葡聚糖酶酶活测定

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β-1,3 葡聚糖酶(β-1,3-GA活性检测试剂盒说明书__可见分光光度法UPLC-MS-4216

β-1,3 葡聚糖酶(β-1,3-GA活性检测试剂盒说明书__可见分光光度法UPLC-MS-4216

β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)活性检测试剂盒说明书可见分光光度法:UPLC-MS-4216:50T/24S试剂名称规格保存条件提取液液体50mL×1瓶2-8℃保存试剂一粉剂×2支2-8℃保存试剂二液体42mL×1瓶2-8℃保存标准品粉剂×1支2-8℃保存溶液的配制:1.试剂一:临用前取1支加1.6mL蒸馏水溶解,用不完的试剂2-8℃保存4周;2.标准品:10mg无水葡萄糖。

临用前加入1mL蒸馏水溶解,配制成10mg/mL葡萄糖溶液备用,2-8℃保存2周。

β-1,3-GA(EC3.2.1.73)主要存在植物中,催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。

在植物染病或处于其他逆境条件下,可诱导细胞大量合成β-1,3-GA,因此β-1,3-GA活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。

β-1,3-GA水解昆布多糖,内切β-1,3-葡萄糖苷键,产生还原末端,通过测定还原糖生成速率,来计算其酶活性。

Fucoidanβ-1,3-GA Reducing SugarReducing Sugar+3,5-Dinitrosalicylic Acid3-Amino-5-Nitrosalicylate(540nm)注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、超声破碎仪、冰和蒸馏水。

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。

12000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2.细菌或细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率200w超声3s,间隔10s,重复30次);12000g4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

β-葡聚糖酶活性测定

β-葡聚糖酶活性测定

β-葡聚糖酶活性‎测定β-葡聚糖是由葡‎萄糖单体通过‎β-1,3和β-1,4糖苷键连接‎而成的D型葡‎萄糖聚合物,它主要存在于‎单子叶禾本科‎谷实中的糊粉‎层和胚乳细胞‎壁中。

β-葡聚糖酶属于‎水解酶类,能有效地降解‎β-葡聚糖分子中‎的β-1,3和β-1,4糖苷键,使之降解为小‎分子。

由于在饲料中‎,大麦的β-葡聚糖含量较‎高,难以被单胃动‎物消化利用,而且对饲料中‎各种养分的消‎化利用具有明‎显的干扰和抑‎制作用,成为麦类饲料‎中的抗营养因‎子。

在饲料中添加‎β-葡聚糖酶,能有效地消除‎β-葡聚糖的抗营‎养作用,促进饲料中各‎种养分的消化‎和吸收利用,增进畜禽健康‎。

在啤酒生产中‎,添加β-葡聚糖酶可以‎加快麦汁和啤‎酒的过滤速度‎、提高麦汁得率‎、增加可发酵糖‎的含量。

此外,β-葡聚糖酶在造‎纸工业、日化工业等其‎它许多方面也‎有着广泛的应‎用,对β-葡聚糖酶的研‎究将越来越受‎到人们的重视‎。

β-葡聚糖酶活力‎的测定方法主‎要有3种:还原糖测定法‎(分光光度法)、粘度测定法和‎底物染色法。

其中还原糖测‎定法简便实用‎,比较准确,而且结果重复‎性好,是广泛使用的‎一种酶活测定‎方法。

其原理是:β-葡聚糖酶能将‎β-葡聚糖降解成‎寡糖和单糖,其具有的还原‎基团在沸水浴‎条件下可与D‎NS试剂发生‎显色反应,显色的深浅与‎还原糖量成正‎比,而还原糖的生‎成量又与反应‎液中β-葡聚糖酶的活‎力成正比,因此,可以利用比色‎测定反应液的‎吸光度值来计‎算还原糖的生‎成量,从而得出β-葡聚糖酶的活‎力。

但在该测定方‎法的具体操作‎中存在一些影‎响酶活力测定‎结果的因素,本文即对还原‎糖法测定β-葡聚糖酶活力‎的几个重要影‎响因素进行研‎究,并得出最佳测‎定条件。

1 材料与方法1.1 菌株与培养基‎1.1.1 发酵产酶菌株‎黑曲霉(Asperg‎illus niger)A47菌株,由本实验室保‎藏。

1.1.2 固态发酵培养‎基麸皮70 g、米糠27 g、NH4NO3‎ 2.95 g、微量元素液0.05 ml、蒸馏水100‎ml,pH值5.0,121 ℃灭菌20 min。

酶活力测定方法

酶活力测定方法

蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。

纤维素酶DNS酶活力测定方法DNS, 活力, 纤维素酶, 测定1 定义1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下,每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位,以u/g表示。

2 原理纤维素酶分解纤维素,产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖,纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3,5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物,利用比色法测定其还原物生成量,表示酶的活力。

3.试剂和溶液3.1 1%葡萄糖标准溶液(同β-葡聚糖酶酶活测定)3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液取1g羧甲基纤维素钠(粘度300~600厘泊),加入pH4.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M 盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤,此溶液在4℃冰箱贮存,有效期3天。

取滤液100ml,20ml,蒸馏水40ml,混匀,贮冰箱备用。

3.3 DNS 试剂(同β-葡聚糖酶酶活测定)4仪器和设备4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃)4.2分光光度计含10mm比色皿,可在550nm处测量吸光度。

5测定步骤5.1 标准曲线绘制分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中,用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。

各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中,加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml,于沸水浴中沸腾7min,取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。

冷却后,用10mm比色皿,在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。

以吸光度为纵坐标,相对应的葡萄糖浓度为横坐标,绘制标准曲线或计算回归方程。

基因工程菌EGs2产β-葡聚糖酶条件优化及产酶特性

基因工程菌EGs2产β-葡聚糖酶条件优化及产酶特性

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(4):708~712*基金项目: 国家自然科学基金 (No.20276064) 资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.教授, 博导, 主要从事食品微生物相关的研究。

E­mail:<gqhe@>. 收稿日期:2006­12­25 接受日期: 2007­03­16 ·研究论文· 基因工程菌 产 茁 ­葡聚糖酶条件优化及产酶特性 *李青青 1 , 陈启和 1 , 蒋孝燕 1, 张秀艳 2 , 李 婷 1 , 何国庆 1 ** (1.浙江大学食品科学与营养系, 杭州 310029; 2.华中农业大学食品安全与微生物学系, 武汉 430070)摘要: 用乳清粉作为主要培养基组成, 采用正交试验对大肠杆菌 ( ) 重组菌 的发酵条件进行了优化,并 对粗酶液的酶学性质进行了研究。

重组菌 的最佳发酵条件为: 摇床转速 170r/min , 接种量 1%, 发酵培养基初始 pH 6.0,种龄12h 。

重组菌茁 ­葡聚糖酶的表达与菌体生长呈正相关, 发酵 14h 后, 菌体生物量最高可达1.71g/L , 茁 ­ 葡聚糖酶活力最高可达 321.56U/mL 。

所得粗酶液的最适反应温度 60 ℃,pH 6.0, 在 70 ℃以下保温20min 后, 残余酶活力均在 80%以上。

在pH 5.0~9.0放置48h 后仍能保持均90%以上的残余酶活力。

关键词: 茁 ­葡聚糖酶;重组菌 EGs2; 发酵条件; 酶学性质 中图分类号: S182 文献标识码:A 文章编号:1006­1304(2007)04­0708­05Optimization of Recombinant Fermentation ConditionAffecting 茁­glucanase Production and Its Characteristics of Enzyme LI Qing­qing 1 ,CHEN Qi­he 1 ,JIANG Xiao­yan 1 ,ZHANG Xiu­yan 2 ,LI Ting 1 ,HE Guo­qing 1**The fermentation conditions of mutant obtained from directed evolution for thermostable 茁­glucanase for 茁­glucanase production were investigated by orthogonal experiment.Fermentation was conducted in 250mL flask,each containing 30mL of medium contained whey 10g/L,yeast extract 5g/L,NaCl 10g/L,the temperature was 37 ℃.The optima culture conditions were as following:initial pH 6.0,shaking speed 170r/min,inoculation volume 1%and inoculation time 12h. 茁 ­glucanase production by mutantwas associated with cell growth and biomass. 茁­glucanase activity was increased significantly when cells entered growth phase.The bacterium began the stable phase after cultured for 14h with the highest biomass 1.71g/L and 茁­glucanase activity 321.56U/mL.When 茁 ­glucanase was used as a substrate,the optimum temperature and pH were 60 ℃ and 6.0,respectively. After 20min incubation at 40,50,55,60,65and 70 ℃ respectively,the residual activity remained at least 80%.After 48h conserva­ tion at pH 5.0~9.0,the residual activity remained at least 90%.The enzyme was stable below 70 ℃ and at pH 5.0~9.0.茁­glucanase;mutant ;fermentation condition;enzyme characteristic茁­1,3­1,4­ 葡聚糖酶是重要的工业用酶。

病原菌细胞壁诱导下球毛壳菌葡聚糖酶活测定及抑菌试验

病原菌细胞壁诱导下球毛壳菌葡聚糖酶活测定及抑菌试验

pat a oe e a s b th ny eat ie eed fr t T ep一1 3一g cns ci t w s i icn l t gnclw l , u ee zm ci t s r iee . h np h l l t vi w f n , l a aeat i a g f a t u vy sni —
a d P.g i a moeefciey n r e r f t l .C a tmim lbs m o l rd c 一1 3 一gu a a eu d rid cin w t i s e v h eo u go ou c ud po u e B , lc n s n e n u t i s o h x
0 6 f r 1 a s i d ci n wi ) iua i r e elw l ,w i h ci i e r e p cie y mu h lw r . 1 at d y n u t t P , c lra g  ̄ a c l al U e 1 o h r s h l t e a t t swee r s e t l c o e e vi v
显 。在 6种植 物病 原真 菌细胞壁 诱 导下 , 球毛 壳 菌可产生 B一13一葡聚糖 酶 , , 但是 产 酶规律 不 同。
在稻 瘟病 菌 、 立枯 丝核 菌和 尖孢 镰 刀 茵细胞 壁诱 导 下 , B一1 3一葡聚 糖 酶 活要 明 显 高 于杨树 烂 皮 ,
病菌、 核盘 茵和 叶枯 茵。其 中 , 稻 瘟病 茵 细胞壁诱 导 l 在 1 d后 , 酶活 达到最 高 , 0 6 而杨树 烂 为 . 1U; 皮病 菌和 叶枯 茵细胞壁 的诱 导产酶 效果 最差。球毛 壳 菌可作 为生物防 治真 菌。 关 键词 : 毛 壳菌 ; 球 生物 防 治 ; B一13一葡聚糖酶 , 中图分类 号 :7 3 1 ¥6.5 文献标 识码 : A 文章编号 :0 3— 19 2 1 ) 3— 0 0— 4 10 7 7 (0 0 0 0 5 0

β-葡聚糖测定方法

β-葡聚糖测定方法

β-葡聚糖酶活力测定方法(NY/T911-2004)∙ 1.原理β-葡聚糖酶能将木聚糖降解成还原性糖。

还原性糖在沸水浴条件下可以与3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂反应显色反应。

反应液颜色的深度与酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比。

因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中β-葡聚糖酶的活力。

∙ 2. 操作∙ 2.1.标准葡萄糖曲线的制作2.1.1 吸取PH5.5的0.1M乙酸-乙酸钠+缓冲溶液4.0mL,加入DNS试剂5.0mL,沸水浴加热5min。

用自来水冷却至室温,用水定容至25.0mL,制成标准空白样。

2.1.2 分别吸取葡萄糖溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL和7.00mL,分别用PH5.5的0.1M醋酸缓冲溶液定容至100mL,配制成浓度为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg、0.60mg/mL和0.70mg/mL葡萄糖标准溶液。

2.1.3 分别取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.00mL(做两个平行),分别加入到刻度试管中,再分别加入2.0mL缓冲液94.4)和5.0mLDNS试剂。

电磁振荡3s-5s,沸水浴加热5min。

然后用自来水冷却到室温,在用水定溶液至25mL。

以标准空白为对照调零,在540min处测定吸光度A值。

以葡萄糖糖浓度为Y轴、吸光度A值为X轴,绘制标准曲线。

每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线∙ 3. 酶样测定吸取10.0mLβ-葡聚糖溶液,37℃平衡20min。

吸取10.0经过适当稀释的酶液,37℃平衡10min。

∙吸取2.00mL经过适当稀释的酶液(已经过37℃平衡),加入到刻度试管中,再加入5mLDNS试剂,电磁振荡3s-5s。

然后加入8.0g/lβ-葡聚糖溶液2.0ml,37℃保温30min,沸水浴加热5min。

SOD酶活力测定实验

SOD酶活力测定实验

摘要:通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶,经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程,除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白,采用葡聚糖(Sephadex G-100)凝胶层析得到纯化的SOD酶。

跟踪提纯过程活性的分布,并评价提取过程各步骤的效率。

实验结果证实随着不断的分离提纯,总活力以及总蛋白不断减小,比活力不断上升,最终得到的结果为总纯化倍数为0.68,活性得率为5.24%。

一、前言:超氧化物歧化酶简称SOD,是一种新型酶制剂,属金属酶。

分布很广,几乎从哺乳动物到细菌,以及植物中均存在。

在微生物中主存于需氧菌。

SOD是催化超氧阴离子(O2-)歧化反应的酶类,能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基(O2.-),生成H2O2和O2.H2O2由过氧化氢酶(CAT)催化生成H2O 和O2,从而减少自由基对有机体的毒害。

它的存在与生物体内的解毒作用有关,也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。

自1968 年发现SOD 后,立刻引起科学界的高度重视,近40 年来这方面的研究进展非常迅速,它的应用领域日益拓宽,SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶,其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质,证明它无毒,无抗原性,能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。

二十世纪80 年代后期,我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点,如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。

SOD作为治因而受到医药界的关注。

目前中国国内已进入临床试验阶段。

本实验以绿豆为原料提取SOD,通过各步的分离提纯,应测得酶总活力逐渐减小,比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程,以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。

二、实验材料与方法:<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.<二>试剂:葡聚糖(sephadexG-100), NaCl(AP), 磷酸氢二钠(AP), 磷酸二氢钠(AP), 三羟甲基氨基甲烷(Tris), 盐酸(浓盐酸),硫酸铵(AP), PEG6000 ,考马斯亮蓝G250 , 磷酸,乙醇(95%),牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶(sigma公司)。

饲用木聚糖酶、β—葡聚糖酶活力测定方法的调研

饲用木聚糖酶、β—葡聚糖酶活力测定方法的调研

前 言
饲 用 酶 制 剂 在 畜 牧业 上 的广 泛 应 用 使 酶 质
量 的度量 问题 显得 格 外 重要 。酶 活 的测 定方 法 和 酶活 的定 义 密 切相 关 。 为 了适 应 市 场 的需求 ,酶
件 做 了许 多试 验 。B dod 19 ) 不 同酶 种在 不 efr(9 1对
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< 料 角 20 年 5 饲 广 } 2 第1期 0
斟 技 钡 野
饲用 木聚糖 酶 、 一葡 聚糖 酶活力 测定 方法昀 调研 1 3
王在 贵 - 张 宏福 何瑞 国 -
(- 中国农业科 学院畜牧研究 所 ; 华 中农业 大学动物科技学 院) z
学 者 的认 可 。 3 酶 底 物 的选 择 及底 物 浓 度 .
< 料 角 20 年 5 饲 广 } 2 第1期 0
缓 冲 液 及 其 浓 度 的 选 择 对 反 应 体 系 的 离 子 强
电 : 1 6 7 6 61 4061 4 2 5 3 话(0 8 5 6 2 5 2 5 26 4 6 0 )9 8 4 6 4 6 14
传 :1) 1 4 真 (0 2 2 1 0 67 0

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科 技 钡 野
由表 2可 知 ,国内外 各单 位对 酶 活 测定 的温 度 一 般 都选 在 4 %或 5 ℃ , 0 O 由于动 物 消 化道 的温 度接 近 4 ℃ ,所 以在 4 ℃ 条件 下 测 定酶 的 活性 , 0 0 比较 接 近 酶 的生 物学 活 性 。这 一观 点 已得 到许 多
p 53 p 4 5 H . ,H . p 4 6,H . ,H . p 4 8 H . p 5 0 p 7 2,H .
测定方法 的条件都 未统 一 , 酶活测定方法 的统一存在 一定
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八、Beta—葡聚糖酶活力的测定方法
1 方法:3,5—二硝基水杨酸比色法,简称DNS法。

2 原理:
还原糖能将3,5—二硝基水杨酸分子中的硝基还原成橙黄色的3—胺基5—硝基水杨酸。

溶液橙黄色强度与还原糖量成正比。

3. 主要仪器和设备
天平(感量1mg和0.1mg两种),离心机,恒温水浴锅,磁力搅拌器,分光光度计(722型,符合GB9721的有关规定)。

4. 试剂和溶液
4.1 所用水除特别要求外,均为符合GB/6682—1992规定的三级水, 化学药品除特别要求外,均为分析纯。

4.2 DNS试剂
称取3,5—二硝基水杨酸10g加入500 ml水中,分多次加入氢氧化钠16g,搅拌溶解(温度<45℃),再分多次加入酒石酸钾钠300g,搅拌至全溶,冷却后用水定容至1000ml。

室温下棕色瓶储存暗处放置,一周后使用(如有沉淀过滤后使用)。

4.3 0.1mol/L,pH
5.0醋酸—醋酸钠缓冲液
吸取冰醋酸1.8ml于烧杯中,加适量水,加醋酸钠5.78g,溶解, 定容至1000ml,调节PH至5.00±0.01后使用。

室温下存放2个月有效。

4.4 0.1%即1mg/ml葡萄糖溶液
无水葡萄糖于80℃烘至恒重,称取0.1000g于烧杯中,加适量水溶解,转入容量瓶中并定容至100ml。

4.5 0.5%β—葡聚糖溶液
称取β—葡聚糖0.50g于烧杯中,加入适量缓冲液,在沸水浴中搅拌加热溶解后,转入容量瓶中,用缓冲液(4.3)定容至100 ml,置2—8℃冰箱中备用。

有效期三天。

4.6 葡萄糖标准曲线的绘制
吸取1mg/ml无水葡萄糖溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml于试管中,补水至2ml,加DNS试剂3ml,混合后于沸水中煮10min,冷却后定容至15ml,于分光光度计540nm波长下测吸光度(A)。

以吸光度为纵坐标,葡萄糖量为横坐标,绘制标准曲线,三次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y=ax﹢b,求出吸光度与葡萄糖量的关系。

5. 待测酶样品的处理
5.1 液体酶:直接吸取酶液做适当稀释,使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。

5.2 液体曲:离心上清液做适当稀释,使测定光吸收值在0.25—0.4范围内。

5.3 固体曲:按干重计称取4g于三角瓶中,加水200ml,室温下磁力搅拌浸提
0.5h。

取离心上清液做适当稀释。

5.4 固体粉状酶:称取适量于烧杯中(精确至0.0001g),用少量水润湿并调成糊状,再用水溶解,离心上清液做适当稀释。

5.5 固体粒状酶:研磨成粉后如5.3处理。

6酶活力测定
取15 ml具塞刻度试管按下面的反应顺序进行操作,在反应过程中,从加入底物(吸取前摇匀) (4.5)开始,向每支试管中加入试剂的时间间隔要绝对一致, 50℃水解10 min.
7酶活力单位计算
酶活力=(S×D×1000)/(0.2×10)×4 µg/ml(g).min
式中:
S—测得光吸收在标准曲线上对应的葡萄糖量,mg数;
D—酶液或酶粉稀释倍数;
1000— mg和µg之间的换算系数;
0.2—测定所取酶液量,ml数;
10—反应时间,min数;
4—方法换算系数。

8酶活力单位定义及换算
8.1 本方法酶活定义:在本测定条件下,每分钟水解β—葡聚糖产生1µg还原糖(以葡萄糖计)所需酶量定义为一个酶活力单位(u)。

国际酶活单位的定义:在测定条件下,每分钟水解β—葡聚糖产生1µmol还原糖(以葡萄糖计)所需酶量定义为一个酶活力单位(IU)。

8.2 u与国际单位IU 的换算关系:
1 u=1÷180 IU(µmol糖/ml(g).min)
180: 葡萄糖的分子量
注:β—葡聚糖为中国食品发酵研究院产品。

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