桑叶不同提取部位对_葡萄糖苷酶抑制活性体外研究_唐明敏

基金项目：国家自然科学基金（81374027）作者简介：唐明敏（1992－），女，在读硕士，研究方向：多成分药物代谢与新药研发。

通信作者：赵保胜，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药药效与物质基础研究，E-mail ：zhaobs1973@163．com 。

桑叶不同提取部位对α-葡萄糖苷酶抑制活性体外研究唐明敏1，刘洋1，田思敏1，马晓云1，隗丽1，程笑1，赵保胜2（1北京中医药大学中药学院，北京100102；2北京中医药大学科研实验中心，北京100029）摘要：目的建立体外α-葡萄糖苷酶抑制活性评价体系，观察桑叶不同提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。

方法经大鼠小肠获得α-葡萄糖苷酶，以4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG ）为底物，以阿卡波糖（Acarbose ）为阳性对照，测定桑叶水提液（WE ）、水提上清液（AP-A ）、水提沉淀（AP-P ）及75%乙醇提取液（EE ）对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用。

结果桑叶不同提取液均有α-葡萄糖苷酶抑制活性，不同提取液的半数抑制浓度（IC 50）分别是WE ：0．08g /L ；AP-A ：0．17g /L ；AP-P ：0．42g /L ；EE ：0．12g /L ；桑叶提取液α-葡萄糖苷酶抑制活性强弱顺序为：WE ＞AP-A ＞EE ＞AP-P ，其中WE IC 50小于Acarbose （0．11g /L ）。

结论桑叶水提液抑制α-葡萄糖苷酶活性作用最强，为桑叶在该机制发挥降糖作用的主要活性部位，体外α-葡萄糖苷酶活性抑制评价体系可作为该药效成分筛选平台。

关键词：桑叶；α-葡萄糖苷酶抑制剂；1-脱氧野尻霉素DNJ ；半数抑制浓度IC 50中图分类号：Ｒ963文献标识码：A 文章编号：1009-5551（2015）06-0711-04doi ：10．3969/j．issn．1009-5551．2015．06．012α-glucosidase inhibition by different extracts of folium mori in vitro assay TANG Mingmin 1，LIU Yang 1，TIAN Simin 1，MA Xiaoyun 1，YU Li 1，CHENG Xiao 1，ZHAO Baosheng 2（1College of Chinese Materia Medica ，Beijing University of Chinese Medicine ，Beijing 100102，China ；2Center of Scientific Experiment ，Beijing University of Chinese Medicine ，Beijing 100029，China ）Abstract ：Objective To establish α-glucosidase inhibitory activity evaluation in vitro system ，and study the activ-ity of α-glucosidase inhibitation of different mulberry extracts．Methods The experiment was carried out with 4-ni-tro phenol-α-D-glucopyranoside （pNPG ）as substrate to measure water extract of mulberry leaves （WE ），water ex-traction supernatant （AP-A ），precipitation （AP-P ）and 75%ethanol extract （EE ）for the inhibitory activity of α-glucosidase obtained from small intestine in rats．Ｒesults All mulberry leaves extracts have α-glucosidase inhibi-tory activity ，and the concentrations of IC 50of the extracts are as follows ：WE ：0．09g /L ；AP-A ：0．18g /L ；AP-P ：0．40g /L ；EE ：0．25g /L ；that is ，WE ＞AP-A ＞EE ＞AP-P ，where IC 50of WE was less than Acarbose （0．16g /L ）．Conclusion The water extraction of mulberry leaf has the strongest α-glucosidase inhibition activity whichplays the role on the mechanism of hypoglycemic as principal components．The evaluation system of α-glucosidaseinhibition activity in vitro provided a platform for screening the compounds of α-glucosidase inhibition．Key words ：Mulberry leaves ；α-glucosidase inhibitors ；DNJ ；IC 50α-葡萄糖苷酶为小肠黏膜二糖酶的一种类型，绝大部分附着于小肠绒毛刷状缘的粘膜表面，小肠绒毛两侧酶的活性最高［1］。

为了降低餐后血糖，避免葡萄糖稳态异常，从而降低糖尿病、肥胖病、高脂血症（Ⅳ型）等疾病的微血管并发症及心血管疾病的发作风险，20世纪70年代后期研发出了α-葡萄第38卷第6期新疆医科大学学报Vol．38No．62015年6月Journal of Xinjiang Medical University Jun．2015糖苷酶抑制剂，如拜糖平等［2］，其作用机制为竞争性的抑制α-葡萄糖苷酶，从而减缓碳水化合物降解为单糖的速度，降低餐后血糖水平。

研究表明，桑叶具有显著的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中1-脱氧野尻霉素（DNJ）为主要活性成分，该化合物为生物碱类化合物，可在水提液中富集［3］。

此外，桑叶中多糖类［4］、黄酮类［5］也显示有α-葡萄糖苷酶抑制活性。

近年来，结合色谱、质谱、核磁等技术从桑叶中筛选了一部分α-葡萄糖苷酶抑制剂单体，如氧化白藜芦醇、黄芪苷、芦丁等［6］。

本实验建立了α-葡萄糖苷酶体外反应体系，对桑叶不同处理方式获得的提取部位的体外α-葡萄糖苷酶抑制活性进行了评价，为后续活性成分筛选研究提供参考。

1材料与方法1．1材料桑叶药材购买于北京仟草中药饮片有限公司；拜糖平，拜耳医药保健有限公司生产。

对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷（pNPG），对硝基苯酚，购买于江莱生物有限公司；血清清蛋白（BSA）、HEPES，购买于Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1．2仪器酶标仪（Multiskan Ascent美国Thermo 公司），电动玻璃匀浆机（DY89-Ⅱ宁波新芝生物科技股份有限公司生产），混合器（QL-866浙江海门市其林贝尔仪器厂），离心机（1-15PK德国Sigma公司），真空干燥箱（DZ-2BC南京远拓科学仪器有限公司），智能溶出仪（ZＲS-8G天津大学无线电厂），电子天平（BSA124S赛多利斯科学仪器有限公司）。

1．3实验动物SPF级SD大鼠，雄性，体质量280 300g，由斯贝福（北京）实验技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2011-0004。

动物饲养于北京中医药大学实验动物部标准屏障环境内，许可证号：SYXK（京）2011-0024，自由饮食，明暗节律12h/ 12h。

1．4方法1．4．1桑叶不同提取物制备30g桑叶药材，加12倍量水浸泡30min，加热回流90min，过滤，滤渣加10倍量水回流60min后，过滤，合并两次滤液，得桑叶总水提物（WE）；取部分水提液浓缩，加入95%乙醇至含醇量为60%，静置24h以上，3000r/ min，离心15min，取上清液回收乙醇至无醇味，得桑叶水提上清液部位（AP-A）；沉淀为桑叶水提沉淀部位（AP-P）；桑叶药材加75%乙醇，方法同WE回流提取得桑叶醇提物（EE）。

1．4．2大鼠小肠α-葡萄糖苷酶制备雄性大鼠，禁食12h，麻醉，腹主动脉取血致死，取胃幽门以下小肠约15cm，预冷的生理盐水冲洗2次，刮取黏膜层，按1ʒ10比例加入0．5mol/L NaCl-KCl溶液，匀浆。

于4ħ，10000r/min，离心30min，弃上清液，沉淀用预冷的生理盐水洗冲2次，4ħ，10000r/min，离心30min，最后沉淀按体积1ʒ5用生理盐水稀释后，于4ħ，500r/min，离心10min，取上清液，考马斯亮蓝法测定上清液蛋白含量，－20ħ保存备用［7－9］。

1．4．3α-葡萄糖苷酶反应体系优化［10］1．4．3．1对硝基酚浓度-吸光度标准曲线分别吸取浓度为2mmol/L的对硝基苯酚20、40、80、120、160、200、240μL，并分别加入400μL Na2CO3及一定体积67mmol/L磷酸缓冲液至总体积为750μL，样品溶液置于96孔板中，405nm处测定吸光度。

以对硝基苯酚浓度为横坐标，405nm处吸光度为纵坐标，作标准曲线。

1．4．3．2蛋白浓度-酶活力标准曲线取10mmol/L 对-硝基苯酚-α-吡喃葡萄糖苷（pNPG）底物溶液50μL，分别加入不同浓度的大鼠小肠粘膜α-糖苷酶提取液50μL（0．21、0．42、0．62、0．83、1．03、1．65mg/mL），反应30min，405nm处测定吸光度值，计算α-葡萄糖苷酶活力，观察酶浓度对酶活力的影响。

1．4．3．3底物浓度-酶活力曲线在体系中加入50μL酶液（0．62mg/mL），并加入不同体积pNPG，使底物终浓度为0．33、0．83、1．67、2．08、2．92、3．75、5．00、6．67、8．33、10．00mmol/L，观察不同底物浓度对酶活力的影响，Lineweaver-Burk作图法计算该酶的Km。

1．4．4桑叶提取物体外α-葡萄糖苷酶抑制试验取50μL肠提取液加入67mmol/L磷酸盐缓冲液（pH6．8），37ħ水浴温孵10min，加入桑叶提取物饱和5min后再加入100μL pNPG（10mmol/L），体系总体积为350μL，水浴30min后，加入0．1mol/LNa2CO3400μL终止反应。