第8章 基因工程菌的培养
基因工程菌构建的方法和步骤
基因工程菌构建的方法和步骤哎呀，这可是个大话题啊！基因工程菌构建的方法和步骤，听起来就让人觉得高深莫测。
不过别担心，我这个话痨会尽量用简单易懂的语言来解释清楚的。
咱们就从头开始吧，一步一步地往前走。
我们得知道什么是基因工程菌。
简单来说，就是把一种生物体的基因提取出来，然后放到另一种生物体里，让它变得更强大、更有用。
这样一来，我们就可以生产出更多的药物、食物和其他有用的东西了。
那么，怎么才能构建出一个好的基因工程菌呢？这可是个技术活儿，需要掌握一些基本的方法和步骤。
咱们先来看看第一步：提取基因。
提取基因可不是一件容易的事情。
我们需要从一种生物体中提取出它的DNA,然后把它转移到另一种生物体里。
这个过程叫做转化。
转化的关键在于找到正确的方法和条件，让DNA能够成功地转移到目标生物体里。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因提取出来了。
接下来就是第二步：构建基因表达载体。
构建基因表达载体就是为了把基因放到目标生物体里去。
这个过程叫做克隆。
克隆的关键在于找到正确的方法和条件，让基因能够成功地转移到目标生物体里并且正确地表达出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因表达载体构建好了。
接下来就是第三步：转化目标生物体。
转化目标生物体就是为了把基因表达载体放到目标生物体里去。
这个过程叫做转化。
转化的关键在于找到正确的方法和条件，让基因表达载体能够成功地转移到目标生物体里并且正确地表达出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因表达载体转化到目标生物体里去了。
接下来就是第四步：筛选阳性细胞株。
筛选阳性细胞株就是为了选出那些能够成功表达出我们的基因表达载体的细胞株。
这个过程叫做筛选。
筛选的关键在于找到正确的方法和条件，让阳性细胞株能够被成功地筛选出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地选出了阳性细胞株。
接下来就是第五步：扩大培养规模。
基因工程菌发酵培养的流程
基因工程菌发酵培养的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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1. 菌种复苏和激活，从菌种库中取出保藏的菌种，在无菌条件下培养，激活其生理活性。
基因工程菌的培养
基因工程菌的培养
发酵过程：两种菌的混合物的发酵过程
一．工程菌大规模培养的两个关键
1.工程菌的稳定性
不稳定的原因：质粒的不稳定：质粒的丢失
重组质粒发生DNA片段脱落
表达产物的不稳定
工程菌不稳定的因素：培养基的组成（合成培养基有利于宿主细胞的生长，不利
于外源基因的表达）
培养温度（低温有利于重组质粒的稳定遗传）
菌体的比生长速率
控制基因的过量表达
二、溶氧量
溶氧量过低时，说明葡萄糖过量，此时应降低流加速率；当溶氧量过高时，说明葡萄糖即将耗尽，此时应加大流加速率。
当甲醇流速过快时，溶氧量上升：当甲醇流加速率过慢时，溶氧量降低。
三、毕赤酵母
为甲醇利用型酵母，能以甲醇为唯一碳源和能源生长。
甲醇利用途径的第一个酶为醇氧化酶。
生长在限量甲醇中的细胞能诱导出大量该酶，而生长在甘油、葡萄糖或乙醇中的细胞却不能产生该酶。
因此利用醇氧化酶基因作为启动子来构建表达系统而高效表达外源蛋白。
四、重组毕赤酵母具体方法（三段法）
第一阶段：在甘油或葡萄糖为碳源的合成培养基中进行工程菌的分批培养，以累积菌体细胞。
第二阶段：在限制生长速率下流加甘油或葡萄糖的流加补料培养，以进一步提高菌体量。
第三阶段：即诱导阶段，开始较低速度流加甲醇，以诱导外源蛋白的表达。
（要控制甲醇的流加量，浓度高于5g/L时，将会严重抑制细胞的生长。
最新【微生物工程】第八章_基因工程菌的培养幻灯片课件
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的表现
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种 不稳定性具有下列两种表现形式：
结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表 观生物学功能的丧失
分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸（curing）
格式塔心理学
目录
❖ 第一部分：前言 ❖ 第二部分：格式塔心理学产生背景 ❖ 第三部分：格式塔心理学的主要代表人物 ❖ 第四部分：格式塔学派的研究成果 ❖ 第无部分：对格式塔心理学的评价
一、前言
❖ “格式塔”（Gestalt）一词具有两种涵义。一种涵义是 指形状或形式，亦即物体的性质，例如，用“有角的”或 “对称的”这样一些术语来表示物体的一般性质，以示三 角形（在几何图形中）或时间序列（在曲调中）的一些特 性。在这个意义上说，格式塔意即“形式”。另一种涵义 是指一个具体的实体和它具有一种特殊形状或形式的特征， 例如，“有角的”或“对称的”是指具体的三角形或曲调， 而非第一种涵义那样意指三角形或时间序列的概念，它涉 及物体本身，而不是物体的特殊形式，形式只是物体的属 性之一。
❖ 正式诞生：1912年惠特海默发表《于运动知觉的实验研 究》。
❖ 主要观点：强调经验和行为的整体性，认为整体不等于且 大于部分之和，主张从整体的动力结构观来研究心理现象。
二、格式塔心理学产生背景
1 整体观的思想传统
2
社会历史背景
3
哲学理论背景
4
心理学背景
5
科学背景
三、格式塔心理学的主要代表人物
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
发酵工程第八章基因工程菌发酵
工程菌活化、筛选和保藏方法
• 2. 含质粒大肠杆菌的活化：10ml LB培养基装50ml三角瓶中，灭菌 后接菌种，150rpm,37℃振摇1216小时；
• 3．含质粒大肠杆菌的筛选：：20ml 灭 菌LB培养基装一块平板，加卡那霉素 （1mg/ml）1ml. • 划线接种（上述活化的菌种），37℃倒 置培养12-16小时；
• 4. 含质粒大肠杆菌的增殖培养： 3ml LB液体试管中加入150µl卡那霉 素，挑选单菌落接入， 250rpm,37℃剧烈振摇12-16小时， 供质粒抽提和菌种保藏用。
• 5. 取150µl的培养物入1.5ml微量 离心管中,加850µl灭菌的甘油， 密封管口，放-20℃保藏。
☆
第二节 工程菌的发酵
重组a2b型基因工程干扰素分批式培 养和流加式培养菌体产量及干扰素产 量的比较
方法 分批式 培养温度 pH 培养基 培养时间 菌体湿重 37 7.0 综合 8.5 820 IFN效价 9.7
流加培养 37
7.0
综合
8.5
1512
17.7
3．连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌 培养至一定菌体浓度后，开动进料和出料的 蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培 养。连续培养可为微生物提供恒定的生活环 境，控制其比生长速率，为研究基因工程菌 的发酵动力学，生理生化特性，环境因素对 基因表达的影响等创造了良好条件。
4．透析培养
透析培养是利用膜的半透性原理使代谢产 物和培养基分离，通过去除培养液中的代 谢产物来解除其对生产菌的不利影响。传 统生产外源蛋白的发酵方法，由于乙酸等 代谢副产物的过高积累而限制工程菌的生 长及外源基因的表达，而透析培养解决了 上述问题。
5．固定化培养 基因工程菌培养的一大难题是如何维持 质粒的稳定性。有人将固定化技术应用 到这一领域，发现基因工程菌经固定化 后，质粒稳定性大大提高，便于进行连 续培养，特别是分泌型菌更为有利。因 此基因工程菌固定化培养研究已得到迅 速开展。
简述基因工程菌的培养方式
简述基因工程菌的培养方式基因工程菌是指通过基因工程技术将目标基因导入到细菌中，使其表达目标蛋白或产生目标物质的菌株。
基因工程菌的培养是进行基因工程研究和应用的重要环节之一。
下面将从菌株的选择、培养基的配制、培养条件的控制等方面简述基因工程菌的培养方式。
一、菌株的选择菌株的选择是基因工程菌培养的第一步。
常用的基因工程菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等。
选择菌株时需要考虑其生长速度、基因导入效率、表达目标蛋白的能力等因素。
一般情况下，大肠杆菌是最常用的基因工程菌株，因为其生长速度快、易于培养和转化。
二、培养基的配制培养基是基因工程菌培养的基础，其组成要能满足菌株生长和表达目标蛋白的需要。
一般的培养基包括基础培养基和选择性培养基。
基础培养基是提供菌株生长所需的营养物质，如碳源、氮源、矿物质等。
选择性培养基则是通过添加特定的抗生素或抗性基因使得只有带有目标基因的菌株能够生长和繁殖。
培养基的配制需要根据具体实验的需要和菌株的特性进行调整。
三、培养条件的控制培养条件的控制对于基因工程菌的培养至关重要。
其中包括温度、pH值、气体环境、培养时间等因素的控制。
一般情况下，基因工程菌株的适宜生长温度为37℃，pH值为6.5-7.5。
气体环境方面，大肠杆菌一般需要在含氧的条件下培养，而酵母菌则需要在缺氧条件下培养。
此外，培养时间也需要根据菌株的生长速度和目标蛋白的表达时间进行调整。
四、培养方式的选择基因工程菌的培养方式主要包括液体培养和固体培养两种。
液体培养适用于大规模培养和蛋白表达，可以通过摇瓶培养或发酵罐培养进行。
固体培养适用于筛选和分离菌株，常用的固体培养基有琼脂和琼脂糖。
同时，还可以根据实验需要选择特定的培养方式，如表达载体的选择、诱导剂的添加等。
五、培养监测和收获在培养过程中，需要定期监测菌株的生长情况和目标蛋白的表达情况。
常用的监测手段包括测定菌液的光密度(OD值)、蛋白含量的测定、酶活性的检测等。
生化工程-基因工程菌培养
基因工程菌在生产过程中可能产生变异或逃逸，对环境和人体健康造成潜在威胁。因此，需要加强安全 监管和风险评估。
生物农药
生物农药
基因工程菌可用于生产生物农药，如杀虫剂、杀菌剂等。通过基因工程技术改良微生物， 使其产生具有杀虫、杀菌作用的代谢产物，实现对病虫害的有效防治。
生物农药的优势
生物农药具有环保、安全、可持续等优点，能够减少化学农药的使用，降低对环境的污 染和对人体的危害。
生物农药的挑战
生物农药的作用机制和效果可能受到环境因素的影响，如温度、湿度等，因此在实际应 用中需要加强效果评估和监测。
生物肥料
生物肥料
基因工程菌可用于生产生物肥料，通过改良微生物的代谢 途径，使其产生具有营养价值的代谢产物，如氮、磷、钾 等矿物质元素，为植物提供养分。
生物肥料的优势
生物肥料具有环保、安全、高效等优点，能够提高土壤肥 力和植物生长效率，减少化肥的使用和环境污染。
3
加强下游处理技术的研究
针对基因工程菌产生的难分离纯化的产物，未来 将加强下游处理技术的研究，提高产物的纯度和 收率。
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THANKS
基因工程菌能够高效降解有毒有 害物质或重金属离子，降低对环 境的污染和对生态系统的破坏。
生物环保的挑战
基因工程菌在降解过程中可能产 生变异或逃逸，对环境和人体健 康造成潜在威胁。因此，需要加 强安全监管和风险评估。
04
基因工程菌培养的挑战与前 景
基因工程菌培养的挑战
பைடு நூலகம்
基因工程菌种稳定性问题
培养基优化需求
基因表达技术
基因表达技术是指将重组后的目的基因导入宿主细胞中，并在宿主细胞中进行表达，产生相应的蛋白 质或代谢产物。
基因工程菌培养
（2）基因工程产品大多处于细胞内，提取 前需将细胞破碎，增添了很多困难。而且 发酵液中产物浓度也较稀，杂质又多，加 上一般大分子较小分子不稳定(如对剪切力)， 故提取较困难，常需利用高分辨力的精制 方法，如色层分离等。 （3）基因工程产蛋白提取的要求纯度更高， 对于安全性的要求更为严格。
细胞的破碎
基因工程菌的不稳定性及对策
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组 质粒的不稳定性： 结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、 修饰，降解导致其表观生物学功能的丧失 分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中丢失。 质粒拷贝数的影响
质粒的拷贝数的影响
外源蛋白的合成速率取决于质粒拷贝数， 在高拷贝数下，结构物质如氨基酸的供应 成为限制因素，导致细胞的代谢活力下降， 高生长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性 增加。
蛋白质的浓缩与分离
基因工程菌高密度发酵技术是基因工程技 术生产应用的基础,其产品在化工、食品、 环保、医药等方面都存在极大的潜在能力。 但能否实现高密度培养及高目标产物浓度, 是工程菌能否以较低成本实现规模生产的 决定性因素。因此,必须结合高密度发酵的 各个工艺条件,简化操作工艺,降低工业成本, 最终使目标产物生产的规模化和产业化得 以实现。
企业中进行重组菌培养时的设备标准有LS1和LS-2。LS-2相当严格，工业生产起码应 在LS-1的设备标准下培养。LS-1标准要点是： (1)使用防止重组菌体外漏，能在密闭状态 下进行内部灭菌的培养装置； (2)培养装置的排气由除菌器排出； (3)使用易产气溶胶的设备时，要安装可收 集气溶胶的安全箱等。设计用于基因重组 菌的培养装置时，不仅要考虑外部杂菌的 侵入，还要防止重组菌的外漏。此外，培 养后的菌体分离、破碎等处理也必须在安 全柜内进行，或是采用密闭型的设备。
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