest( TakaRa) ;
烟草转基因研究进展
用 了烟草 叶片 。
是 通过 植 物基 因工程 技术 将编码 特殊性 状 的外源 基 因构建 到植物பைடு நூலகம்表达 载体 上 ， 过生 物 、 理或化 通 物 学等 方法 ， 导入 受体 烟草 细胞 或组织 中， 后 由受 然
现 乙酰 丁香 酮是 农 杆 菌 介导 法 使 用 的关 键 ， 以 所 现在农 杆菌 介导 法在 单子 叶植物 转基 因 中也 被广 泛利用。 １ ２ 外植 体选 择 ．
烟草 的遗 传转化 多选 用 叶片为 外植体 。如 在
收 稿 日期 ： ０ ２Ｏ — Ｏ ２ １ 一４ ２
第 一 作 者 简 介 ： 靖 （ ９ ８ ） 女 ， 苏 省 绍 兴 市 人 ， 读 学 吕 １ ８ 一． 江 在 士 ， 事 烟 草 转 双 价 抗 菌 基 因 研究 。 从 通讯 作 者 ： 若 超 （ ９ ７） 男 ， 蒙 古 自治 区 乌 海 市 人 ， 蒿 １ ７一 ， 内 博 士， 助理 研 究 员 ， 事 油 菜 转 基 因 育 种 研 究 。 Ｅｍａ ： ａ 从 － ｉ ｈ— ｌ
介 导 法 中常 选 用 叶 盘 法 ， 用 的 叶 面 积 一 般 以 选 ０ ５ ． ｍ ． ～１ ０ｃ 为宜 。或 叶 片 直接 用 于 基 因 枪 ， 激
光束等 射击 。例 如 参 照 Ｄ ｎｅｌ的方 法 制 备包 裹 ａｉ ｌ 载体 Ｄ ＮＡ 的金 粉 微 弹 （ ． ｍ） 并 用 Ｐ Ｓ ０ ６ ， Ｄ一 １ ０ ／ 型基 因枪 轰 击 叶 片 的应 用 ， 盘法 ０ ０ Ｈｅ ］叶
污 染 。
１ 烟 草 转 基 因 技术 研 究
１ １ 转 基 因 方 法 ．
抗病毒病转基因烟草的培育方法及展望
状、 外源基 因的合成和导人途径、 载体 的构建 、 基因的 整合和表达、 转化细胞的培养和植株再生以及优 良株 系的选育等， 已经形成一套较为成熟 的技术流程， 获得 大批 抗病 、 虫 转 基 因 烟 草 品 种 （ ） 为 烟 草抗 病 育 抗 系 ， 种提 供 了新 的方 法 和途 径 Ｊ 。本 文 综 述 抗 病 毒 病 转 基 因烟草 的研究 现状 。
［］ ７ 耿华珠． 中国苜蓿 ［ ． Ｍ］ 北京 ： 中国农业大学 出版社 ，９ ５ １９ ．
博 士学位论文 ， 京 ： 北 中国农业大学 ，９ ７ １９ ． ［］ ２ 王成杰． 高水 分打捆贮 藏对 苜蓿干 草营养 价值 和组成 的影
响 ［ ］ 草业科学 ，０ ５ ２ （ ） ｌ ７ Ｊ． ２０ ，２ ４ ：４—１ ．
［ ］ ｕｋ ａｅ Ｄ Ｒ Ｈ ｉｉ ｓＡ Ｊ Ｌｓ ｓａｄｑａｔ ｃａｇ ８ Ｂｃｍ ｓ ｒ ， ｅ ｒｈ ． ｏｓ ｎ ｕｌｙ ｈ ￣ ｔ ｎｃ ｅ ｉ ｎ
ｄ ｒ ｇ ｈ ｒ ｅ ｔ ａ ｄ ｓｏ ａ ｅ ｏ ｒ ｓ ｒ ａ ｉｅ ｔ ａｅ ｌ ｌ ａ ｕ ｎ ａ ｖ ｓ ｎ ｔｒ ｇ ｆ ｐ ｅ ｅ ｖ ｔ ｒ ｔｄ ａｆ ｆ ｈ ｙ ｉ ｖ ｅ ａａ
国农业 出版社 ，９ １ １９ ．
［］ ４ 张秀芬． 压扁 苜蓿 茎秆 加快 干燥 速度的研 究 ［ ］ 中国草地 ， Ｊ．
１８ １ （ ） ２ ２ ． ９ ７，８ １ ：３— ９
［ ］ Ａ ｉ ａ Ｆ ｅ ｃｅｃ ｄＴ ｃｎｌ ｙ １８ ， ７—１． Ｊ ． ｎｍ ｅｄＳ ｉ ｅａ ｅｈｏ ｇ ，９ ６ １ ｌ ｎ ｎ ｏ ６： ５
ａ ｄ ｎ ｔ ｅ ｔ ｌｓ ｅ ｕ ｏ ｒ ｉｆ ｌ ｏ ｅｄ ｄ ｙｎ ｌ ｌ ａ ｎ ｕ ｒ ｎ ｏ ｓ ｓ ｄ ｅ ｔ ａ ｎａｌ ｎ ｆ ｌ ｒ ｉｇ ａｆ ｆ ｈ ｙ ｉ ｉ ａａ
烟草转基因及gus染色的方法
转基因烟草的方法 1.接种单菌落于加有KAN,RIF和STR的3ML液体YEB培养基中，28度培养2天，转接与20ML YEB液体培养基中，28度继续培养至OD600=0.6-0.8。
2.菌液经4000RPM离心10分钟，倒掉上清液，用MS液体培养基重悬菌体，调OD600=0.6-0.8 3.取无菌烟草叶片，去除边缘，主叶脉，剪成大小约1CM*1CM的小块，浸泡在菌体悬浮液中，2-3分钟，期间不断轻轻摇晃。
4.取出叶片，用灭菌滤纸吸取表面菌液，将叶片至于共培养培养基上（MS+6-BA 1MG/L,NAA 0.1MG/L）28度黑暗共培养2-3天。
5.将共培养后的叶片在无菌水和加入羧苄青霉素的无菌水中清洗一遍，灭菌滤纸吸取多余水分，然后转到分化选择培养基上（MS+6-BA 1MG/L,NAA 0.1MG/L，潮霉素10-60MG/L,CARB 500MG/L）25度光照培养，每两周更换一次培养基，直至分化出愈伤组织，进而分化出不定芽。
6.将长至2CM以上的不定芽切下并转移到生根培养基上（1/2MS+NAA 0.1MG/L，潮霉素20-100MG/L,CARB 500MG/L）诱导生根。
7.将一次生根的再生苗切取根尖，接种到新的生根培养基上，诱导生根，不能生根的芽丢掉。
叶盘法转基因烟草技术一．实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。
二. 实验原理：土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。
农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。
土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。
这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。
20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)
1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。
转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。
1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。
◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。
◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。
◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。
1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。
植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。
原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。
多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。
叶盘法转化烟草的原理
叶盘法转化烟草的原理叶盘法是一种生物工程技术，用于转化或改造植物基因组以生产特定物质。
在烟草中应用叶盘法可以用于合成表达外源蛋白、开发抗病毒烟草品种以及烟草遗传改良等领域。
叶盘法的基本原理是利用植物的组织再生能力，通过培养植物的叶片组织培养而成的小体，在适当的培养基组合下，通过添加适当的物质和条件，将目标基因组转化至植物细胞中。
叶盘法的实验流程一般可以分为以下几个步骤：1.植物材料的准备：从健康的烟草植株中采集叶片，并将其洗净，并进行无菌处理以确保实验的纯度。
2.建立愈伤组织：将洗净的叶片剪成小碎片，并将其转移到含有激素和培养基中，利用试管内的适宜条件培养愈伤组织。
这一步是为了为后续基因转化做好基础，并培养植物细胞的再生能力。
3.转化基因：将目标基因或转入质粒经过适当的处理和筛选，将其引入培养的烟草细胞中。
目标基因可以是外源蛋白的编码序列，用于生产特定蛋白质。
转入基因的方法包括生物颗粒轰击、体外基因传递和通过细菌介导的转化等多种方法。
4.培养变性细胞：转入基因的组织在适宜的培养条件下进行培养和筛选，以确保它们能够在细胞内稳定表达目标基因。
同时，还可以使用适当的抗生素来抑制未转化细胞的生长。
5.稳定转化的筛选：利用特定的筛选方法，筛选出稳定表达目标基因的转化细胞。
常用的筛选方法是利用抗生素抗性基因或镰刀形细菌素酶基因，通过添加抗生素或镰刀形细菌素酶底物来诱导或检测转过的细胞。
6.进一步培育和鉴定：将经过筛选的转化细胞进行进一步培养，培育出大量具有目标基因的烟草植株。
同时，对植株进行鉴定和检测，确认目标基因的稳定性和表达水平。
通过以上步骤，叶盘法能够有效地将外源基因导入到烟草植株的基因组中，并使其稳定表达。
通过优化培养条件和基因的筛选方法，可以进一步提高转化效率和稳定性。
叶盘法的优点在于操作简单、转化效率高、转基因植株易于培养和大规模扩繁等。
然而，叶盘法也存在一些局限性，如转化效率和稳定性的波动性、可能引发的遗传不稳定性等问题，需要进一步的优化和改进。
转基因烟草
生科12101班33 黄海燕
关于烟草
烟草属管状花目，茄科一年生或 有限多年生草本植物，基部稍木质 化。花序顶生，圆锥状，多花；蒴 果卵状或矩圆状，长约等于宿存萼。 夏秋季开花结果。主要分布于南美 州、南亚、中国。在许多国家里， 如保加利亚、加拿大、法国等，烟 草仍是用做转基因研究的。现在我 也用烟草做基础研究，但在我国最 主要的是用做一种经济作物。
发展转基因烟草的意义
1,环境净化方面 烟草具有植株大、生长快、吸附性强、 种植范围广等特点，科学家选择烟草治理汞污染，不 仅效率高，而且本身不残留毒素。 2,医疗方面 可以研制防艾滋病等病症的药物 3,科研方面 在科学研究中也有占据烟草作 为模式植物着十分重要的位置
谢谢观赏！
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
转基因烟草在其它领域的运用
1 科学研究方面，作为模式生物进行多方面的转 基因研究
2 环境净化方面 植物修复型转基因烟草
3在医疗方面 生产抗艾滋病病毒药物
在我国发展近况
自1996-1997年起，中国的许多省份都出现了转基 因烟草：主要是用于国内的烟草作物，也进入了国 际贸易。这些转基因烟草的主要特点是：烟草植入 了病菌和黄瓜的抗病菌性，在控制这些疾病方面非 常有效。但农民对种植转基因烟草的信息了解的非 常少。
目录
抗病毒转基因烟草概述 转基因烟草在其它领域的运用
在我国发展近况 发展转基因烟草的意义
抗病毒转基因烟草
病毒病素有烟草“癌症”之称。我国烟区发现 的烟草病毒有许多。其中，分布最广、危害最 重的主要是烟草花叶病毒( TMV) 、黄瓜花叶病 毒( CMV)。因此解决烟草病毒病危害最为有效 的方法就是培育具有抗病毒能力的烟草品种利 用基因工 程手段进行抗病毒育种，也就是我们 所讲的培育抗病毒转基因烟草。
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烟草转基因
准备工具：EP管灭菌
无菌水
Ms培养基
75%的酒精（蓝口小瓶）
升汞(要回收)
1ml枪枪头
EP管架
计时器
一、转基因
(1) 无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；
(2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec；
(3) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；
(4) 播种于MS培养基上，培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实
验室组织培养室中，暗培养4天。
25℃光照培养20-30天。
MS培养基pH5.8
(5) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于MS+BA0.2mg/L（壮芽，使
其快速成长）培养基上，继代培养。
(6) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶
片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。
(7) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。
侵染前一天晚上，
摇菌农杆菌2瓶。
将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。
以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入As25mg/L（40ml 中加40ulAs）
不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；
(8) 将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切
口周围有微菌斑形成；
(9) 洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5
次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；
(10) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA
1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8；
过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。
如果长菌，则继续保持Cef浓度。
(11) 每两周更换一次培养基，直至长出不定芽（一般情况为2周）。
切下再生的
小苗（1cm 左右），转入继代培养基MS+ BA0.2-0.1mg/L+ Hyg25mg/L + Cef500mg/L pH5.8；
(12) 至小苗长至2cm长时（有小芽即可），转接入生根培养基MS+
NAA0.2-0.1mg/L上，24 士1℃、12h 光照、1500lx 培养三周左右即可长出粗壮根系。
(13) 对生根的植株进行PCR初步检测，将结果呈阳性的植株经过炼苗后移到泥
炭：蛭石=7:1的基质中，放入人工气候室进行培养，并对其生长情况进行观察、记录。
农杆菌侵染液的制备
(1) 取-80℃冰箱保存的含有表达载体的农杆菌，划平板培养，LB固体平板中加
入50mg/L Kan和50mg/L Rif；
(2) 挑取单菌斑到含50mg/L Kan和50mg/L Rif的5mL LB液体培养基中，放入
摇床中28℃、200rpm培养过夜（12h-16h）；
(3) 保存菌种，750ul菌液加入灭过菌的甘油250ul，-80℃冰箱保存备用。
(4) 摇菌，LB液体培养基10ml加Kan（所需浓度50mg/L）10ul、Rif（所需浓
度50mg/L）10ul及菌液10ul，28℃、200rpm过夜培养（12h-16h）。
(5) 当菌液浓度达到OD600=1.5左右时，取2mL菌液加入到离心管中，4000rpm
离心5min；
(6) 倒掉上清液，吸1mL新的MS液体培养基，重悬农杆菌，4000rpm离心5min。
(7) 重复步骤（6）一次；
(8) 用1mL的MS液体培养基重悬菌后，再加入到40mL的MS的液体培养基中
（含40ul 25mg/L的As），即为侵染液。
放置2h以上，再侵染。
200ml悬菌液
20x大量10ml
200x有机1ml
200x铁盐1ml
200x微量1ml
蔗糖5.6g
二、烟草转化Hyg筛选压的确定
因为所构建的载体具有潮霉素（Hygromycin,Hyg）抗性，所以转基因过程中需用Hyg进行抗性苗的筛选。
以MS培养基为基础，添加不同Hyg浓度梯度进行试验，共设7个Hyg梯度：0 mg/L、5mg/L、10 mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L。
取烟草叶片或茎段划伤口后分别接种到潮霉素的诱芽培养基中（40-45天），30天后观察受体材料生长情况，统计外植体的出芽率，选择可以抑制受体材料生长的最低Hyg浓度作为筛选压。
（70-75天。
）最终Hyg筛选浓度为25mg/L。