miR181b影响ApoE——小鼠动脉粥样硬化形成的自噬调节机制

miR181b影响ApoE—/—小鼠动脉粥样硬化形成的自噬调节机制作者：董轶杨绍南潘旭东马爱军李舒裴浩天来源：《青岛大学学报（医学版）》2018年第02期[摘要]目的探讨微小RNA 181b（miR181b）是否通过调节自噬相关靶蛋白参与动脉粥样硬化发展。

方法通过颈总动脉套环诱导ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块形成。

通过尾静脉注射miR181b 慢病毒载体构建其过表达（miR181bOE）及低表达（miR181bKD）模型。

检测血浆中脂质水平，苏木精伊红染色对动脉粥样硬化斑块大小和体积进行定量，Western Blot检测自噬相关蛋白的表达。

结果各组ApoE-/-小鼠血浆中总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇水平均无显著差异（P>0.05）。

MiR181bKD和miR181bOE分别显著减少和增加颈动脉斑块面积和体积（F=118.95～322.03，P结论抑制miR181b可能通过下调p70S6K表达增加自噬活性，延缓颈动脉粥样硬化斑块的形成。

[关键词]动脉粥样硬化；微RNAs；自噬体；核糖体蛋白质S6激酶类，70kDa[中图分类号]R743.1；R543.5[文献标志码]A[文章编号] 20965532（2018）02014406动脉粥样硬化已经成为威胁人类健康的最危险的疾病之一，颈动脉是多发部位[12]。

颈动脉狭窄是缺血性卒中的危险因素，可导致高达10%～20%的卒中或短暂性脑缺血发作[3]。

研究认为，动脉粥样硬化是一种炎癥性疾病，其起始和发展与大动脉和中动脉内膜中的胆固醇积累有关[4]。

但是，目前动脉粥样硬化的病理生理机制还不完全清楚，新的治疗方法和生物标志物都需进一步阐明。

自噬是一种高度保守过程，细胞质内的物质均可通过溶酶体依赖途径降解[56]。

最近的证据表明，动脉粥样硬化斑块中的自噬标志物的表达可在低密度脂蛋白、炎症和代谢应激等内在刺激下被相应上调。

值得注意的是，前期研究表明自噬也会被其他信号因子调控。

其中，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）被认为在自噬诱导的负性调节中发挥重要作用[5，7]。

核糖体蛋白质S6激酶类70kDa（p70S6K）作为mTOR主要下游效应物，参与了细胞生长、细胞存活和凋亡相关分子mRNA翻译过程[89]。

自噬活性与mTOR/p70S6k信号通路密切相关[1011]。

文献报道，微小RNA 320a（miR320a）、miR155、miR143/145和miR92a与动脉粥样硬化斑块形成关系密切[1217]。

miR181b的表达水平在经肿瘤坏死因子α（TNFα）处理或喂食高脂肪饮食的小鼠主动脉内膜中下调。

脂质体包裹miR181b靶向基因转染可以模拟ApoE-/-小鼠，抑制核因子κB（NFκB）活化，NFκB反应性促炎基因表达、白细胞积聚和动脉粥样硬化病变形成[1824]。

目前还不清楚miR181b是否可以通过mTOR信号通路调节自噬活性。

本研究的目的是通过miR181b过表达和低表达来研究动脉粥样硬化斑块和自噬的相关性。

1材料和方法1.1动物与试剂1.1.1动物及分组取雄性6周龄的ApoE-/-小鼠40只（C57BL/6小鼠，北京华阜康生物科技股份有限公司），喂饲高脂肪饮食（含质量分数为0.002 5的胆固醇和0.150 0的脂肪，北京华阜康生物科技股份有限公司）。

所有小鼠饲养在青岛大学中心实验室内，室温为22～24 ℃，明暗照明周期为12 h12 h，动物自由饮食。

ApoE-/-小鼠在手术和整个实验开始前2周开始高脂肪饮食。

按照文献报道的方法[2526]，在高脂肪饮食喂养后2周颈总动脉套环诱导斑块形成。

在病变发展的8周过程中，小鼠每周3次经尾静脉注射生理盐水（对照）或miR181b慢病毒载体。

小鼠在8周龄随机被分为4组（每组10只），分别是对照组（A组，高脂饮食+假手术+10 μL生理盐水）、模型组（B组，高脂饮食+手术+10 μL生理盐水）、miR181b过表达组（OE组（C组），高脂饮食+手术+10 μL miR181bLV，每只鼠滴定至2×107 TU）和miR181b 低表达组（KD组（D组），高脂饮食+手术+10 μL miR181bRNAiLV，每只鼠滴定至2×107 TU）。

动物实验的所有执行程序均按照ARRIVE指南。

1.1.2试剂及来源蛋白质提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），抗p70S6K抗体（Cell Signaling，2708），抗pp70S6K抗体（abcam，ab131436），抗LC3Ⅱ（abcam，ab48394），抗GAPDH（北京康为世纪生物科技有限公司），miR181bshRNA的慢病毒载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司。

1.2测试指标与方法1.2.1血脂分析8周后处死小鼠并从股动脉处采血，离心后收集血清。

通过日本希森美康XS500i全自动血液分析仪分别检测总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）的含量。

1.2.2组织学和透射电子显微镜检查颈动脉用40 g/L多聚甲醛固定12 h，用于石蜡包埋。

颈动脉石蜡切片用苏木精伊红（HE）染色观察形态学变化。

选取从颈动脉近心端至远端连续切片中的5个视野进行分析。

电镜样品先用30 g/L戊二醛固定，然后固定于10 g/L四氧化锇中，在二甲胂酸钠缓冲液中洗涤，用梯度乙醇脱水，再置换为环氧丙烷，并应用Epon812环氧树脂包埋。

切成半薄片（1 μm）用亚甲基蓝染色，然后用光镜（Olympus，日本）定位观察。

超薄切片用柠檬酸铅盐和乙酸双氧铀染色，最后在JEM1400电子显微镜（JEOL，日本）下观察。

采用EM相机特征图像系统（830.10U3 CCD Gatan，美国）拍摄透射电镜图像。

1.2.3蛋白免疫印迹将颈动脉保存在液氮中并储存在-80 ℃冰箱中。

样品被均质化，蛋白质通过RIPA裂解缓冲液提取，蛋白质浓度通过BCA法定量。

将等量蛋白质（20 μg）上样，并通过150 g/L十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE电泳）。

然后，将蛋白转移并固定到聚偏二氟乙烯膜上（PVDF膜，Millipore，美国）。

使用体积分数0.05的脱脂牛奶将膜在室温下封闭2 h，然后在4 ℃下用一抗（1∶1 000）孵育过夜。

次日，将膜与相应辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（1∶5 000）（北京康为世纪生物科技有限公司）在室温下孵育1 h。

采用GE Image Quant LAS 4000mini超灵敏化学发光成像仪显影，并用Image Pro Plus软件对吸光度进行测定。

以管家蛋白GAPDH（上海碧云天生物科技有限公司）作为内参蛋白。

1.3统计学方法应用SPSS 21.0统计软件进行处理。

计量数据用[AKx-D]±s形式表示，多组之间的比较用单因素方差分析法（ANOVA）进行分析，多重比较采用LSD、SNK、Tukey等方法。

以P2结果2.1miR181b对小鼠血浆脂质水平的影响与对照组相比较，模型组、miR181bOE组以及2.2MiR181b对小鼠动脉粥样硬化斑块形成影响与模型组相比较，miR181bKD组中斑块最大狭窄部位面积和斑块体积显著减小（F=118.95～302.43，P2.3MiR181b对小鼠动脉粥样硬化斑块中自噬体形成影响透射电镜观察结果表明，对照组动脉粥样硬化斑块中无自噬空泡聚集，可见少量脂滴；而模型组动脉粥样硬化斑块中自噬空泡和脂滴较对照组增多；miR181bOE组小鼠动脉粥样硬化斑块中自噬体较模型组显著减少；而miR181bKD组动脉粥样硬化斑块中自噬体显著高于模型组，而且可见大量自噬溶酶体。

见图2。

以上结果提示，miR181b可能通过自噬途径影响小鼠动脉粥样硬化的形成。

2.4MiR181b对小鼠动脉粥样硬化斑块中LC3Ⅱ蛋白表达影响蛋白印迹检测结果显示，与模型组相比，miR181bKD组中自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达水平显著增加，而miR181bOE组LC3Ⅱ表达被抑制（F=107.38～376.53，P2.5miR181b对小鼠动脉粥样硬化斑块中pp70S6K和p70S6K蛋白表达影响与模型组相比较，miR181bOE组小鼠的pp70S6K/p70S6K明显升高，但miR181bKD组的pp70S6K/p70S6K明显降低，差异均有统计学意义（F=117.33～398.13，P3讨论本研究采用ApoE-/-小鼠颈动脉套管术和高脂饮食建立动脉粥样硬化动物模型，结果显示，下调miR181b可以抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的形成，而过表达可促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成。

在miR181bOE组LC3Ⅱ表达下调、p70S6K表达上调、自噬被抑制，而miR181bKD组LC3Ⅱ表达上调、p70S6K表达下调、自噬增强。

抑制miR181b表达可能通过抑制p70S6K表达增强自噬，延缓颈动脉粥样硬化斑块的形成。

miRNA是一组长度19～25 bp、高度保守的非编码小RNA，通过碱基互补或部分碱基互补与靶基因mRNA结合，降解mRNA或抑制其翻译，在转录后水平调节基因表达。

近年来的研究结果表明，miRNAs在动脉粥样硬化斑块进展中发挥重要作用[13]；miR155在ApoE-/-小鼠主動脉中表达上调，敲除miR155可抑制动脉粥样硬化斑块形成。

miR143/145在调控血管平滑肌细胞表型转换中发挥重要作用。

研究还发现，Ldlr-/-小鼠敲除miR143/145后动脉粥样硬化斑块体积显著减小[14]。

既往的研究表明，促炎刺激和高脂肪饮食可抑制小鼠主动脉组织中miR181b表达[21]。

同时，炎症疾病病人循环miR181水平有所下降，包括脓毒症和冠状动脉疾病[21，24]。

然而，没有研究直接评估miR181b水平在动脉粥样硬化过程中的作用。

本研究中，通过在ApoE-/-小鼠尾静脉中注射miR181b慢病毒载体构建miR181b过表达和低表达模型，并进一步评价其生物学功能。

与模型组比较，miR181bOE组颈动脉斑块面积和体积明显增高，相反，miR181bKD组斑块形成明显减轻。

因此，我们的研究结果表明，miR181b过表达加重动脉粥样硬化斑块形成，而miR181b下调则延迟动脉粥样硬化斑块的进展。

自噬是一种用以维持细胞基础代谢稳定的自我平衡机制，是一种依赖细胞自身溶酶体的降解途径。

近年来发现，自噬与动脉粥样硬化的进展关系密切。

据报道，动脉粥样硬化早期自噬即可活化，以保护巨噬细胞免受氧化损伤，以及对过量蛋白质和受损细胞器进行降解[27]。

在巨噬泡沫细胞中，自噬参与将胆固醇和脂肪滴转运到溶酶体中去[2728]。