葡聚糖酶酶活测定
β-1,3 葡聚糖酶(β-1,3-GA活性检测试剂盒说明书__可见分光光度法UPLC-MS-4216

β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)活性检测试剂盒说明书可见分光光度法:UPLC-MS-4216:50T/24S试剂名称规格保存条件提取液液体50mL×1瓶2-8℃保存试剂一粉剂×2支2-8℃保存试剂二液体42mL×1瓶2-8℃保存标准品粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制:1.试剂一:临用前取1支加1.6mL蒸馏水溶解,用不完的试剂2-8℃保存4周;2.标准品:10mg无水葡萄糖。
临用前加入1mL蒸馏水溶解,配制成10mg/mL葡萄糖溶液备用,2-8℃保存2周。
β-1,3-GA(EC3.2.1.73)主要存在植物中,催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。
在植物染病或处于其他逆境条件下,可诱导细胞大量合成β-1,3-GA,因此β-1,3-GA活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。
β-1,3-GA水解昆布多糖,内切β-1,3-葡萄糖苷键,产生还原末端,通过测定还原糖生成速率,来计算其酶活性。
Fucoidanβ-1,3-GA Reducing SugarReducing Sugar+3,5-Dinitrosalicylic Acid3-Amino-5-Nitrosalicylate(540nm)注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、超声破碎仪、冰和蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。
12000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2.细菌或细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率200w超声3s,间隔10s,重复30次);12000g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
β-葡聚糖酶活性测定

β-葡聚糖酶活性测定β-葡聚糖是由葡萄糖单体通过β-1,3和β-1,4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物,它主要存在于单子叶禾本科谷实中的糊粉层和胚乳细胞壁中。
β-葡聚糖酶属于水解酶类,能有效地降解β-葡聚糖分子中的β-1,3和β-1,4糖苷键,使之降解为小分子。
由于在饲料中,大麦的β-葡聚糖含量较高,难以被单胃动物消化利用,而且对饲料中各种养分的消化利用具有明显的干扰和抑制作用,成为麦类饲料中的抗营养因子。
在饲料中添加β-葡聚糖酶,能有效地消除β-葡聚糖的抗营养作用,促进饲料中各种养分的消化和吸收利用,增进畜禽健康。
在啤酒生产中,添加β-葡聚糖酶可以加快麦汁和啤酒的过滤速度、提高麦汁得率、增加可发酵糖的含量。
此外,β-葡聚糖酶在造纸工业、日化工业等其它许多方面也有着广泛的应用,对β-葡聚糖酶的研究将越来越受到人们的重视。
β-葡聚糖酶活力的测定方法主要有3种:还原糖测定法(分光光度法)、粘度测定法和底物染色法。
其中还原糖测定法简便实用,比较准确,而且结果重复性好,是广泛使用的一种酶活测定方法。
其原理是:β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖,其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应,显色的深浅与还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比,因此,可以利用比色测定反应液的吸光度值来计算还原糖的生成量,从而得出β-葡聚糖酶的活力。
但在该测定方法的具体操作中存在一些影响酶活力测定结果的因素,本文即对还原糖法测定β-葡聚糖酶活力的几个重要影响因素进行研究,并得出最佳测定条件。
1 材料与方法1.1 菌株与培养基1.1.1 发酵产酶菌株黑曲霉(Aspergillus niger)A47菌株,由本实验室保藏。
1.1.2 固态发酵培养基麸皮70 g、米糠27 g、NH4NO3 2.95 g、微量元素液0.05 ml、蒸馏水100ml,pH值5.0,121 ℃灭菌20 min。
酶活力测定方法

蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。
纤维素酶DNS酶活力测定方法DNS, 活力, 纤维素酶, 测定1 定义1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下,每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位,以u/g表示。
2 原理纤维素酶分解纤维素,产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖,纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3,5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物,利用比色法测定其还原物生成量,表示酶的活力。
3.试剂和溶液3.1 1%葡萄糖标准溶液(同β-葡聚糖酶酶活测定)3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液取1g羧甲基纤维素钠(粘度300~600厘泊),加入pH4.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M 盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤,此溶液在4℃冰箱贮存,有效期3天。
取滤液100ml,20ml,蒸馏水40ml,混匀,贮冰箱备用。
3.3 DNS 试剂(同β-葡聚糖酶酶活测定)4仪器和设备4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃)4.2分光光度计含10mm比色皿,可在550nm处测量吸光度。
5测定步骤5.1 标准曲线绘制分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中,用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。
各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中,加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml,于沸水浴中沸腾7min,取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。
冷却后,用10mm比色皿,在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。
以吸光度为纵坐标,相对应的葡萄糖浓度为横坐标,绘制标准曲线或计算回归方程。
基因工程菌EGs2产β-葡聚糖酶条件优化及产酶特性

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(4):708~712*基金项目: 国家自然科学基金 (No.20276064) 资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.教授, 博导, 主要从事食品微生物相关的研究。
Email:<gqhe@>. 收稿日期:20061225 接受日期: 20070316 ·研究论文· 基因工程菌 产 茁 葡聚糖酶条件优化及产酶特性 *李青青 1 , 陈启和 1 , 蒋孝燕 1, 张秀艳 2 , 李 婷 1 , 何国庆 1 ** (1.浙江大学食品科学与营养系, 杭州 310029; 2.华中农业大学食品安全与微生物学系, 武汉 430070)摘要: 用乳清粉作为主要培养基组成, 采用正交试验对大肠杆菌 ( ) 重组菌 的发酵条件进行了优化,并 对粗酶液的酶学性质进行了研究。
重组菌 的最佳发酵条件为: 摇床转速 170r/min , 接种量 1%, 发酵培养基初始 pH 6.0,种龄12h 。
重组菌茁 葡聚糖酶的表达与菌体生长呈正相关, 发酵 14h 后, 菌体生物量最高可达1.71g/L , 茁 葡聚糖酶活力最高可达 321.56U/mL 。
所得粗酶液的最适反应温度 60 ℃,pH 6.0, 在 70 ℃以下保温20min 后, 残余酶活力均在 80%以上。
在pH 5.0~9.0放置48h 后仍能保持均90%以上的残余酶活力。
关键词: 茁 葡聚糖酶;重组菌 EGs2; 发酵条件; 酶学性质 中图分类号: S182 文献标识码:A 文章编号:10061304(2007)04070805Optimization of Recombinant Fermentation ConditionAffecting 茁glucanase Production and Its Characteristics of Enzyme LI Qingqing 1 ,CHEN Qihe 1 ,JIANG Xiaoyan 1 ,ZHANG Xiuyan 2 ,LI Ting 1 ,HE Guoqing 1**The fermentation conditions of mutant obtained from directed evolution for thermostable 茁glucanase for 茁glucanase production were investigated by orthogonal experiment.Fermentation was conducted in 250mL flask,each containing 30mL of medium contained whey 10g/L,yeast extract 5g/L,NaCl 10g/L,the temperature was 37 ℃.The optima culture conditions were as following:initial pH 6.0,shaking speed 170r/min,inoculation volume 1%and inoculation time 12h. 茁 glucanase production by mutantwas associated with cell growth and biomass. 茁glucanase activity was increased significantly when cells entered growth phase.The bacterium began the stable phase after cultured for 14h with the highest biomass 1.71g/L and 茁glucanase activity 321.56U/mL.When 茁 glucanase was used as a substrate,the optimum temperature and pH were 60 ℃ and 6.0,respectively. After 20min incubation at 40,50,55,60,65and 70 ℃ respectively,the residual activity remained at least 80%.After 48h conserva tion at pH 5.0~9.0,the residual activity remained at least 90%.The enzyme was stable below 70 ℃ and at pH 5.0~9.0.茁glucanase;mutant ;fermentation condition;enzyme characteristic茁1,31,4 葡聚糖酶是重要的工业用酶。
病原菌细胞壁诱导下球毛壳菌葡聚糖酶活测定及抑菌试验

pat a oe e a s b th ny eat ie eed fr t T ep一1 3一g cns ci t w s i icn l t gnclw l , u ee zm ci t s r iee . h np h l l t vi w f n , l a aeat i a g f a t u vy sni —
a d P.g i a moeefciey n r e r f t l .C a tmim lbs m o l rd c 一1 3 一gu a a eu d rid cin w t i s e v h eo u go ou c ud po u e B , lc n s n e n u t i s o h x
0 6 f r 1 a s i d ci n wi ) iua i r e elw l ,w i h ci i e r e p cie y mu h lw r . 1 at d y n u t t P , c lra g  ̄ a c l al U e 1 o h r s h l t e a t t swee r s e t l c o e e vi v
显 。在 6种植 物病 原真 菌细胞壁 诱 导下 , 球毛 壳 菌可产生 B一13一葡聚糖 酶 , , 但是 产 酶规律 不 同。
在稻 瘟病 菌 、 立枯 丝核 菌和 尖孢 镰 刀 茵细胞 壁诱 导 下 , B一1 3一葡聚 糖 酶 活要 明 显 高 于杨树 烂 皮 ,
病菌、 核盘 茵和 叶枯 茵。其 中 , 稻 瘟病 茵 细胞壁诱 导 l 在 1 d后 , 酶活 达到最 高 , 0 6 而杨树 烂 为 . 1U; 皮病 菌和 叶枯 茵细胞壁 的诱 导产酶 效果 最差。球毛 壳 菌可作 为生物防 治真 菌。 关 键词 : 毛 壳菌 ; 球 生物 防 治 ; B一13一葡聚糖酶 , 中图分类 号 :7 3 1 ¥6.5 文献标 识码 : A 文章编号 :0 3— 19 2 1 ) 3— 0 0— 4 10 7 7 (0 0 0 0 5 0
β-葡聚糖测定方法

β-葡聚糖酶活力测定方法(NY/T911-2004)∙ 1.原理β-葡聚糖酶能将木聚糖降解成还原性糖。
还原性糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应显色反应。
反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。
因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。
∙ 2. 操作∙ 2.1.标准葡萄糖曲线的制作2.1.1 吸取PH5.5的0.1M乙酸-乙酸钠+缓冲溶液4.0mL,加入DNS试剂5.0mL,沸水浴加热5min。
用自来水冷却至室温,用水定容至25.0mL,制成标准空白样。
2.1.2 分别吸取葡萄糖溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL,分别用PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液定容至100mL,配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg、0.60mg/mL和0.70mg/mL葡萄糖标准溶液。
2.1.3 分别取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL(做两个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2.0mL缓冲液94.4)和5.0mLDNS试剂。
电磁振荡3s-5s,沸水浴加热5min。
然后用自来水冷却到室温,在用水定溶液至25mL。
以标准空白为对照调零,在540min处测定吸光度A值。
以葡萄糖糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴,绘制标准曲线。
每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线∙ 3. 酶样测定吸取10.0mLβ-葡聚糖溶液,37℃平衡20min。
吸取10.0经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min。
∙吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mLDNS试剂,电磁振荡3s-5s。
然后加入8.0g/lβ-葡聚糖溶液2.0ml,37℃保温30min,沸水浴加热5min。
SOD酶活力测定实验

摘要:通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶,经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程,除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白,采用葡聚糖(Sephadex G-100)凝胶层析得到纯化的SOD酶。
跟踪提纯过程活性的分布,并评价提取过程各步骤的效率。
实验结果证实随着不断的分离提纯,总活力以及总蛋白不断减小,比活力不断上升,最终得到的结果为总纯化倍数为0.68,活性得率为5.24%。
一、前言:超氧化物歧化酶简称SOD,是一种新型酶制剂,属金属酶。
分布很广,几乎从哺乳动物到细菌,以及植物中均存在。
在微生物中主存于需氧菌。
SOD是催化超氧阴离子(O2-)歧化反应的酶类,能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基(O2.-),生成H2O2和O2.H2O2由过氧化氢酶(CAT)催化生成H2O 和O2,从而减少自由基对有机体的毒害。
它的存在与生物体内的解毒作用有关,也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。
自1968 年发现SOD 后,立刻引起科学界的高度重视,近40 年来这方面的研究进展非常迅速,它的应用领域日益拓宽,SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶,其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质,证明它无毒,无抗原性,能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。
二十世纪80 年代后期,我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点,如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。
SOD作为治因而受到医药界的关注。
目前中国国内已进入临床试验阶段。
本实验以绿豆为原料提取SOD,通过各步的分离提纯,应测得酶总活力逐渐减小,比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程,以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。
二、实验材料与方法:<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.<二>试剂:葡聚糖(sephadexG-100), NaCl(AP), 磷酸氢二钠(AP), 磷酸二氢钠(AP), 三羟甲基氨基甲烷(Tris), 盐酸(浓盐酸),硫酸铵(AP), PEG6000 ,考马斯亮蓝G250 , 磷酸,乙醇(95%),牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶(sigma公司)。
饲用木聚糖酶、β—葡聚糖酶活力测定方法的调研

前 言
饲 用 酶 制 剂 在 畜 牧业 上 的广 泛 应 用 使 酶 质
量 的度量 问题 显得 格 外 重要 。酶 活 的测 定方 法 和 酶活 的定 义 密 切相 关 。 为 了适 应 市 场 的需求 ,酶
件 做 了许 多试 验 。B dod 19 ) 不 同酶 种在 不 efr(9 1对
维普资讯
< 料 角 20 年 5 饲 广 } 2 第1期 0
斟 技 钡 野
饲用 木聚糖 酶 、 一葡 聚糖 酶活力 测定 方法昀 调研 1 3
王在 贵 - 张 宏福 何瑞 国 -
(- 中国农业科 学院畜牧研究 所 ; 华 中农业 大学动物科技学 院) z
学 者 的认 可 。 3 酶 底 物 的选 择 及底 物 浓 度 .
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缓 冲 液 及 其 浓 度 的 选 择 对 反 应 体 系 的 离 子 强
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传 :1) 1 4 真 (0 2 2 1 0 67 0
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科 技 钡 野
由表 2可 知 ,国内外 各单 位对 酶 活 测定 的温 度 一 般 都选 在 4 %或 5 ℃ , 0 O 由于动 物 消 化道 的温 度接 近 4 ℃ ,所 以在 4 ℃ 条件 下 测 定酶 的 活性 , 0 0 比较 接 近 酶 的生 物学 活 性 。这 一观 点 已得 到许 多
p 53 p 4 5 H . ,H . p 4 6,H . ,H . p 4 8 H . p 5 0 p 7 2,H .
测定方法 的条件都 未统 一 , 酶活测定方法 的统一存在 一定
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八、Beta—葡聚糖酶活力的测定方法
1 方法:3,5—二硝基水杨酸比色法,简称DNS法。
2 原理:
还原糖能将3,5—二硝基水杨酸分子中的硝基还原成橙黄色的3—胺基5—硝基水杨酸。
溶液橙黄色强度与还原糖量成正比。
3. 主要仪器和设备
天平(感量1mg和0.1mg两种),离心机,恒温水浴锅,磁力搅拌器,分光光度计(722型,符合GB9721的有关规定)。
4. 试剂和溶液
4.1 所用水除特别要求外,均为符合GB/6682—1992规定的三级水, 化学药品除特别要求外,均为分析纯。
4.2 DNS试剂
称取3,5—二硝基水杨酸10g加入500 ml水中,分多次加入氢氧化钠16g,搅拌溶解(温度<45℃),再分多次加入酒石酸钾钠300g,搅拌至全溶,冷却后用水定容至1000ml。
室温下棕色瓶储存暗处放置,一周后使用(如有沉淀过滤后使用)。
4.3 0.1mol/L,pH
5.0醋酸—醋酸钠缓冲液
吸取冰醋酸1.8ml于烧杯中,加适量水,加醋酸钠5.78g,溶解, 定容至1000ml,调节PH至5.00±0.01后使用。
室温下存放2个月有效。
4.4 0.1%即1mg/ml葡萄糖溶液
无水葡萄糖于80℃烘至恒重,称取0.1000g于烧杯中,加适量水溶解,转入容量瓶中并定容至100ml。
4.5 0.5%β—葡聚糖溶液
称取β—葡聚糖0.50g于烧杯中,加入适量缓冲液,在沸水浴中搅拌加热溶解后,转入容量瓶中,用缓冲液(4.3)定容至100 ml,置2—8℃冰箱中备用。
有效期三天。
4.6 葡萄糖标准曲线的绘制
吸取1mg/ml无水葡萄糖溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml于试管中,补水至2ml,加DNS试剂3ml,混合后于沸水中煮10min,冷却后定容至15ml,于分光光度计540nm波长下测吸光度(A)。
以吸光度为纵坐标,葡萄糖量为横坐标,绘制标准曲线,三次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y=ax﹢b,求出吸光度与葡萄糖量的关系。
5. 待测酶样品的处理
5.1 液体酶:直接吸取酶液做适当稀释,使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。
5.2 液体曲:离心上清液做适当稀释,使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。
5.3 固体曲:按干重计称取4g于三角瓶中,加水200ml,室温下磁力搅拌浸提
0.5h。
取离心上清液做适当稀释。
5.4 固体粉状酶:称取适量于烧杯中(精确至0.0001g),用少量水润湿并调成糊状,再用水溶解,离心上清液做适当稀释。
5.5 固体粒状酶:研磨成粉后如5.3处理。
6酶活力测定
取15 ml具塞刻度试管按下面的反应顺序进行操作,在反应过程中,从加入底物(吸取前摇匀) (4.5)开始,向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致, 50℃水解10 min.
7酶活力单位计算
酶活力=(S×D×1000)/(0.2×10)×4 µg/ml(g).min
式中:
S—测得光吸收在标准曲线上对应的葡萄糖量,mg数;
D—酶液或酶粉稀释倍数;
1000— mg和µg之间的换算系数;
0.2—测定所取酶液量,ml数;
10—反应时间,min数;
4—方法换算系数。
8酶活力单位定义及换算
8.1 本方法酶活定义:在本测定条件下,每分钟水解β—葡聚糖产生1µg还原糖(以葡萄糖计)所需酶量定义为一个酶活力单位(u)。
国际酶活单位的定义:在测定条件下,每分钟水解β—葡聚糖产生1µmol还原糖(以葡萄糖计)所需酶量定义为一个酶活力单位(IU)。
8.2 u与国际单位IU 的换算关系:
1 u=1÷180 IU(µmol糖/ml(g).min)
180: 葡萄糖的分子量
注:β—葡聚糖为中国食品发酵研究院产品。