优良醋酸菌的分离纯化
藏灵菇发酵乳中醋酸菌的分离纯化与鉴定
藏灵菇发酵乳中醋酸菌的分离纯化与鉴定曹宜;刘芸;刘波;朱育菁;陈倩倩【摘要】One Acetobacter strain, FJAT-13797, was isolated from Tibetan kefir. The image under scanning electronic microscope showed that the bacterium was rod-shaped with round ends, and presented in single or pairs without spores. The strain showed the bio-chemical properties of Acetobacter spp. The 16S rDNA sequence analysis indicated that the strain, FJAT-13797, belonged to Acetobacter orientalis.%从藏灵菇中分离出醋酸菌株FJAT-13797,利用形态学观察、生理生化和16S rDNA方法对其进行细菌学鉴定,菌体形态为圆端直杆,单个或成对,无芽孢,其生理生化特征与醋杆菌属(Acetobacter)基本一致.经16S rDNA基因序列同源性比较和系统发育分析,菌株FJAT-13797鉴定为东方醋酸菌(Acetobacter orientalis).【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2012(027)012【总页数】4页(P1339-1342)【关键词】藏灵菇;鉴定;醋酸杆菌;东方醋酸菌【作者】曹宜;刘芸;刘波;朱育菁;陈倩倩【作者单位】福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州350003;福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州 350003【正文语种】中文【中图分类】TS252藏灵菇是一种乳白色、胶质状的块状物（由微生物产生的胞外多糖与乳蛋白聚合而成），外形酷似米粒，上面栖息着多种微生物，长期在牛奶中培养，个体会增大很多，形状如盛开的雪莲，有人称之为“西藏雪莲”［1－3］。
醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。
醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。
醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。
黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。
醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。
醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。
醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。
2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。
表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱双目生物显微镜分析天平手提式不锈钢蒸汽灭菌锅超净工作台精密数字式酸度计PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224SDSX-280BSW-CJ-1FDpHS-3C长沙科技科力仪器德国莱卡北京化丰上海南鹏上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。
2.2.2培养基[33-37]表2.2.1.ｂ培养基成分表Tab 2.2.1.ｂMedium composition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然⑸改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5⑺Horyer-Frateur培养基3%pH自然⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%⑾产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%pH自然⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH7.2⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。
醋酸菌菌种分离筛选方法
醋酸菌菌种分离筛选方法醋酸菌是一类常见于自然界中的微生物，主要分布于果酱、蜂蜜、果汁等酸性环境中。
醋酸菌能够利用酒精和氧气生成乙酸作为能量源，在食品加工、饮料发酵以及环境保护中具有重要的应用价值。
为了获得高效的醋酸菌菌种，需要进行菌种的分离筛选。
以下是醋酸菌菌种分离筛选方法的一般步骤：1.样品的收集与处理：从酸性环境中收集样品，如水果糖浆、果酱、蜂蜜等。
样品应保持新鲜，并避免污染。
如果样品是固体的，可以通过混合样品和生理盐水来制备悬浮液。
2.菌落计数：将悬浮液经过适当稀释，并均匀分布在含有固体培养基的琼脂平板上。
用细菌计数板或细胞计数器对菌落进行计数。
选取外形典型的菌落进行进一步的分离。
3.菌种分离：根据菌落形态、色素沉积、生理特性等进行分离。
选取外形典型的菌落，利用无菌环针在无菌琼脂平板上进行涂布。
4.筛选培养基的选择：醋酸菌是革兰氏阴性菌，最适生长温度一般在30-35°C范围内。
常用的筛选培养基包括葡萄糖琼脂葡萄糖琼脂（GAC）和醋酸葡萄糖琼脂（GAA）。
也可以根据菌种特性选择适宜的培养基进行筛选。
5.培养条件控制：将分离出的菌种接种在含有适宜营养物质的筛选培养基上，并控制培养条件。
包括温度、pH值、搅拌速度等。
优化培养条件可以提高菌种的产量和质量。
6.菌种纯化：逐步单菌分离并培养，目的是获得纯种菌株，确保菌株的纯度和稳定性。
7.菌种特性分析：对分离出的菌种进行鉴定和特性分析，包括形态学观察、生理特性鉴定、生化指标检测和分子生物学方法确定其种属和亲缘关系等。
总结：醋酸菌菌种的分离筛选是一个多步骤的过程，需要进行样品收集、菌落计数、菌种分离、筛选培养基的选择、培养条件控制、菌种纯化以及菌种的特性分析。
通过这些步骤的实施，可以获得高效的醋酸菌菌种，为醋酸菌的应用提供有力的支持。
醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究
第2章醋酸菌的分离鉴定和发酵条件研究2.1引言醋酸菌包括醋酸杆菌属和醋酸单胞菌属[30]，又名醋酸细菌。
醋酸菌的细胞一般为杆状、直或者稍弯，也有少部分像椭圆形，由单个、成对或者成链状排列的，大小一般在0.6～0.8×1.0～3.0 μm。
醋酸菌没有芽胞是革兰氏阴性菌，它有的细胞是周生鞭毛种类，一般在液面上生长会形成较厚的菌膜。
黑色醋酸杆菌等为另一些种类的醋酸菌细胞是端生鞭毛。
醋酸菌的分布广泛，在未灭菌的醋、啤酒、黄酒中果酒，以及在果园的土壤中、葡萄或酸败食物表面中都有生长[31]。
醋酸菌是酿醋过程中不可缺少的。
醋酸菌在发酵过程中，会产生大量的醋酸和其他有机酸，而且还有醇类[32]。
本章节研究醋酸菌的分离鉴定和发酵条件，通过平板分离、革兰氏染色、产醋酸实验，并经生理生化鉴定和查阅伯杰氏手册，做出进一步鉴定。
2.2实验材料与方法2.2.1材料与仪器分离样品：取自湖北某果醋厂发酵的醋醅。
试验主要仪器设备型号及产地如表2.2.1.a。
表2.2.1.a主要仪器设备Tab 2.2.1.a Main instrument equipment主要仪器型号厂家生化培养箱双目生物显微镜分析天平手提式不锈钢蒸汽灭菌锅超净工作台精密数字式酸度计PYX-250S-ABME（BA/E3）BS224SDSX-280BSW-CJ-1FDpHS-3C长沙科技科力仪器德国莱卡北京化丰上海南鹏上海科技试验试剂：葡萄糖、酵母膏、甘油、无水乙醇(95%)、CaCO3、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeCl3、乙酸钙、乳酸钙、浓硫酸均为分析纯；琼脂食用级。
2.2.2培养基[33-37]表2.2.1.ｂ培养基成分表Tab 2.2.1.ｂMedium composition名称葡萄糖酵母膏无水乙醇(v/v)琼脂CaCO3备注⑴基础发酵培养基1%1%3%pH 4. 5⑵分离培养1%1%3%2%2%pH自然⑶斜面保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑷液体保藏培养基1%1%1%pH自然⑸改进后的斜面液体保藏培养基1%1%3%2%1%pH自然⑹发酵培养基1%1%7%pH 4. 5⑺Horyer-Frateur培养基3%pH自然⑻GYC培养基10%5%2% 2. 5%pH自然⑼高糖培养基30%1%2%2%pH自然⑽生酮培养基3%2%甘油3%⑾产5-酮基葡萄糖酸盐培养基3%1%2%2%pH自然⑿氧化乙酸培养基1% 1% 2% 乙酸钙1% pH7.2⒀氧化乳酸培养基1% 1% 2% 乳酸钙2% pH7.0-7.2⒁乙醇培养基1% 3% 2% pH自然注：培养基⑸在斜面保藏培养基⑵上，30℃培养24 h，加入无菌碳酸钙，灌入并液体培养基到斜面上，至离管口2cm处，密封冷藏；培养基⑺其他成分有(NH4)2SO40.1%，K2HPO40.1%，KH2PO40. 01%，0.025%，FeCl30. 0005%；以上培养基均以121℃灭菌20 min。
一株番茄表面着生醋酸菌的分离鉴定及产酸条件优化
产酸能力、代谢中间产物耐受力及副产物种类及
醋便是其中的代表产品之一ꎮ 与传统食醋相比ꎬ
的微生物ꎬ目前已分离得到的醋酸菌大多归于醋
果醋口感更好ꎬ种类更为丰富且可以直接饮用ꎬ因
而具有广阔的市场前景 [８￣１０] ꎮ 目前果醋的生产主
要以不同水果为原料ꎬ以醋酸菌为发酵菌株进行
含量等ꎬ往往是决定产品产量、风味及品质的重要
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ｔｈｅ ｍａｉｎ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ ｓｕｃｒｏｓｅ ａｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅꎬ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｃｉｄ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ＢＱ￣１ ｗａｓ １８.２３ ｇＬ －１ . Ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｉｔｓ
Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
ＺＨＯＮＧ Ｃａｉｘｉａ １ ꎬ ＴＩＡＮ Ｊｉａｘｕｅ ２ ꎬ ＷＡＮＧ Ｘｉａｏｑｉ ２ ꎬ ＷＥＮ Ｔｏｎｇ ２∗
. １.Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
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微生物实验设计-醋酸菌
微生物实验设计-醋酸菌实验设计：醋酸菌的分离与纯化——生物科学2班秦琬莹辛吉瑀张博文一、实验目的学习醋酸菌的分离纯化、鉴定的原理。
掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。
二.实验原理1.菌种的分离纯化从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
2.接种操作方法涂布平板法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
3. 结晶紫结晶紫是一种碱性染料，也一种极佳的精密酸指示剂，pH 0.5(绿)～2.0(蓝)~弱酸（蓝紫）~中性（紫色）~碱性（赭红色）；所以在醋酸菌分离纯化平板培养基中加入少量的结晶紫溶液，既不会影响醋酸菌的生长，又可根据变色圈的大小很快把产酸高的醋酸菌株分离出来。
二、材料、用品1.样品：食醋2.培养基：（1）分离纯化平板培养基葡萄糖1 g，酵母膏1 g，碳酸钙2 g，琼脂2g，水100mL，121℃灭菌20min，冷却至70℃加入4mL无水乙醇和0.5mL 0.02％结晶紫冰醋酸溶液。
（2）液态发酵培养基葡萄糖l g，酵母膏1.5 g，磷酸二氢钾0.05 g，硫酸镁0.05 g，水100 mL，pH6.5，灭菌后冷却至60 ℃以下加入无水乙醇3.5mL。
3.器材：接种环、冰箱、试管、培养皿、无菌玻璃涂棒、移液管、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅等。
醋酸菌菌种分离筛选方法
醋酸菌菌种分离筛选方法醋酸菌菌种分离筛选方法醋酸菌的细胞为椭圆至杆状，单个成双或成链，鞭毛周生或端生，运动或不运动，革兰氏阴性菌，好氧菌，一般在乙醇或其他可氧化物的酵母煮液或酵母消化液培养基生长旺盛。
醋酸的钠盐和钙盐与三氯化铁共热，生成红褐色沉淀，原液变成无色。
可进行分离菌鉴别。
1.培养基：1.1米曲汁乙醇碳酸钙培养基：米曲汁（10-12BX）1000ml CaCO310-15g 95℅乙醇30-40ml（灭菌后加入） PH自然1.2葡萄糖碳酸钙培养基：葡萄糖15g/L 酵母膏10g/L CaCO3 15g/L PH 6.81.3乙醇30mL/L 酵母膏10g/L葡萄糖10g/L CaCO3 10-15g/L（常规筛选培养基） PH 6.8-7.0注：常规培养基中的碳酸钙易沉淀，平板不易观察到透明圈，选择米曲汁乙醇碳酸钙培养基为好。
1.4醋酸菌保存培养基：酵母膏15g/L葡萄糖10g/L CaCO3 15-20g/L 琼脂15-20 g/L 3-4滴乙醇/试管。
1.5液体种子和发酵培养基：乙醇30-35mL/L 膏酵母10g/葡萄糖10g/L KH2PO40.5g/L MgSO40.5g/L PH 6.5-6.82.菌种筛选：2.1集菌：1-2g（5ml）样品，在无菌下加入30-50ml/250ml米曲汁乙醇液体培养基（0.5ml 0.02℅结晶紫醋酸溶液/100ml培养液）中，30-33℃震荡培养24-48h，集菌液PH明显下降，有醋味，镜检细胞革兰氏染色阴性。
形态与醋酸菌相符即可分离。
2.2混菌法分离：（分离及初筛）适度稀释10-5、10-6、10-7 取1.0ml菌液置于无菌平板或涂布中，每个梯度平行两次，米曲汁乙醇碳酸钙培养基倒平板，30℃ 24-48h，观察有小菌落出现，菌落周围形成透明圈，圈的大小因菌而异。
挑透明圈出现早且菌落丰厚，边缘整齐，生长旺盛不同的菌落转接于曲汁乙醇碳酸钙斜面，30-33℃ 24-48h。
优良醋酸菌的分离纯化
衰１结晶紫溶液的呈色情况裹
Ｔ＿ｂｋｌ ｍ衄棚ｍＩ雌ｃ山ｒ酣瑚岫乜ｂｋ ０ｆ霉即廿蚰ｖ｜ｏｍ 帅●Ⅱ廿ＯⅡ０ｆ血ｅ ｍ嘲Ⅱｌ－ｅｄ ｍ日怔咖
式中，ｖ——发酵液样品滴定耗用的ＮａＯＨ量 （ｍＬ）；
ｖｒ—－以空白培养基为对照滴定耗用的ＮａＯＨ量 （ｍＬ）；
３０气、转速为１６０州ｎ恒温摇床培养。于不同的培养
加入无水乙醇３．５ ｍＬｏ
时间，取上述发酵液测其产酸量。
１．３方法 １．３．１醋酸菌分离纯化流程帅
１．３．６大米糖化液中的产酸试验 方法同１．３．３，种子液不变，用取自味莼园酒精度
样品一醋酸菌发酵液中富集培养一稀释分离一纯 ６．３１４％（ｖ，ｖ）大米糖化液代替其液体发酵培养基。
Ｏ．ｏ卜消耗１ ｃＭ广一ＮａＯＨ标准溶液浓度（ｍｏｌ∞； ｍＬ ０．１ｍｏｌ，Ｌ Ｎａ０Ｈ溶液相当于乙 酸的质量（ｇ）； １００盼——转化为百分含量的系数。 １．３．３分离纯化
被捌物质的酸碱性 Ａｃｉｄｉｔｙ跚ｄ正ｋａｌｉｎ奸
极强酸性Ｇ嘲婶８眦ｌＩＥ【ＩｌｅＩｌｅｄ们ｉｄ灯
强中酸强性酸ｓｈ性龃ｓ时吨ｈｃ∞ｎｅｄｉ日ｄ畸ｃｉｄｉ婶
１６０“ｌＩｌｉｎ恒温摇床培养４８ ｈ。以６％的接种量接人盛
１．２．４液体种子及发酵培养基目
有５０ｍＬ液态发酵培养基的２５０ｍＬ三角瓶中（每个
葡萄糖ｌ ｇ，酵母膏１．５ ｇ，磷酸二氢钾０．０５ ｇ，硫酸 镁０．０５ ｇ，水１００ ｍＬ，ｐＨ６．５，灭菌后冷却至６０ ｔ以下
样做３个平行），接种时需充分振荡，以使菌液均匀，
4.期刊论文 周秉辰.ZHOU Bingchen 食醋生产中醋酸菌乙醇脱氢酶的活性与产酸速率关系的研究 -中国酿造
2009,""(11)
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革状凝胶膜产生。所以 Ａ１．１ 在液态淋浇食醋生产中具
有良好的应用前景。
图 １ 显微镜下 Ａ１．１ 平板单菌落 Ｆｉｇ．１ Ａ１．１ ｐｌａｔｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｌｏｎｙ ｕｎｄｅｒ ｍｉｃｒ ｏｓｃｏｐｅ
２．２ 液体发酵培养基和大米糖化液中的产酸试验 Ａ１．１ 在液体发酵培养基和大米糖化液中的产酸 曲
加入无水乙醇 ３．５ ｍＬ。
时间， 取上述发酵液测其产酸量。
１．３ 方法
１．３．６ 大米糖化液中的产酸试验
１．３．１ 醋酸菌分离纯化流程［６－７］
方 法 同 １．３．３， 种 子 液 不 变 ， 用 取 自 味 莼 园 酒 精 度
样品→醋酸菌发酵液中富集培养→稀释分离→纯 ６．３１４ ％（ ｖ／ｖ） 大米糖化液代替其液体发酵培养基。
４．苏州民惠食品有限公司， 江苏 苏州 ２１５１２４）
摘 要 ： 取贵州省贵阳市味莼园食品有限公司未灭菌的液态淋浇食醋， 经分离纯化得到一株 Ａ１．１ 优良醋酸菌。Ａ１．１ 在 醋酸菌液体发酵培养基和味莼园酒精度 ６．３１４ ％（ ｖ／ｖ） 大米糖化液中产酸均良好， 且在两种培养液中均没有皮革状凝 胶膜产生， Ａ１．１ 在液态淋浇食醋生产中具有良好的应用前景。 关键词： 食醋； 醋酸菌； 分离纯化
酵 母 膏 １ ｇ， 葡 萄 糖 １ ｇ， ｐＨ４．５， 水 １００ ｍＬ， １２１ ℃ 液 态 发 酵 培 养 基 的 ２５０ ｍＬ 三 角 瓶 中 ， ３０ ℃、 转 速 为
灭菌 ２０ ｍｉｎ， 使用前加入 ３ ｍＬ 无水乙醇。
１６０ ｒ／ｍｉｎ 恒温摇床培养 ４８ ｈ。以 ６ ％的接种量接入盛
ａｎｄ Ｂｅｈａｖｉｏｒ，１９８９，３３：８９９－ ９０２
ｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ［Ｊ］．ＤｒｕｇｓＡｇ－
［４］ Ｎｅｉｌ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
醋在人们日常饮食调味中具有相当重要的作用。 据不完全统计， 目前我国食醋的年产量约为 ２００ 万 ｔ￣ ２５０ 万 （ｔ 以 ３．５ ％ ＨＡｃ 计） ［１］， 可见， 醋在我国调味品市 场占有重要地位。
食醋生产在我国具有悠久的历史。酿造食醋不仅 是人们喜爱的一种调味品， 而且兼具很多的医疗和保 健功效。现代医学表明， 食醋对于高血压、糖尿病、软化
ＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＳＵＰＥＲ ＡＣＥＴＯＢＡＣＴＥＲ ＺＨＡＮＧ Ｙｏｎｇ－ ｆｅｎｇ１， ＬＵ Ｈｏｎｇ－ ｍｅｉ１， ＺＨＡＮＧ Ｆｅｎｇ－ ｊｕａｎ２， ＨＥ Ｘｕ－ ｘｉａｏ３， ＤＥＮＧ Ｚｈｅｎ－ ｋｕｎ４ （ １．Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００３， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ， Ｈｅｎａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ； ３．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００３， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ； ４． Ｔｈｅ Ｐｅｏｐｌｅ Ｆａｖｏｒ Ｆｏｏｄ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｃｏｍｐａｎｙ ｏｆ Ｓｕ２ ｄ 左右。重复上述操作， 直至平板出
１．１ 分离样品
现单菌落。挑取变色透明圈直径大， 菌落丰厚， 且占生
贵州省贵阳市味莼园食品有限公司未灭菌的液态 长优势的单菌落进行纯化。将纯化后的菌株接种于斜
淋浇食醋。
面保藏培养基上， ３０ ℃培养 ４８ ｈ 后保藏于 ４ ℃冰箱内。
Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ ， １９９４， ７７（２）：１３５－ １４０
ｄｒａｗａｌｉｎ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｉｎｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒａｔ ［Ｊ］． Ｐｈａｒｍａ ｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
［２］ Ｒａｉｎｓ Ｃ， Ｂｒｙｓｏｎ Ｈ Ｍ． Ｔｏｐｉｃａｌ ｃａｐｓａｉｃｉｎ： ａ ｒｅｖｉｅｗｏｆ ｉｔｓ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉ－
１．２ 主要培养基
１．３．４ 醋酸的定性测试［９－ １０］
１．２．１ 分离纯化平板培养基［３－４］
将上述斜面菌种接种于基础培养基中， ３０ ℃恒温
葡萄糖 １ ｇ， 酵母膏 １ ｇ， 碳酸钙 ２ ｇ， 琼脂 ２ ｇ， 水 培养箱静置浅层培养 ７２ ｈ 后， 离心除去醋酸菌发酵液
１００ ｍＬ， １２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎ， 冷却至 ７０ ℃加入 ４ ｍＬ 无 中 的 菌 体 ， 取 ５ ｍＬ 以 ２．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 溶 液 中 和 至
ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒ ｅｄ ｍａｔｅｒ ｉａｌ
被测物质的酸碱性
结晶紫溶液呈色
（ｍＬ）； Ｖ０— ——以空白培养基为对照滴定耗用的 ＮａＯＨ 量
（ｍＬ）； ＣＮａＯＨ— ——ＮａＯＨ 标准溶液浓度（ｍｏｌ／Ｌ）； ０．０６— ——消耗 １ ｍＬ ０．１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 溶液相当于乙
醋酸菌是决定食醋产量和质量的主要菌种。由于 产膜杂菌的污染， 在贵州省贵阳市味莼园食品有限公 司液态淋浇食醋长期的生产中， 发酵塔内形成一层皮 革状凝胶膜， 影响空气流动和醋液的淋浇回流， 使醋酸 产量明显降低， 甚至醋酸发酵因缺氧而受阻， 生产无法
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Ｔｈｅ ａｓｓｕｍｉｎｇ ｃｏｌｏｒ ｏｆ ｇｅｎｔｉａｎ ｖｉｏｌｅｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ 黄色 绿色 蓝色 蓝紫色 紫色 赭红色沉淀
所以在醋酸菌分离纯化平板培养基中加入少量的 结晶紫溶液， 既不会影响醋酸菌的生长， 又可根据变色 圈的大小很快把产酸高的醋酸菌株分离出来。
定， 挑出酸度上升平稳、快且高的富 集培养液， 取 ｌ ｍＬ
酸的质量（ ｇ） ； １００ ％— ——转化为百分含量的系数。
１．３．３ 分离纯化 取味莼园未灭菌液态淋浇食醋， 以 １０ ％量接入醋
酸菌液态发酵培养基富集培养。同时进行产酸量的测
Ａｃｉｄｉｔｙ ａｎｄ ａｌｋａｌｉｎｉｔｙ
极强酸性 Ｇｒｅａｔｔｙ ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｅｄ ａｃｉｄｉｔｙ 强酸性 Ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｅｄ ａｃｉｄｉｔｙ 中强酸性 Ｓｔｒｏｎｇ ａｃｉｄｉｔｙ 弱酸性 Ｌｏｗ ａｃｉｄｉｔｙ 中性 Ｎｅｕｔｒａｌｉｔｙ 碱性 Ａｌｋａｌｉｎｉｔｙ
化→斜面试管保藏→产醋酸定性测试→产醋酸速率的
测试
２ 结果与讨论
１．３．２ 产酸量的测定方法［８］
２．１ 醋酸菌的分离纯化
取 １ ｍＬ 发 酵 液 ， 加 入 １０ ｍＬ 蒸 馏 水 ， ３ 滴 ～５ 滴
结晶紫是一种极佳的精密酸指示剂， 结晶紫溶液
０．０２ ％酚酞酒精溶液， 用标定的 ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 溶液 的呈色情况见表 １。
ｉｎｇ，１９９５，７（４）：３１７－ ３２８
ｏｆ ｃａｐｓａｉｃｉｎ ［Ｊ］． Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ， １９７７，２５（６）：１４１９
［３］ Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｇ Ｓｈａｒｐｅ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ ａｎｄ ｃａｐｓａｉｃｉｎ ｍｏｄｉｆｙ ｏｐｉｏｄ ｗｉｔｈ－
收稿日期： ２００７－ ０３－ ２０
１．２．４ 液体种子及发酵培养基［５］
有 ５０ ｍＬ 液态发酵培养基的 ２５０ ｍＬ 三角 瓶 中 （ 每 个
葡萄糖 １ ｇ， 酵母膏 １．５ ｇ， 磷酸二氢钾 ０．０５ ｇ， 硫酸 样 做 ３ 个 平 行） ， 接 种 时 需 充 分 振 荡 ， 以 使 菌 液 均 匀 ，
镁 ０．０５ ｇ， 水 １００ ｍＬ， ｐＨ６．５， 灭 菌 后 冷 却 至 ６０ ℃以 下 ３０ ℃、转速为 １６０ ｒ／ｍｉｎ 恒温摇床培养。于不同的培养
水乙醇和 ０．５ ｍＬ ０．０２ ％结晶紫冰醋酸溶液。 １．２．２ 斜面试管保藏培养基
ｐＨ７．０， 加 入 ５ ％ＦｅＣ１３ 溶 液 ５ 滴 ～６ 滴 ， 形 成 红 褐 色 沉 淀者为醋酸菌。
除不加结晶紫溶液外， 其他同分离平板培养基。
１．３．５ 液体发酵培养基中的产酸试验
１．２．３ 基础培养基
取 三 环 上 述 活 化 好 的 斜 面 菌 种 接 入 盛 有 ５０ ｍＬ
滴定至浅粉色。由所耗的 ＮａＯＨ 溶液的量来计算样品 中的含酸量（以醋酸计）。
产酸量（ ％） ＝（ Ｖ－ Ｖ０） ×ＣＮａＯＨ×０．０６×１００ ％ 式 中 ， Ｖ— ——发 酵 液 样 品 滴 定 耗 用 的 ＮａＯＨ 量
表 １ 结晶紫溶液的呈色情况表 Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ａｓｓｕｍｉｎｇ ｃｏｌｏｒ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ｔａｂｌｅ ｏｆ ｇｅｎｔｉａｎ ｖｉｏｌｅｔ
Ｓｕｚｈｏｕ ２１５１２４， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｔｏｏｋ ｔｈｅ ｎｏｎ － ａｎｔｉｓｅｐｔｉｃ ｗａｓｈ ｖｉｎｅｇａｒ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｓｔｅ ｃｈｕｎ ｇａｒｄｅｎ ｆｏｏｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｃｏｍｐａｎｙ ｏｆ Ｇｕｉｙａｎｇ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ｏｂｔａｉｎｅｄ ｓｕｐｅｒ ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ａ１．１ ａｆｔｅｒ ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｎｇ． Ａ１．１ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｃｅ－ ｔｏｂａｃｔｅｒ ｌｉｑｕｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｌｉｑｕｏｒ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ６．３１４ ％ （ｖ／ｖ） ｒｉｃｅ ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｓｔｅ ｃｈｕｎ ｇａｒｄｅｎ ｔｏ ｂｅ ｇｏｏｄ， ａｎｄ ｈａｖｄ ｎｏｔ ｔｈｅ ｌｅａｔｈｅｒ ｓｈａｐｅ ｉｎ ｔｈｉｓ ｔｗｏ ｋｉｎｄ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｆｌｕｉｄｓ． Ａ１．１ ｈａｓ ｇｏｏｄ ａｐｐｌｉｃａ－ ｔｉｏｎ ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｉｎ ｔｈｅ ｗａｓｈ ｖｉｎｅｇａｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｖｉｎｅｇａｒ； ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ； ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ