第八章 基因工程菌修改2011 (1)
第八章 基因工程与体外表达 PPT
一、常用的克隆载体 （一）质粒 (plasmid)——存在于细菌染色体
外的小型环状双链DNA分子
特点
能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传
信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
第八章 基因工程与体外表达源自13质粒（plasmid）
在细胞内的复制分两种类型
严密控制型 (stringent control)
松弛控制型 (relaxed control)
❖ 只在细胞周期的一
❖ 在整个细胞周期中
定阶段进行复制
随时都可进行复制
❖ 在细胞内只含 1个
❖ 在细胞内一般在20
或几个
个以上, 甚至多达
第八章 基因工程与体外表达数千个
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克隆载体的的质粒应具备下列特点
Ⅰ型酶具有限制和修饰作用。要求DNA分
子上有特定的识别顺序，并在此识别位点下游
100至1000bp处切割。
Ⅲ型酶与Ⅰ型酶一样，有限制和修饰作用。
但在识别位点附近切割DNA，但切点难以预测。
Ⅱ型酶并不兼有甲基化酶的活性。在DNA
分子内部的识别特异位点并切割双链DNA，切
割为点固定、已知，是基因克隆重常用的工具
的3’-OH上；或进行同聚物加尾。
• Taq DNA聚合酶
第二节 基因克隆的载体
为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达 有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计
的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector)
野生型λ噬菌体为双链线性DNA分子，两端各带12 个碱基的单链粘性末端。基因组分三个区域：左侧 区（含有包壳的病毒颗粒所需的全部基因）、中间 区（非必需区，但包含与重组有关的基因）、右侧 区（包含所有主要调控组分）。 系替换型载体，外源DNA：9 ～ 23kb 常用：EMBL 系列（置换型，适用基因组克隆）
基因工程菌培养 ppt课件
基因工程菌培养
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基因工程菌发酵的设备
气升式发酵罐的优点： 结构简单，不易污染，能耗低，操作简单， 低剪切力, 适合高浓度发酵。 基因工程菌往往对剪切力更为敏感（why？）
基因工程菌培养
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基因工程菌的高密度发酵
在基因工程菌的发酵中，菌体的增殖和产 物的表达都是在对数期内完成的，因此， 发酵工艺的改进就集中在如何延长工程菌 的对数生长时间，缩短衰亡时间
酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提 高。
比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽(ＧＳ Ｈ)时,在发酵开始和进行12ｈ后,各添加2.0ｇ /Ｌ腺苷三磷酸(ＡＴＰ)和9ｍｍｏｌ/Ｌ前 体氨基酸,可以使细胞浓度和ＧＳＨ的产量 分别比不添加这两种物质提高24%和1.4倍
基因工程菌培养
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培养方式
分批补料培养方式 补充营养 稀释代谢产物
基因工程菌培养
基因工程菌培养
1
什么是基因工程菌？
为什么要构建基因工程菌？ 遗传性状的改良 代谢途径的加工 生物反应器
基因工程菌培养
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基因工程菌的构建
宿主菌：大肠杆菌
作为外源基因表达 的宿主,遗传背景清 楚,技术操作简单,培 养条件简单,大规模 发酵经济, 是应用最 广泛,最成功的表达 体系
宿主对质粒稳定的影响 质粒拷贝数 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响 培养条件的影响（培养基，温度，pH等等）
基因工程菌培养
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稳定基因工程菌的措施
改进重组质粒的结构 选择适当宿主 增加外界环境压力 调节培养条件
基因工程菌培养
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施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中
分离与培养耦合 固定化培养技术
固定化技术与连续培养，透析培养相结合 是基因工程菌发酵的发展方向
第八章基因工程与体外表达ppt
第五节 基因的改造 (一 )寡核苷酸介导的定点诱变法的树立 〔二〕含U模板法 〔三〕PCR定点诱变法
寡核苷酸介导的 诱变方法的基本原理：
含U模板法
PCR介导的 定点诱变法
第六节 克隆基因的表达
基因工程的主要目的之一，就是要 制备少量有用的蛋白质和多肽，尤其是人 体蛋白。失掉了克隆的基因或cDNA后， 依照正确的方向拔出表达载体，连在启动 子的前面，导入相应的宿主细胞，即可停 止表达。在不同的表达系统中，其表达方 式不尽相反。
落或噬菌斑中表达，因此可用相应的抗血 清或单克隆抗体，经过放射免疫、化学发 光或显色反响停止挑选。
〔三〕 核酸杂交法 对菌斑的最有效的方法之一，而且这 种挑选不取决于目的基因能否表达。
菌落原位杂交 的原理
〔四〕 PCR技术 PCR技术具有高度的灵敏度和特异
第八章基因工程与体外 表达ppt
2021年7月25日星期日
基因工程是指在体外对DNA分子 依照既定的目的和方案，对DNA停止 剪切和重新衔接，然后把它导入宿主 细胞，从而可以扩增有关DNA片段， 表达有关基因产物，停止DNA序列剖 析，基因治疗，研讨基因表达的调理 因子〔如启动子、增强子等〕，以及 研讨基因的功用等。
有聚合酶活性 有3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 有5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
2. DNA聚合酶Ⅰ大片段 DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of
DNA polymerase I)为DNA聚合酶I用枯草杆菌 蛋白酶(subtilisin)裂解后发生的大片段，这个片 段也称为Klenow片段〔Klenow fragment〕。
第一节 基因工程中的工具酶
一、限制性核酸内切酶〔restriction enzyme〕
基因工程 电子版
作者：吴乃虎出版社：高等教育出版社第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程一、基因操作与基因工程的关系二、基因工程的诞生与发展第二节基因工程是生物科学发展的必然产物一、基因是基因重组的物质基础二、DNA的结构和功能三、基因操作技术的发展促进基因工程的诞生和发展四、基因工程的内容第三节基因的结构——基因操作的理论基础一、基因的结构组成对基因操作的影响二、基因克隆的通用策略第一篇基因操作原理第二章分子克隆工具酶第一节限制性内切酶一、限制与修饰二、限制酶识别的序列三、限制酶产生的末端四、DNA末端长度对限制酶切割的影响五、位点偏爱六、酶切反应条件七、星星活性八、单链DNA的切割九、酶切位点的引入十、影响酶活性的因素十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性第二节甲基化酶一、甲基化酶的种类二、依赖于甲基化的限制系统三、甲基化对限制酶切的影响第三节DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶二、KIenow DNA聚合酶三、T4噬菌体DNA聚合酶四、T7噬菌体DNA聚合酶五、耐热DNA聚合酶六、反转录酶七、末端转移酶第四节其他分子克隆工具酶一、依赖于DNA的RNA聚合酶二、连接酶三、T4多核苷酸激酶四、碱性磷酸酶五、核酸酶六、核酸酶抑制剂七、琼脂糖酶八、DNA结合蛋白九、其他酶第三章分子克隆载体第一节质粒载体一、质粒的基本特性二、标记基因三、质粒载体的种类第二节λ噬菌体载体一、λ噬菌体的分子生物学二、λ噬菌体载体的选择标记……第四章人工染色体载体第五章表达载体第六章基因操作中大分子的分离和分析第七章基因芯片技术第八章PCR技术及其应用第九章DNA序列分析第十章DNA诱变第十一章DNA文库的构建和目的基因的筛选第十二章基因组研究技术第二篇基因工程应用第十三章植物基因工程第十四章动物基因工程第十五章酵母基因工程第十六章细菌基因工程第十七章病毒基因工程第十八章医药基因工程第十九章基因工程产品的安全及其管理第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程一、基因操作与基因工程的关系基因操作（gene manipulation）：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。
第八章植物基因工程总结
农杆菌
Vir 帮助质粒
左 外源基 右 感染植物
进入植物细胞核， 整合，表达
Vir 左 外源基因 右
农杆菌
双元系统的特点
双元系统是穿梭质粒和Ti质粒两个质粒 ，在接合 后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。
穿梭质粒编码植物选择标记、表达信号、多克隆 位点、两个T-DNA
④Ori区(origin of replication，复制起 始区)：Ori区上的基因调控Ti 质粒的自我 复制。
(2). 农杆菌的感染和生存
第一步:植物受伤 乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮诱导Ti
质粒的毒性基因表达。 第二步 感染植物
脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位 第三步 毒性基因（vir）表达 第四步 T-DNA转移
ori
(7) Ti载体的类型
共整合载体（cointegrate vectors） 由比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造 的pGV3850 受体载体，需要同源重组才能插入外源基因。
双元载体（binary vectors） 既有大肠杆菌复制起点也有农杆菌复制起点， 是个穿梭载体。
①pGV3850
外源基因插入pGV3850 的过程
pBR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同 pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得 到抗卡那霉素性状。
外源基因 插入
Kanr pBR322
抗卡那霉素 卡那霉素筛选
转化
的土壤农杆菌 pBR322与 土壤农杆菌 感染 pGV3850重组 含pGV3850
植物组织
物的细胞中 筛选转化细胞，并诱导产生转基因植株 转基因植株大规模种植
三、外源基因导入植物的方法
（一）DNA直接转移法
化学刺激法
8第八章 基因工程与基因体外表达
2019/9/26
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第四节 真核细胞转染
一、真核细胞转染的方法与基本原理
（一）磷酸钙沉淀法（calcium phosphate co-precipitation）
使外源DNA或重组质粒DNA与磷酸钙 混合，形成微小颗粒，并加入到宿主细胞中， 使这些颗粒沉积在细胞表面，以利于宿主细 胞摄取这些颗粒。
对一段特定的DNA而言，识别序列碱基对少的，则 切点数多，产生的片段小；而识别序列碱基对多的， 则切点数少，产生的片段大。
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二、其他常用的工具酶
1. DNA聚合酶Ⅰ (DNA polymerase I)
● 聚合酶活性 ● 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 ● 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
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（二）电穿孔法（electroporation）
将外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯 中，在高频电流的作用下，细胞膜出现许多 小孔，使外源DNA能进入宿主细胞。
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（三）DEAE-葡聚糖（ DEAE-Dextran）法
外源DNA或重组质粒DNA与DEAE葡聚 糖混合，DEAE葡聚糖带有大量正电荷的 化学基团，可与DNA中带负电荷磷酸基团 结合，并粘附于细胞表面，借助细胞内吞 过程促进外源DNA进入细胞。
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基因工程是指在体外对DNA分子按 照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和 重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而 能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产 物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究 基因表达的调节因子，以及研究基因的功 能等。
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第一节 基因克隆的工具酶
第八章 基因重组与基因工程
第八章基因重组与基因工程一、选择题A型题1、由病毒携带、将宿主DNA片段从一个细胞转移至另一个细胞的现象或机制称为A、接合B、转化C、转导D、转染E、转座2、依赖整合酶、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称为A、位点特异性重组B、非位点特异性重组C、同源重组D、随机重组E、人工重组3、基因工程的特点是A、在分子水平上操作，在分子水平上表达B、在分子水平上操作，在细胞水平上表达C、在细胞水平上操作，在分子水平上表达D、在细胞水平上操作，在细胞水平上表达E、在细胞水平上操作，在整体水平上表达4、EcoR I的酶切位点为G▼AATTC，切割后产生的末端突出部分含A、1个核苷酸B、2个核苷酸C、3个核苷酸D、4个核苷酸E、5个核苷酸5、在下列双链DNA序列中不属于完全回文结构的是A、AGAATTCTB、TGAATTCAC、CGTTGCD、GGAATTCCE、AGA TATCT6、“配伍末端”是指A、同一限制性核酸内切酶识别相同的DNA序列，酶切产生的相同类型粘性末端B、不同限制性核酸内切酶识别相同的DNA序列，酶切产生的相同类型钝性末端C、同一限制性核酸内切酶识别不同的DNA序列，酶切产生的不同类型粘性末端D、不同限制性核酸内切酶识别不同的DNA序列，酶切产生的不同类型钝性末端E、不同限制性核酸内切酶识别不同的DNA序列，酶切产生的相同类型粘性末端7、cDNA是指A、细胞或生物体整套遗传信息(染色体和线粒体)的所有DNA序列B、细胞或生物体染色体的整套遗传信息所有DNA序列C、细胞或生物体线粒体的整套遗传信息所有DNA序列D、与细胞或生物体内rRNA互补的单链或双链DNAE、细胞或生物体整套mRNA互补的单链或双链DNA8、用“蓝白选择”筛选、鉴定重组体，所用的半乳糖苷酶的底物是A、X-galB、IPTGC、PEGD、DextranE、Glycerol9、原核细胞表达系统表达产物形成包涵体的主要原因是A、表达产物可溶B、表达产物不溶C、表达产物为融合蛋白D、表达产物不能被糖基化E、表达产物不能形成特定的空间结构10、若真核细胞表达载体含有编码的新霉素磷酸转移酶(neo r)基因，其稳定转染筛选过程所用筛选物为A、X-galB、IPTGC、ampenicillinD、G418E、HypromycinX型题1、自然界的基因转移和重组方式主要有A、接合作用B、转化作用C、转导作用D、转座E、连接2、可用于基因工程的载体为A、质粒DNA B噬菌体DNA C、病毒DNA D、真核细胞染色体DNAE、酵母人工染色体3、在原核生物表达实验中，载体应具备A、可选择的多克隆位点B、3’-端的加尾信号C、适当的启动子D、抗生素抗性基因E、终止信号4、能催化合成探针的工具酶有A、限制性内切酶B、DNA连接酶C、DNA聚合酶ID、反转录酶E、多聚核苷酸激酶5、常用于真核细胞转染的方法有A、磷酸钙转染B、脂质体转染C、电穿孔D、显微注射E、DEAE葡聚糖介导转染二、名词解释1、转化和转导作用(transformation and transduction)2、质粒(plasmid)3、目的基因(target DNA)4、基因组DNA文库和cDNA文库(genomic DNA library and cDNA library )5、多克隆位点(multiple cloning sites)6、感受态细胞(competent cell)7、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)三、问答题1、什么是基因克隆？简述基因工程的基本过程。
分子生物学Chapter8基因工程
Hind III
GTCGAC CAGCTG
BamH I
GGATCC CCTAGG
GTC GAC + CAG CTG
G + GATCC G CCTAG
限制性核酸内切酶 5´-端突出 3´-端突出
5 ' AATTC 3' G 5' G 3' ACGTC
粘性末端
限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。
5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性 在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位
T4-DNA聚合酶
T4-DNA聚合酶
7. 逆转录酶
7.1 逆转录酶的基本特性 (1)以RNA为模板合成cDNA链
8.1 S1核酸酶的基本反应
（1）内切单链DNA或RNA
8.单链核酸内切酶: S1核酸酶
8.1 S1核酸酶的基本反应
（2）内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA
S1核酸酶
8.2 重要用途： S1作图（S1 mapping）
是一种对RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法。 双链DNA变性后，与mRNA杂交，外显子区段与mRNA杂交 形成双链，而DNA的其余部分仍为单链分子。通过电泳，确 定不被降解的DNA片段的大小，即可确定mRNA的末端以及 位于基因内部的内含子的位置。
限制性核酸内切酶
1.4 影响酶切反应的因素
(3)核酸内切酶的缓冲液性质： 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值 等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异 性，即所谓的Star activity（星活性）现象。 EcoR I在正常条件下识别并切割5’ GAATTC3 ’序列，但 在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5’ PuPuATPyPy 3’或5’ AATT 3’。
第八章-基因工程育种
基因工程育种的优势
与传统育种方法不同的是，基因工程育种可以突 破物种间的障碍，实现真正意义上的远缘杂交。而且 这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍，还可实现 动物、植物、微生物之间的杂交。同时，利用基因工 程方法，人们可以“随心所欲”地进行自然演化过程 中不可能发生的新的遗传组合，创造全新的物种。这 是一种自觉的、能像工程一样事先进行设计和控制的 育种技术，是最新、最有前途的育种方法。
3'
+
标记探针
5'
㈢ Taq DNA pol（耐热DNA聚合酶）
作用特点 1） Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度
范围 70 75℃， 2） 95℃以上高温，半小时不失活， 3） 最适合用于聚合酶链反应（PCR）。
三、逆转录酶
特点 逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶 活性：
暗里着
迷
〕 10、我有两个影子，一个在前，一 个在后 。伴我 左右
11、回
忆起绽放的那一个宁夏，仿佛可以触 摸彩虹 。
12、早起的时候发现下雪了，
薄薄的淡淡的，挺美。 13、街灯下的橱窗，有一种落寞的温 暖。
14、我
想未来的 某一天 穿最美的婚纱 嫁最爱的你 15、听说每一个爱向日葵的人，
都能带给人温暖，因为他们心底住着 太阳。
其它特殊性质 的Ⅱ型限制酶
同裂酶（异源同工酶） 同尾酶 可变酶
同裂酶
又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识 别序列。
在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平 头末端，称为同识同切；
大肠杆菌基因工程2011
启动子
启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac上游附近拥有
代谢激活因子（CAP）结合 区，cAMP激活CAP，CAP 结合启动子控制区，进而促 Plac O cAMP 高效转录
CAP
葡萄糖代谢
cAMP浓度降低
基底水平转录
进Plac介导的转录。葡萄糖
代谢使cAMP减少，也能阻 遏Plac介导的转录。因此， 基因工程中使用的乳糖启动
核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的 6-8个核苷酸序列5’ UAAGGAGG 3’，
即 Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基
中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与之专一性结合，将
核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体
上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P
目的基因
cI857 PL B
变基因cI857控制PL。 cI857阻遏蛋
在42℃时失活脱落，PL便可介导 目的基因的表达。但在大型细菌 培养罐中迅速升温非常困难，因 此常使用一个双质粒控制系统， 用色氨酸间接控制目的基因表达 Ptrp A 色氨酸 PL B 表达
终止子
强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑
过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因