分子生物学实验

分子生物学实验

1. 幸免长时刻的培养，大肠杆菌一样培养12个小时就能够挑取克隆子进行验证了。

要紧是因为培养时刻过长，专门是含有Amp抗性的质粒。重组菌能够分泌酶降解Amp，造成平板中局部Amp浓度太低。其他未重组菌在A mp存在的情形下只是生长受抑制而非死亡，当Amp浓度降低时就能够生长了。卫星菌落，由于阳性菌落大量分解抗生素，造成周围区域抗生素浓度降低，则无抗性的菌也生长出来了。一句话，你的板子培养时刻过长了。这是amp抗性质粒特有的卫星菌落，确实是又抗性的E col分泌beta 内酰胺酶分解周围的amp，从而使没有抗性的e coli生长。

2.3. 乙醇能够排除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来。Na＋之类的平稳离子能够与这些带电基团结合，在沉淀形成部位降低多核苷酸链之间的排斥作用。因此只有在阳离子的量足以中和暴露的磷酸残基的电荷时才会发生乙醇沉淀。1.什么原因用无水乙醇沉淀DNA？

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是能够任意比和水相混溶，乙醇与核酸可不能起任何化学反应，对DNA专门安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳固存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一样实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。然而加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA缺失也增大，专门用多次乙醇沉淀时，就会阻碍收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也能够用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一样在室温下放置15－30分钟即可。

2.在用乙醇沉淀DNA时，什么原因一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？

在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的N aAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，如此就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其成效也不行。在沉淀的DNA 中，由于过多的盐杂质存在，阻碍DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是能够任意比和水相混溶，乙醇与核酸可不能起任何化学反应，对DNA专门安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳固存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一样实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。然而加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA缺失也增大，专门用多次乙醇沉淀时，就会阻碍收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也能够用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一样在室温下放置15－30分钟即可。1。DNA不溶于乙醇

2。乙醇能够吸附水分子（极性相同），使得溶液中相对的水分子减少，增大了DNA在水中的相对浓度。

3。附：乙醇沉淀DNA需要盐离子，用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷，降低DNA分子间的斥力，才能沉淀完全。

4. 溶菌酶是一种碱性球蛋白，分子中碱性氨基酸、酰胺残基和芳香族氨，酸的比例较高，酶的活动中心是天冬氨酸和谷氨酸。

溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，称包胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它专一地作用于肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与N -乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键，从而破坏细菌的细胞壁，使之松驰而

失去对细胞的爱护作用，最终使细菌溶解死亡。也能够直截了当破坏革兰氏阳性菌的细胞壁，而达到杀菌的作用，这要紧是因为革兰氏阳性细菌的细胞壁要紧是由胞壁质和磷酸质组成，其中胞壁质是由杂多糖和多肽组成的糖蛋白，这种多糖正是由N-乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4键联结的。对某些革兰氏阴性菌，如埃希氏大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，也会受到溶菌酶的破坏。溶菌酶是母乳中能爱护婴儿免遭病毒感染的一种有效成分，它能通过消化道而保持其活性状态，溶菌酶还能够使婴儿肠道中大肠杆菌减少，促进双歧杆菌的增加，还能够促进蛋白质的消化吸取

5. 酚、氯仿是变性蛋白质的（由于苯酚能溶进少量水缺失DNA，因此与氯仿一起使用，减少DNA缺失）

异戊醇是消泡剂（蛋白质变性中常常产动气泡，会缺失DNA，因此需消泡）抽提DNA去除蛋白质时，如何样使用酚与氯仿较好？酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。通过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而缺失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚成效好，但氯仿与水不相混溶，可不能带走DNA。因此在抽提过程中，混合使用酚与氯仿成效最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，现在一起将酚带走。也能够在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。

10．什么原因用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合平均，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产动气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，因此能减少抽提过程中的泡沫产生。一样采纳氯仿与异戊酵为24：1