转基因烟草方法
2．材料与方法2.1实验材料植物材料：K326烟草种子药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等；MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。
高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml.生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10gMS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基2.3实验方法2.3.1浸染菌液制备将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。
挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。
活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。
取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。
加入100ml的MS0培养基，混匀。
2.3.2烟草转化按叶圆盘法转化烟草。
将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。
然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。
将浸染过的叶盘分接种在覆有两层滤纸的预培养基上号，26℃下暗培养20-24h。
用加头孢霉素，羧苄青霉素(母液1000倍)的无菌水清洗10分钟，最后用无菌水清洗10分钟，然后用无菌滤纸吸去其表面的液体再转入分化培养基进行分化培养，前期2-3天继代一次，每次继代需在无菌条件下进行，连续继代3次后就每隔两周继代一次。
共培养至第一个小芽长出。
转入组培瓶培养待芽长至2厘米时，在超净台上切去芽基部的所有愈伤组织及基部叶片，植于生根培养基上。
待根长至3厘米时，取出无菌苗，轻轻打碎固体培养基，洗去残留的培养基。
然后将无菌苗置入土壤，套上透明塑料袋（扎孔），培养大约一周，移到室外。
（最初的3天应在阴暗处生长）。
3．结果与分析3.1无菌苗的培养：图1为K326烟草种子在MS培养基中培养20天与40天左右的烟草幼苗图，每个培养瓶有4-5棵烟草幼苗。
烟草植株大致生长到株高为6-8厘米时即可用于制作叶盘，此时每株大概有5-8片叶子，取中间大小且健康的的叶片用于制作叶盘。
A B图13.2分化培养图2分别为分化培养初期浸染叶片的培养图、叶片形成愈伤组织图片与愈伤组织上烟草新芽图片。
浸染初期由于叶盘体积小，所以每个培养皿里面的叶小块大概15块。
随着愈伤组织的形成和不断生长，培养皿条件已经不能满足愈伤组织的生长要求，这时将愈伤组织转入培养瓶中，每个培养瓶1-2个愈伤组织。
定期给愈伤组织更换培养基以保证其充足的成长营养。
愈伤组织经过再分化长成了烟草幼芽，此时，用携带AtWRKY22基因的农杆菌浸染的烟草愈伤形成的幼芽长势良好，而对照组的幼芽则被漂白。
A BC图23.3生根图3为愈伤组织上形成的幼芽在生根培养基上的生长图。
从图中可见幼芽生长迅速且未见污染现象，培养基内有长短不一的烟草根长出。
烟草的根呈淡黄色且非常纤细。
此图片说明转基因烟草幼芽已经成功生根。
图33.4转基因烟草的PCR反及分析将移栽的烟草植株在室外条件下生长一段时间，取含有目的基因的转烟草植株叶片和不含目的基因的烟草植株叶片进行PCR反应，反应图谱如下：图4如图所示，M为标记基因电泳结果。
1-6为转基因烟草PCR反应后的电泳图谱，7为非转基因对照组植物叶片的电泳结果。
由图可知转基因植株中检测到了目的基因，这表明AtWRKY22基因已经成功转入烟草植株。
而对照组植株没有检测到目的基因。
4．讨论作为基因工程的模式植物，烟草是进行转基因研究最早，也是转基因种类较多的经济作物。
自1986年以来，已经将烟草花叶病毒（TMV），马铃薯Y病毒（PVY），马铃薯X病毒（PVX）,黄瓜花叶病毒（CMV），苜蓿花叶病毒（AMV），烟草脆裂病毒（TRV）的外壳蛋白基因，PVY复制酶基因，CMV的微卫星RNA，几丁质酶基因、抗菌肽基因、葡糖糖氧化酶、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因（Bt）和蛋白酶抑制基因[12]等上百种外源基因转入烟草获得表达。
在之前拟南芥基因转化烟草的研究中，郭兆奎等[13]将拟南芥A VP2基因转入烟草研究了此基因对植株吸收钾离子的影响。
另外，付乾堂和余迪求[14]研究了拟南芥AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33在非生物胁迫条件下的表达分析。
对于AtWRKY22基因，尚庆茂等[15]研究了其抗病途径。
本实验用农杆菌介导和叶盘法相结合将拟南芥AtWRKY22基因转入烟草以获得抗病性转基因烟草植株。
许多因素都影响根癌农杆菌介导的基因转化：一是受体；二是农杆菌；三是受体与农杆菌的共培养时间。
各种因素的影响程度不同。
受体叶片的生理状态，它决定了被转化的能力。
本实验采用了无菌培养的烟草苗，这就避免了用栽培苗消毒太彻底而导致叶片死亡或是消毒不彻底而导致培养过程中生长其他细菌、真菌的情况。
烟草苗龄为1-2个月时，分化再生能力和对农杆菌感染的耐受力均较强。
苗龄过短时，不易剪出叶缘和主脉的小块，且这种小块在分化培养基只能够也很容易发白而死亡。
如果苗龄过长，特别是继代的时间过长或是代数过多，会大大增加叶片玻璃化的机率，再生能力和对农杆菌感染的耐受力均下降。
对外植体的预培养促进细胞分裂，分裂后的细胞更容易整合外源DNA，因而提高外源基因的转化率[16]。
在对照实验中，不含目的基因的烟草叶盘形成的愈伤组织上产生的新芽被漂白，而转基因愈伤组织上的新芽则正常生长，与赵佩欧等[17]人的实验结果相符合，这主要是因为不含目的基因的新芽不含抗病基因，导致外植体在分化培养基上白化死亡。
本实验用WRKY22基因转化烟草，获得了转基因的烟草植株。
农杆菌介导AtWRKY22基因转化烟草植株的获得为今后研究AtWRKY22基因功能提供了科学依据。
参考文献[1]中国植物志编委会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1985.[2]许旭明.烟草的起源与进化[N].三明农业科技,109(3):25-27,2007.[3]朱尊权.中国烟草生产科研现状与展望[N].中国烟草学报,14（6）:118-119,2008.[4]谢剑平. 2006年烟草化学学科研究发展报告[N].中国烟草学报,13(2):98-99,2007.[5]郝冬梅.中国烟草加工业市场结构与绩效分析[D].北京:中国农业大学研究院,2001.[6]闫克玉,赵铭钦.烟草原料学[M].科学出版社,2008.[7]符树民.烟草知识四百问[M].上海人民出版社.1987.[8]赵左福, 张乐.植物病原细菌简明手册[M].北京:农业植物植疫实验所, 125-128,1992.[9]李光西, 方敦煌, 殷端.香料烟细菌性斑点病病原鉴定[N].植物病理学报, 37(3):232- 236, 2007[10]杨建卿.烟草病理学[M].合肥:中国科学技术大学出版社, 157-161, 2003.[11]中国植物志编委会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1985.[12]闫新甫.转基因植物[M].北京:科学出版社, 381-386., 2003.[13]郭兆奎,杨谦,严培强.拟南芥AVP2基因转化烟草中吸钾相关基因的转录分析[N].西北农林科技大学学报36（9）,2008.[14]付乾堂,余迪求. 拟南芥AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33在非生物胁迫条件下的表达分析[J].HEREDITAS.32(8):848-856,2010.[15]尚庆茂,李晓芬,张志刚.植物对逆境交叉适应的分子机制[N].西北植物学报27（9）:1921-1924,2007.[16]王关林,方宏均.植物基因工程的原理与技术[M].科学出版社,2002.[17]赵佩欧,谢科,郭泽建.水稻OsWRKY10与GFP融合基因的烟草转化及亚细胞定位观察[N].浙江农业学报18（3）:159-162,20065．致谢大学生活一晃而过，回首走过的岁月，心中倍感充实，当我写完这篇毕业论文的时候，有一种如释重负的感觉，感慨良多。
在这即将毕业的时刻，我想感谢身边的很多人。
首先诚挚地感谢我的论文指导老师李立芹老师。
她在忙碌的教学工作中挤出时间来指导我的整个实验过程，从题目的确定到最后论文的完成，她始终耐心地指导我，并认真审查、修改我的论文。
还要感谢教过我的所有老师们，你们严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样。
最后，感谢四年中陪伴在我身边的同学、朋友，感谢他们对我的关爱，感谢他们对我提出的有益的建议和意见，有了他们的支持、鼓励和帮助，我才能充实地度过四年的学习生活。
烟草子房注射法转基因试验
烟草子房注射法转基因试验
烟草子房注射法转基因试验
邹颉1，余婧1，付强1，李世升2*
【摘要】[摘要] 为了快速获得转基因烟草，对烟株子房注射处于对数生长期的含有外源基因的根癌农杆菌菌液。
结果表明：通过初步的50 mg/L Kana抗性筛选及PCR检测，烟草子房注射法能成功获取转入的外源基因得到转基因烟草。
烟草子房注射法与烟草叶盘转化法等常规转基因方法相比，子房注射法简化了试验过程，缩短了试验周期，提高了试验效率。
【期刊名称】贵州农业科学
【年(卷),期】2013(000)012
【总页数】3
【关键词】[关键词] 转基因；根癌农杆菌；烟草；子房注射
植物基因工程技术已在烟草等作物品种改良及模式植物研究上得到广泛应用。
近几十年来，植物转基因技术已经有了长足的发展，这些技术的成功运用对于基础科学的研究和农业生物技术的发展有着极大的促进作用[1-3]。
目前的转基因技术主要分为两大类，一类是直接将基因导入到植物体内并整合，如早些年的化学诱导法(PEG法)、电激法，新发展起来的基因枪法(通过将目的基因片段和重金属颗粒包被整合，直接通过基因枪轰击植物分生组织获得转基因植物材料)[4-6]。
另一类是以根癌脓杆菌作为介导的遗传转化方法，此方法在目前的应用最为广泛。
根癌农杆菌拥有一套独特的Ti质粒系统，与现有的经过改造的双元载体系统相结合能够方便地将目的基因转入到植物基因组中[7-8]。
通过农杆菌浸染进行转基因是一个相对复杂而繁琐的工作，在此过程中，愈伤的产生以及愈伤分化成整体植株的过程需要相当精确的操作技巧；此外，不同的植物转。
转基因烟草方法
2．材料与方法2.1实验材料植物材料：K326烟草种子药品：MS大量元素，MS微量元素，MS铁盐,吲哚乙酸（IAA），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），烟肌醇(B1B6),蔗糖，琼脂，头孢霉素（Cef），羧苄青霉素（Carb），卡那霉素（Kn）、庆大霉素、利福平等；MS培养基(1L):大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、蔗糖30g、琼脂8g，PH值约为6.0预培养基(1L)：大量元素(20x)50ml、微量元素(100x)10ml、Fe2+(100x)10ml、6-BA(1000x)2ml、B1B6(200x)5ml、甘氨酸(1000x)1ml、琼脂8g，PH值约为6.0。
高温灭菌后加IAA(0.2mg/L)1ml分化培养基(1L)：预培养基的基础上加入头孢霉素2ml，羧苄青霉素1ml，卡那霉素1ml.生根培养基(1L)：1/2MS、IAA 2mg/L、蔗糖30g/L、琼脂5.8g/L，pH=5.8 LB液体培养基(1L)：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCI 10gMS0培养基：为不加琼脂的只含大量元素MS培养基2.3实验方法2.3.1浸染菌液制备将含有目的基因的农杆菌在固体LB培养基上划板，28℃下暗培养两天。
挑取单菌落，接种于5ml含50mg.L-1卡那霉素、50mg.L-1链霉素及50mg.L-1利福平的液体LB培养基中，28℃下振荡培养过夜。
活化过夜的农杆菌，按1:50的比例，稀释到含50mg.L-1卡那霉素的新鲜液体LB培养基中，继续培养至OD600值约为0.5。
取培养物1ml，置于无菌离心管中，12000rpm离心1分钟，弃上清。
加入100ml的MS0培养基，混匀。
2.3.2烟草转化按叶圆盘法转化烟草。
将剪切好的烟草叶盘放置在预培养基上培养1-2天后，置于悬菌液中（MSO悬浮，可以稀释50—100倍）浸泡3-5分钟。
然后取出，用无菌滤纸吸去其表面的液体。
转基因烟草操作规程内容(3篇)
第1篇一、前言转基因烟草作为一种新型的生物技术产品，在农业领域具有广泛的应用前景。
为了确保转基因烟草的研究、生产和应用的安全、合规，特制定本操作规程。
本规程适用于转基因烟草的研究、试验、生产和销售全过程。
二、术语和定义1. 转基因烟草：指通过基因工程技术，将外源基因导入烟草植物中，使其表现出新的性状或增强原有性状的烟草品种。
2. 外源基因：指来源于非烟草植物或其他生物的基因。
3. 基因表达载体：将外源基因插入到载体中，用于转化烟草植物的DNA片段。
4. 转化效率：指转基因植物中成功表达外源基因的比例。
5. 安全性评价：对转基因烟草进行的安全性评估，包括环境安全性、食用安全性、生物安全性等。
三、操作规程（一）研究阶段1. 立项审批：研究转基因烟草前，需向相关部门提交申请，经批准后方可进行。
2. 基因选择：根据研究目的，选择合适的外源基因，并进行安全性评估。
3. 基因表达载体构建：将外源基因插入到基因表达载体中，构建转基因载体。
4. 转化方法：采用农杆菌介导转化、基因枪法等方法将转基因载体导入烟草细胞。
5. 转化效率检测：通过PCR、 Southern blot等方法检测转基因植物的转化效率。
6. 植株再生：在筛选出的转基因植物中，采用植物组织培养技术进行植株再生。
7. 抗性检测：对再生植株进行抗性检测，确保外源基因的表达。
（二）试验阶段1. 田间试验：在适宜的田间环境中，进行转基因烟草的田间试验，观察其生长表现、产量、品质等。
2. 安全性评价：对转基因烟草进行环境安全性、食用安全性、生物安全性等评价。
3. 数据分析：对试验数据进行统计分析，评估转基因烟草的性能。
（三）生产和应用阶段1. 生产许可：获得转基因烟草的生产许可证后方可进行生产。
2. 生产过程控制：在生产过程中，严格控制种子质量、栽培技术、病虫害防治等环节，确保转基因烟草的品质和安全性。
3. 产品检测：对生产的转基因烟草产品进行质量检测，确保其符合国家标准。
农杆菌介导的烟草转化
农杆菌介导的烟草转基因技术一、实验目的了解转基因的基本原理及操作方法。
二、基本原理根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种能诱发植物产生肿瘤的细菌，根癌农杆菌中含有诱导植物产生肿瘤的质粒（Tumor inducing plasmid），简称为Ti质粒。
野生型农杆菌的Ti质粒，含有两个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区（transferred DNA region），含致瘤基因；另一个是毒性区（Virulence region），在T-DNA的切割、转移与整合过程中起作用。
农杆菌可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定地遗传给后代。
我们将目的基因插入到经过改在的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
三、材料1、植物材料：烟草无菌苗2、农杆菌与载体：EHA105；PBI121四、方法步骤1、试剂的配制（1）LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂8g/L。
（2）液体MS/MT培养基PH：5.8-6.0（3）烟草共培养培养基：固体MS培养基（4）烟草筛选培养基：MS +（2.0mg/L）6-BA + （0.3mg/L）NAA + （30g/L）蔗糖+ （400mg/L）头孢霉素+ （50mg/L）卡那霉素+ （7.5g/L）琼脂PH：5.8-6.0（5）烟草生根培养基：固体MS培养基2、农杆菌侵染菌液的制备方法：（1）超净工作台紫外灯灭菌15min，接种环酒精灯灼烧灭菌备用（2）铺皿：LB（50mg/L卡那霉素+25mg/L利福平）（3）划线：用接种环沾取预转化的农杆菌菌液于铺好的培养基划“之”字或者“#”字（4）封皿，做标记（5）28℃恒温培养1d-2d（6）用无菌刀刮取适量菌体于50mL液体MS培养基中，28℃，180r/min震荡培养1-2h至均匀悬浮液，紫外分光光度计测量菌液的OD600值，用液体MS调整浓度至OD600值约为0.8-1.0为宜，备用。
抗病毒病转基因烟草的培育方法及展望
状、 外源基 因的合成和导人途径、 载体 的构建 、 基因的 整合和表达、 转化细胞的培养和植株再生以及优 良株 系的选育等， 已经形成一套较为成熟 的技术流程， 获得 大批 抗病 、 虫 转 基 因 烟 草 品 种 （ ） 为 烟 草抗 病 育 抗 系 ， 种提 供 了新 的方 法 和途 径 Ｊ 。本 文 综 述 抗 病 毒 病 转 基 因烟草 的研究 现状 。
［］ ７ 耿华珠． 中国苜蓿 ［ ． Ｍ］ 北京 ： 中国农业大学 出版社 ，９ ５ １９ ．
博 士学位论文 ， 京 ： 北 中国农业大学 ，９ ７ １９ ． ［］ ２ 王成杰． 高水 分打捆贮 藏对 苜蓿干 草营养 价值 和组成 的影
响 ［ ］ 草业科学 ，０ ５ ２ （ ） ｌ ７ Ｊ． ２０ ，２ ４ ：４—１ ．
［ ］ ｕｋ ａｅ Ｄ Ｒ Ｈ ｉｉ ｓＡ Ｊ Ｌｓ ｓａｄｑａｔ ｃａｇ ８ Ｂｃｍ ｓ ｒ ， ｅ ｒｈ ． ｏｓ ｎ ｕｌｙ ｈ ￣ ｔ ｎｃ ｅ ｉ ｎ
ｄ ｒ ｇ ｈ ｒ ｅ ｔ ａ ｄ ｓｏ ａ ｅ ｏ ｒ ｓ ｒ ａ ｉｅ ｔ ａｅ ｌ ｌ ａ ｕ ｎ ａ ｖ ｓ ｎ ｔｒ ｇ ｆ ｐ ｅ ｅ ｖ ｔ ｒ ｔｄ ａｆ ｆ ｈ ｙ ｉ ｖ ｅ ａａ
国农业 出版社 ，９ １ １９ ．
［］ ４ 张秀芬． 压扁 苜蓿 茎秆 加快 干燥 速度的研 究 ［ ］ 中国草地 ， Ｊ．
１８ １ （ ） ２ ２ ． ９ ７，８ １ ：３— ９
［ ］ Ａ ｉ ａ Ｆ ｅ ｃｅｃ ｄＴ ｃｎｌ ｙ １８ ， ７—１． Ｊ ． ｎｍ ｅｄＳ ｉ ｅａ ｅｈｏ ｇ ，９ ６ １ ｌ ｎ ｎ ｏ ６： ５
ａ ｄ ｎ ｔ ｅ ｔ ｌｓ ｅ ｕ ｏ ｒ ｉｆ ｌ ｏ ｅｄ ｄ ｙｎ ｌ ｌ ａ ｎ ｕ ｒ ｎ ｏ ｓ ｓ ｄ ｅ ｔ ａ ｎａｌ ｎ ｆ ｌ ｒ ｉｇ ａｆ ｆ ｈ ｙ ｉ ｉ ａａ
烟草转基因及gus染色的方法
转基因烟草的方法 1.接种单菌落于加有KAN,RIF和STR的3ML液体YEB培养基中，28度培养2天，转接与20ML YEB液体培养基中，28度继续培养至OD600=0.6-0.8。
2.菌液经4000RPM离心10分钟，倒掉上清液，用MS液体培养基重悬菌体，调OD600=0.6-0.8 3.取无菌烟草叶片，去除边缘，主叶脉，剪成大小约1CM*1CM的小块，浸泡在菌体悬浮液中，2-3分钟，期间不断轻轻摇晃。
4.取出叶片，用灭菌滤纸吸取表面菌液，将叶片至于共培养培养基上（MS+6-BA 1MG/L,NAA 0.1MG/L）28度黑暗共培养2-3天。
5.将共培养后的叶片在无菌水和加入羧苄青霉素的无菌水中清洗一遍，灭菌滤纸吸取多余水分，然后转到分化选择培养基上（MS+6-BA 1MG/L,NAA 0.1MG/L，潮霉素10-60MG/L,CARB 500MG/L）25度光照培养，每两周更换一次培养基，直至分化出愈伤组织，进而分化出不定芽。
6.将长至2CM以上的不定芽切下并转移到生根培养基上（1/2MS+NAA 0.1MG/L，潮霉素20-100MG/L,CARB 500MG/L）诱导生根。
7.将一次生根的再生苗切取根尖，接种到新的生根培养基上，诱导生根，不能生根的芽丢掉。
叶盘法转基因烟草技术一．实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。
二. 实验原理：土壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。
农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。
土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。
这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。
20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)
1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。
转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。
1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。
◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。
◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。
◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。
1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。
植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。
原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。
多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。
烟草培养方法以及转基因方法
烟草转基因准备工具：EP管灭菌无菌水Ms培养基75%的酒精（蓝口小瓶）升汞(要回收)1ml枪枪头EP管架计时器一、转基因(1) 无菌条件下，将烟草种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；(2) 于75%的酒精中浸泡30-60sec；(3) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；(4) 播种于MS培养基上，培养在杭州师范大学生命与环境科学院植物学重点实验室组织培养室中，暗培养4天。
25℃光照培养20-30天。
MS培养基pH5.8(5) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30天），取顶芽放于MS+BA0.2mg/L（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养。
(6) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cmX1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3天。
(7) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入侵染液中进行侵染。
侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。
将2ml离心管装满菌液，4000rpm离心5min，用悬菌液清洗两次。
以1:10比例（10ml悬菌液放1管1.5ml菌体）放入悬菌液，加入As25mg/L（40ml 中加40ulAs）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液；(8) 将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；(9) 洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500mg/LCef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30min，后面每次5min，以洗去外植体表面的农杆菌；(10) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA1.0mg/L + Hyg25mg/L + Cef 500mg/L pH5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。
叶盘法转化烟草的原理
叶盘法转化烟草的原理叶盘法是一种生物工程技术，用于转化或改造植物基因组以生产特定物质。
在烟草中应用叶盘法可以用于合成表达外源蛋白、开发抗病毒烟草品种以及烟草遗传改良等领域。
叶盘法的基本原理是利用植物的组织再生能力，通过培养植物的叶片组织培养而成的小体，在适当的培养基组合下，通过添加适当的物质和条件，将目标基因组转化至植物细胞中。
叶盘法的实验流程一般可以分为以下几个步骤：1.植物材料的准备：从健康的烟草植株中采集叶片，并将其洗净，并进行无菌处理以确保实验的纯度。
2.建立愈伤组织：将洗净的叶片剪成小碎片，并将其转移到含有激素和培养基中，利用试管内的适宜条件培养愈伤组织。
这一步是为了为后续基因转化做好基础，并培养植物细胞的再生能力。
3.转化基因：将目标基因或转入质粒经过适当的处理和筛选，将其引入培养的烟草细胞中。
目标基因可以是外源蛋白的编码序列，用于生产特定蛋白质。
转入基因的方法包括生物颗粒轰击、体外基因传递和通过细菌介导的转化等多种方法。
4.培养变性细胞：转入基因的组织在适宜的培养条件下进行培养和筛选，以确保它们能够在细胞内稳定表达目标基因。
同时，还可以使用适当的抗生素来抑制未转化细胞的生长。
5.稳定转化的筛选：利用特定的筛选方法，筛选出稳定表达目标基因的转化细胞。
常用的筛选方法是利用抗生素抗性基因或镰刀形细菌素酶基因，通过添加抗生素或镰刀形细菌素酶底物来诱导或检测转过的细胞。
6.进一步培育和鉴定：将经过筛选的转化细胞进行进一步培养，培育出大量具有目标基因的烟草植株。
同时，对植株进行鉴定和检测，确认目标基因的稳定性和表达水平。
通过以上步骤，叶盘法能够有效地将外源基因导入到烟草植株的基因组中，并使其稳定表达。
通过优化培养条件和基因的筛选方法，可以进一步提高转化效率和稳定性。
叶盘法的优点在于操作简单、转化效率高、转基因植株易于培养和大规模扩繁等。
然而，叶盘法也存在一些局限性，如转化效率和稳定性的波动性、可能引发的遗传不稳定性等问题，需要进一步的优化和改进。
YCT 149-2002 烟草及烟草制品 转基因的测定
打开 一 件 烟叶的一端，分左中右三个部位用长筒状取样器（具尖筒内径 Ｉｃ ｍ）随机取 ３点，该批次 的每件所取的样品用四分法缩分出均匀样品２份（每份 ２５０９）作实验室样品供检验和复检，实验室样品 必须密封并填写标签 ，注明产地 、等级报验号、送样单位、取样人。
双链 ｒ＞Ｎｎ
ＹＣ／Ｔ １４９－２００２
７．３－１．４ ＤＮＡ提取物纯度用 ＯＤ２６０／２８。的值来估算，比值在 １．７－１．９为纯度较好，比值大于 １１９提 取的 ＤＮＡ中含 ＲＮＡ，比值小于 １．７提取液中含一些蛋白质等杂质，要重新提取 ＤＮＡｏ ７．３．２ 硝酸还原酶基因序列 ＰＣＲ扩增
３．１ 实验室空间设计
应在 相 互 隔离的不同实验室进行样品前处理、ＤＮＡ提取、ＰＣＲ反应、试剂配制和凝胶观察等操作， 并定期对实验室进行紫外过夜照射。
３．２ 操作要求 试验 室 台面使用前后利用次抓酸钠擦拭消毒 ；样品研磨在强力通风橱中进行 ；ＰＣＲ反应液加样在
超净工作台内进行；样品准备过程中每个样品操作更换一次塑料手套；样品的称量不可在称量试剂的天 平室内进行，应设专用天平以免污染试剂。 ３．３ 样品皿盆
检测。
８ 转基 因烟叶检测方法
８．１ 共有序列引物的ＰＣＲ检测
８．１．１ 引物设计
用于 转 基 因烟草检测共有标志主要有：花耶菜花叶病毒 ３５Ｓ启动子、根癌农杆菌 ｎｏｓ终止子序列和 编码卡那霉素抗性基因（ＮＰＴＩＤ，根据这些核甘酸序列设计 ＰＣＲ引物进行烟草转基因检测。
７．２．１．３ 取上清液，加１／１。体积的１ｏＸ Ｃ ＴＡＢ提取缓冲液，加人等体积的三抓甲烷／异戊博（体积分 数为２４：１），混匀在 １２０ ００ｒ ／ｍｉｎ下离心４ｍ ｉｎ．