黄病毒科的黄病毒和肝炎病毒研究进展

黄病毒科的黄病毒和肝炎病毒研究进展秦鄂德军事医学科学院微生物学流行病学研究所　北京　100850【摘要】　黄病毒科的黄病毒和肝炎病毒可引起许多严重的人类疾病。

该文概述了这两类病毒的体外细胞培养系统、病毒蛋白的抗原结构与功能、病毒毒力的分子基础,以及疫苗和治疗等方面的研究进展。

关键词　黄病毒属;肝炎病毒属;病毒蛋白类;毒力决定簇;遗传工程疫苗;治疗中国图书资料分类法分类号　R 373.2Advances in researches on flaviviruses and hepaciviruses of the family FlaviviridaeQin EdeInstitute o f M icr obio lo g y and Epidemio lo gy ,Academ y of Militar y M edical Sciences,Beijing 100850Abstract Flav iv irus and hepacivir us belong to th e family Flav iviridae.T he v iruses ca use lo ts of sev ere diseases.The pur po se o f this r ev iew is to pr ovide a v iew of so me adva nces in the in vitro cell cultur e sy stem s fo r th e viruses,the antig enic structure and functio n o f v iral pr o teins ,the molecular basis o f v iral v irulence ,a nd the nov el ap-proaches to v accine and ther apy ag ainst these v iral diseases.Key words flaviviruses;hepaciviruses;vira l pr oteins;v irulence determina nts;g ene tically-eng ineer ed v accine;thera py 秦鄂德,男,1949年10月生,副研究员 黄病毒科(Flav iv iridae)包括黄病毒、肝炎病毒和瘟病毒3个属。

这类病毒可使人和动物罹患各种疾病,如黄热病、蜱传脑炎、日本脑炎、登革热和登革出血热、丙型肝炎、庚型肝炎、牛病毒性腹泻等。

由于黄病毒科病毒对人和动物危害的严重性及普遍性,近年来对这类病毒进行了广泛深入的研究,并取得了很大的进展。

本文仅就黄病毒科的黄病毒和肝炎病毒的体外培养、动物模型、致病的分子机理,以及与防治相关的基础研究方面的进展作一综述。

1　病毒的特性〔1〕黄病毒科病毒的基因组为长9.5～12.3kb 的单股正链RN A ,编码一个含有3～4种结构蛋白和6～7种非结构蛋白的聚蛋白前体。

该蛋白前体的加工是通过细胞的蛋白酶、信号肽酶,病毒的N S3蛋白酶及各属病毒特异的蛋白酶。

病毒基因组的复制需要病毒编码的依赖于RN A 的RN A 聚合酶和解旋酶,核衣壳的装配在细胞浆中进行。

最后通过胞吐作用(ex o cyto sis)释放成熟的病毒。

有些黄病毒对哺乳动物具有很强的致病性,对宿主的特异性较低,它的传播一般需经节肢媒介。

肝炎病毒通过非肠道传播,只感染人和灵长类。

丙型肝炎病毒(hepa titis C virus ,HCV )是嗜肝性的,可导致持续感染;庚型肝炎病毒(hepatitis G vir us ,HGV )对宿主器官的嗜性尚不清楚。

2　体外细胞培养系统和动物模型的研究最近10年来利用分子生物学新技术,发现了一些新的黄病毒基因组序列,如HCV 和HGV 等。

但是,对进一步深入研究这类病毒的生物学特性、致病机理、病毒病的免疫预防,以及探讨新的抗病毒策略,病毒体外细胞培养系统和动物模型的建立是十分重要的。

近年来,人们集中探讨用人T 淋巴细胞和肝细胞体外增殖HCV 等肝炎病毒的可能性。

国外报道HCV 可在人T 淋巴细胞系(HPB-M a 细胞株)中存活近3个月。

由于肝细胞是肝炎病毒的天然宿主,因此用肝细胞体外增殖肝炎病毒也成为人们研究的热点。

国外不少实验室在这方面进行了探讨。

有报道从9月龄的胎儿肝脏中分离肝细胞,在加入表皮生长因子和胰岛素的培养基中培养胎肝细胞,以细胞外基质延长其在体外的存活时间,HCV 在这种条件下在胎肝细胞中可存活3个月。

有人采用人肝癌细胞(HuH7)系,在培养液中加入聚乙二醇、二甲基亚砜及可以促进低密度脂蛋白(LD L)受体表达的洛伐他汀(lov astatin),并以感染细胞中的HCV 负链RN A 作为病毒复制的标志,结果表明HCV 在这种条件下可存活5个月〔2〕。

对于像HCV 、HGV 等这类RN A 病毒,之所以很难在体外培养细胞中进行增殖,可能是由于缺乏对它们与宿主细胞作用的独特性的了解,因而无法选择与之相适应的细胞培养条件。

在建立动物模型方面,有些重要的人类黄病毒仍缺乏合适的动物模型,因此,寻找价廉、来源较广的动物模型仍极为迫切。

有报道中国猕猴有可能作为HGV 感染的动物模型。

由于转基因动物的出现,为病毒的动物模型的建立开辟了一149军事医学科学院院刊　1999年6月第23卷第2期Bull Acad M il M ed Sci,J un 1999;　Vol 23　No 2条新的途径。

目前已建立了HCV转基因小鼠动物模型,以及可以在肝脏中表达包膜蛋白编码序列的乙型肝炎病毒(hepa titis B v irus,HBV)转基因小鼠〔3〕,作为HBV慢性携带者的模型。

因此,分子生物学、分子细胞学最新技术的发展与完善必将促进这一领域的研究。

由于感染性cDN A克隆技术的出现,目前已有许多黄病毒的具有感染性的全长基因组cDN A克隆构建成功,而且不少是病毒战剂或潜在病毒战剂,如黄热病毒、日本脑炎病毒、登革病毒等。

将这些由cDN A转录成的RN A转染细胞后,可以成功地回收病毒。

这为研究黄病毒的复制及生物学特性又提供了一条新的途径。

最近有报道,将HCV基因组全长cDN A克隆或编码病毒聚蛋白共有氨基酸序列的RN A转录物,直接注射到黑猩猩的肝脏中,可使黑猩猩感染而发病〔4〕。

目前这一领域的研究进展较快。

3　病毒蛋白结构与功能的研究病毒蛋白,特别是位于病毒体表面如衣壳、包膜并暴露于三维结构表面的蛋白,含有多种抗原表位,这些表位与病毒识别宿主细胞膜受体、吸附和进入细胞,病毒的致病性和诱导免疫应答等密切相关。

因此,对病毒蛋白的结构及功能的研究,有助于阐明病毒的感染、致病及免疫的分子机制,从而解决病毒病的诊断、预防和治疗问题。

目前在这一领域对黄病毒的研究已取得一些进展。

黄病毒包膜蛋白一级结构,特别是与抗原表位密切相关的核心结构(线形表位)及其三维结构所涉及的构象型表位已初步确定。

黄病毒包膜E蛋白的多数抗原表位簇集为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个不同的抗原功能域〔5〕,它们与病毒对宿主细胞的嗜性,与宿主细胞膜融合或与受体结合,以及病毒的致病性有关。

病毒蛋白抗原表位的核心序列,特别是能同时被B和T淋巴细胞所识别的序列的研究尤为重要。

现在,对登革2、3和4型病毒起交叉反应的人T细胞所识别的抗原表位已被确定〔6〕,这对可诱导强免疫反应的疫苗的研究提供了依据。

HCV的N S3蛋白酶的核心序列为30～178氨基酸,其辅助因子为N S4A蛋白。

目前,N S3及其与N S4A复合物的晶体结构已被阐明,它们的二极结构是类似的。

HCV的N S5A蛋白可能具有致癌性,其编码基因可能与介导干扰素的抗性有关。

尤其值得注意的是,表面提呈技术和随机肽库技术的发展,在研究黄病毒抗原表位、细胞受体、拮抗剂、诊断制剂和新型抗病毒药物的设计,以及疫苗的研制等方面将发挥重要作用。

如利用单克隆抗体可以从随机噬菌体肽库中筛选出相应的抗原或替代抗原位点,可进一步研究病毒关键抗原位点的结构与功能。

4　感染性cDN A克隆的研究如前所述,黄病毒是正链RN A病毒。

对于这类病毒尤其是缺乏合适的动物模型和有效的体外增殖系统的病毒的复制、毒力表位及与其相关的致病和减毒的分子机理的研究,有赖于在DN A水平通过基因操作来进行。

但是,这类病毒在复制过程中并不涉及DN A中间体的步骤。

因此,就必须将病毒的基因组RN A转变成全长的c DN A,这样才可采用诸如定点突变等方法对病毒基因组的任何部位进行修饰和改造。

然后再将所构建的全长cDN A体外转录成具有感染性的RN A,并将其导入宿主细胞或动物体后即可观察病毒表型的变化特征,可进一步确定导致减毒的基因组区段。

从而将特异减毒突变引入病毒基因组,构建新型减毒活疫苗、多价疫苗或核酸疫苗;而且对特异生物治疗的抗病毒靶位研究,以及探索新的抗病毒策略具有重要意义。

目前已构建成功的全长cDN A克隆有黄热病毒〔7〕、蜱传脑炎病毒〔8〕、登革病毒、日本脑炎病毒、不同基因型的HCV 等〔4〕。

最近有报道,将HCV基因组全长cDN A克隆转录物直接注射到黑猩猩的肝脏中,发现可导致HCV的复制,使黑猩猩出现播散性感染而发病〔4〕。

而且编码HCV聚蛋白共有氨基酸序列的RN A转录物对黑猩猩也具有感染性。

这些感染性克隆的建立,对深入研究HCV相似株克隆感染、HCV 进化及宿主免疫应答奠定了基础,而且为进一步研究HCV 体外复制、致病机理及丙型肝炎治疗制剂的筛选提供了一条新途径。

5　病毒毒力分子基础的研究黄病毒致病的分子机理及病毒毒力决定簇的确定是分子病毒学研究的热点。

病毒毒力是由病毒基因组特定的碱基序列或病毒蛋白氨基酸序列所决定的。

黄病毒基因组的非编码区对病毒的毒力有很大影响。

采用感染性cDN A克隆及定点突变技术,已构建了蜱传脑炎病毒和登革4型病毒基因组非编码区突变的高度减毒变异株。

病毒基因组不同长度的3′非编码区缺失突变株的毒力有很大不同。

蜱传脑炎病毒3′非编码区缺失突变株的毒力比野生型低4个数量级〔9〕;登革4型病毒5′非编码区缺失使病毒复制能力大大降低〔10〕。

但是,这些突变株均可有效诱导保护性免疫应答。

病毒毒力除与其基因组非编码区有关外,控制毒力的决定簇主要位于病毒基因组的编码区。

黄病毒的外壳或包膜蛋白为病毒的主要毒力决定簇所在。

黄病毒包膜糖蛋白中关键性单一氨基酸的改变,对病毒神经性侵袭力的影响很大。

蜱传脑炎病毒E蛋白384位的酪氨酸被组氨酸取代,368位的甘氨酸被精氨酸取代,均可导致病毒对小鼠的神经侵袭力的丧失〔11〕。

黄热病毒野生(Asibi)株及其疫苗株17D的毒力差别,在于两者E蛋白13个氨基酸的不同,其中5个氨基酸位于保守区;而与其疫苗亚株17D-204的不同在于后者E蛋白305位和325位的氨基酸发生了突变〔12〕。