乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测.doc
13.分子诊断产品技术审评的基本要求-董劲春
流行性感冒病毒核酸
n 【预期用途】：试剂盒用于定性检测人鼻咽拭子、口咽拭 子、呼吸道抽吸液、洗液和/或其他呼吸道分泌物样本的流 感病毒核酸，适用样本类型应结合实际的临床研究完成情 况进行确认。
n 临床：已有参比试剂，除了比对试验以外，申请人还应选 择一定数量的新鲜采集样本进行考核试剂与流感病毒检测 的“金标准”方法—病毒分离培养鉴定方法的比较研究， 每种样本类型不少于30例经病毒分离培养方法确定为阳性 的样本。
丙型肝炎病毒核酸测定
n 【预期用途】：用于定量检测人血清/血浆样本中的HCV RNA,用于需进行HCV感染诊断的患者和接受抗病毒治疗的 丙型肝炎患者，应当说明该试剂能够检测的基因型别。检 测结果不得作为患者病情评价的唯一指标，必须结合患者 临床表现和其他实验室检测对病情进行综合分析并明确说 明该检测试剂不得用于血源筛查。
。 者判为“阳性”，不再随访，其他受试者进入随访程序
人乳头瘤病毒核酸检测及基因分型
n 针对宫颈癌联合筛查用途 n 样本要求：尽量在不同的年龄范围均有分布（30～39和40
以上）。应根据检测试剂灵敏度要求、疾病发病率等对入 组样本例数进行科学的分析和计算，并根据临床实际情况 对病例脱落比例设定合理要求，随访终点病理学检查结果 ≥CIN2的例数应不少于60例。
n 基因耐药突变：至少500， HIV-1 450例，对于我国流行的 主要基因型（至少3种）每种不少于30例，应具有统计学意 义。蛋白酶基因区存在典型的耐药突变的样本至少100例。 逆转录酶基因区存在典型的耐药突变的样本至少300例。
n 干扰样本：抗病毒治疗药物、HIV相关病毒。
人类免疫缺陷病毒检测试剂
人乳头瘤病毒核酸检测及基因分型
n 针对宫颈癌联合筛查用途 n 入组：无宫颈上皮内病变（NILM）的30岁以上女性。 n 基础检测：入组人群应分别接受拟申报产品的HPV检测，
病毒五项资料
CREATE TOGETHER
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DOCS
对新生儿进行病毒五项检测，有助于预防疾病传播
• 了解新生儿病毒感染状况，制定针对性的预防措施
• 有助于降低新生儿病毒感染的传播风险
病毒五项检测在孕妇中的应用
对孕妇进行病毒五项检测，了解其病毒感染状况
• 有助于评估母婴传播风险，指导妊娠期管理
• 有助于及时发现病毒感染，进行早期干预
对孕妇进行病毒五项检测，有助于预防疾病传播
• 提示患者曾经或正
乙型肝炎病毒
炎病毒具有免疫力
肝炎病毒复制活跃
肝炎病毒复制受到抑
在感染乙型肝炎病毒
制
丙型肝炎病毒五项检测
丙型肝炎
病毒RNA
（HCVRNA）
丙型肝炎
病毒基因
分型
• 检测丙型肝炎病毒
• 检测丙型肝炎病毒
• 了解患者感染丙型
• 了解患者感染丙型
• 检测患者体内丙型
感染的主要指标
活跃度的指标
对病毒五项检测结果进行定期跟踪和监测
• 了解患者病情变化，调整治疗方案
• 有助于评估治疗效果，提高治疗效果
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病毒五项检测在不同人群中的应用
病毒五项检测在新生儿中的应用
对新生儿进行病毒五项检测，了解其病毒感染状况
• 有助于评估母婴传播风险，指导母乳喂养
• 有助于及时发现病毒感染，进行早期干预
• 了解孕妇病毒感染状况，制定针对性的预防措施
• 有助于降低新生儿病毒感染的传播风险
病毒五项检测在高危人群中的应用
对高危人群进行病毒五项检测，了解其病毒感染状况
乙肝病毒的检测ppt课件
聚合酶链反应-限制性片段 长度多态性分析法 (PCR-
RFLP)
较测序法简便，适于大样本检测，但由于需要进行酶切，所 以操作仍较为繁琐，成本较高，并存在酶切不彻底等问题。
pre-S2单克隆抗体酶联免疫 简单、快速，已商品化，适于大样本检测，但检测费用较高
测定 (mAbs EIA法)
并不能有效鉴别有些混合型感染和HBsAg低表达及某些表位
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乙型肝炎病毒HBV
• HBV是嗜肝脱氧核糖核酸病毒科的哺乳动 物属的一员。
• HBV阳性的血清中有三种病毒颗粒． １.大球形颗粒，完整的HBV颗粒直径为
42nm，又名Dane颗粒，分为包膜与核心的 两部分，外衣壳及包膜含有表面抗原，衣 壳内为核心结构，有核心抗原，核心抗原 下面藏有e抗原。
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• ２.小球形颗粒，阳性血清中最多的颗粒，主 要为表面抗原，不含核酸及ＤＮＡ成分，为 不完整的ＨＢＶ．
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①一种亚型的HBsAg及异型的抗HB（s 常见）；②血清从HBsAg 26 + + + + + 转化为抗HBs 的过程（少见）。 27 - + + + 28 - + + + + 29 - - + + 30 + - + + 31 + + + - 32 + + + + -
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大三阳
小三 阳
HBeAg 阴性的慢乙肝患者，肝硬化年发生率8%-10%； HBeAg 阳性的慢乙肝患者，肝硬化年发生率2%-5% 对HBeAg 阴性患者应该开展更积极的治疗
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• 2、试剂的影响 2.1乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性 存在一定的差别，有资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别 为89.4%—99.3%,78~89%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差 大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必 然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果 准确的关键之一。 2.2不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如： 在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测 为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的 差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂 家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。
乙型病毒性肝炎检验诊断报告模式
三、乙肝检验诊断报告的模式
(二) 检测结果
与乙肝相关检测项目包括但不限于以下内容：
(1)乙肝血清标志物检测：包含乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒表 面抗体(抗－HBs)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)、乙肝病毒e抗体(抗－HBe)、 乙肝病毒核心抗体(抗－HBc)和乙肝病毒核心抗体－IgM(抗－HBc－IgM)。 每项应报告确切的阴性或阳性结果，使用定量方法进行检测的还应报告 具体的检测数值，以及参考范围。检测HBsAg定量的应报告滴度，检测 抗－HBc－IgM应报告阴阳性结果和(或)滴度。
(三) 检验诊断/结论
1. 急性乙肝： 指近期感染乙肝病毒，引起机体免疫应答肝组织发炎的病变。同时符合
以下诊断标准中的(1)和(3)，或同时符合(2)和(3)可诊断为疑似急性乙肝。 确诊急性乙肝病例需满足：疑似病例同时符合(4)，或疑似病例同时符合 (5)，或疑似病例同时符合(6)，或疑似病例同时符合(7)。
三、乙肝检验诊断报告的模式
(一) 检验信息
2. 检测信息： (1)样本：编号、收样时间、检测时间和报告时间； (2)检测方法：如化学发光免疫分析法、聚合酶链式反应(PCR)法、生化法
等； (3)检验者和审核者； (4)检测实验室名称、地址、电话等。
三、乙肝检验诊断报告的模式
(二) 检测结果
一、概述
准确了解体内HBV的复制水平、患者的免疫状态、肝脏损伤程度，对患 者疾病的诊断、病情的评估以及指导临床用药具有重要的临床意义。
HBV感染常见4个时期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活动或低 (非) 复ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ期和再活动期，不同时期血清HBV标志物和病毒复制水平有一定的 区别又有交叉，靠单一化验指标很难界定。
2023乙型肝炎病毒标志物临床应用专家共识最全版
2023乙型肝炎病毒标志物临床应用专家共识(最全版)临床实践中，乙型肝炎病毒标志物主要用于诊断感染、监测疾病进展、评估慢性乙型肝炎治疗应答，以及在临床试验中评估新型抗病毒药物的疗效。
结合近年来慢性乙型肝炎抗病毒治疗的研究进展和临床诊治实际需求，中华医学会肝病学分会基础医学与实验诊断协作组制订此专家共识，对经典及新型乙型肝炎病毒实验室检测相关标志物的临床应用进行证据总结和要点推荐，旨在指导其规范、合理的临床应用。
乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染是我国肝硬化和肝细胞癌(hepatoce11u1arcarcinoma,HCC)的主要病因，科学、规范应用HBV标志物是提升其诊治水平的基石。
经典的病毒标志物包括血清学标志物如乙型肝炎表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen,HBsAg)及其抗体(抗-HBs)、乙型月干炎e抗原(hepatitisBeantigen,HBeAg)及其抗体(抗-HBe)和乙型肝炎核心抗体(抗-HBC),以及分子生物学标志物如HBVDNA,基因型及其突变检测等。
近年临床对血清学标志物定量检测和HBVDNA高敏检测的需求不断增加，同时，有关HBV全新标志物如前基因组RNA(pregenomicRNA,pgRNA)和乙型肝炎核心相关抗原(hepatitisBcore-re1atedantigen,HBcrAg)应用的报道也陆续出现。
HBV标志物主要用于临床实践中诊断HBV感染、监测疾病进展、评估治疗应答，以及在临床试验中评估新型抗病毒药物的疗效。
本共识在新发布的《慢性乙型肝炎防治指南（2023年版）》⑴基础上，对经典及新型HBV实验室检测相关标志物的临床应用进行证据总结和要点推荐，旨在指导其规范、合理的临床应用。
循证医学证据的检索与评价和推荐意见的形成：首先，根据共识相关临床问题进行数据检索，数据库包括PubMed,中国知网和万方数据库，文献种类包括系统评价/meta分析、随机对照试验（randomizedcontro11edtria1,RCT）、观察性研究及病例系列研究等，检索时限均从建库至2023年3月1日。
乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规程
乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规程（PCR和DNA反向点杂交）1. 目的：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测标准操作规章，保证检测结果的准确性。
2. 应用范围：对HBV的基因型和耐药突变基因检测。
3. 职责3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献4.1 亚能生物技术（深圳）有限公司乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒剂说明书。
4.2 中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册。
5. 内容5.1 检测方法：PCR和DNA反向点杂交5.2 实验原理：设计特异的PCR引物扩增获得HBV目的基因片段，该片段包含了所要检测的基因型和耐药基因突变位点。
通过PCR产物与设计的探针进行特异性杂交，根据膜条特定位置显色（蓝色）与否来判断HBV的基因型和耐药突变类型。
5.3 性能参数3 copies /ml 。
5.3.1 灵敏度：检测下限为 1.0 ×105.3.2 稳定性：产品有效期为6个月，在有效期内产品性能稳定5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.4.1 标本类型：血清或血浆。
5.4.2 标本保存：制备好的血清或血浆室温放置不超过2小时，2～8℃保存不超过48h，-18 ℃以下保存不超过半年，应避免反复冻融。
5.4.3 运送条件：冰壶或泡沫箱加冰袋密封，在途时不宜超过48h。
5.5 设备和试剂5.5.1 设备：DA 7600 荧光定量PCR仪、低速离心机、生物安全柜、高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/ 干式恒温器、冰箱（4℃、-20 ℃）、移动/ 固定紫外灯、三孔电热恒温水浴箱、振荡恒温水浴箱。
5.5.2 试剂：5.5.2.1 试剂品牌亚能生物技术（深圳）有限公司乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测试剂盒。
5.5.2.2 试剂批准文号：国食药监械（准）字2011第3401179号。
乙型肝炎病毒
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）属于嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）正嗜肝DNA 病毒属（Orhtohepadnavirus），是乙型肝炎的病原体。
HBV感染是全球性公共卫生问题，估计全世界HBV携带者高达3.5亿。
我国人群HBV携带率约为10%，HBV携带者超过1.2亿。
（一）生物学性状1.形态与结构电镜下HBV感染患者血清中可见三种形态的病毒颗粒，即大球型颗粒，小球型颗粒和管形颗粒。
（1）大球型颗粒：又称为Dane颗粒，是有感染性的完整的HBV，直径42mm，电镜下呈双层结构的球型颗粒。
外层相当于病毒的包膜，由脂质双层和病毒基因编码的包膜蛋白组成，包膜蛋白包括HBV表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）,前S1抗原（Pre S1）和前S2抗原（Pre S2）。
内层为病毒的核心，相当于病毒的核衣壳，呈20面体立体对称，核心表面的衣壳蛋白为HBV核心抗原（hepatitis B core antigen ,HBcAg）。
病毒核心内部含病毒的双链DNA分子、DNA多聚酶等。
（2）小球型颗粒：直径为22nm，为一种中空颗粒，成分为HBsAg,是HBV 在肝细胞内复制时产生过剩的HBsAg装配而成，不含病毒的DNA及多聚酶，无感染性。
这种小球型颗粒大量存在于血液中。
（3）管形颗粒：由小球型颗粒聚合而成，颗粒长100~500nm，直径22nm，成分与小球型颗粒相同，具有与HBsAg相同的抗原性。
2.基因结构与编码蛋白HBVDNA分子为不完全双链环状DNA，两链长短不一。
长链是负链，约有3200个核苷酸，短链为正链，是长链长度的50%~100%。
HBVDNA负链含4个开放阅读框（ORF），分别称为S,C,P,X区。
其中S区有3个启动子，分别编码主蛋白（含HBsAg）、中蛋白（含PreS2Ag和HBsAg）和大蛋白（含PreS1Ag、PreS2Ag、HBsAg）。
2019版：慢性乙型肝炎防治指南(全文版)
2019版：慢性乙型肝炎防治指南(全文版)中华医学会感染病学分会和肝病学分会于2005年组织国内有关专家制订了《慢性乙型肝炎防治指南》(第1版)，并分别于2010年和2015年进行了更新。
近4年来，国内外有关慢性HBV感染的基础和临床研究都取得了重要进展，为更好地规范慢性乙型肝炎(CHB)的预防、诊断和治疗，助力实现世界卫生组织(WHO)提出的"2030年消除病毒性肝炎作为重大公共卫生威胁"的目标，再次更新本指南。
本指南旨在帮助临床医师在CHB预防、诊断和治疗中做出合理决策，但并非强制性标准，也不可能包括或解决CHB诊治中的所有问题。
因此，临床医师在面对某一患者时，应在充分了解有关本病的最佳临床证据、认真考虑患者病情及其意愿的基础上，根据自己的专业知识、临床经验和可利用的医疗资源，制定全面合理的诊疗方案。
基于相关研究进展和知识更新，现对本指南进行更新和完善。
本指南中的证据等级分为A、B和C三个级别，推荐等级分为1和2两个级别，见表1(根据GRADE分级修订)。
表1推荐意见的证据等级和推荐等级1 术语•慢性HBV感染：HBsAg和(或)HBV DNA阳性6个月以上。
•CHB：由HBV持续感染引起的肝脏慢性炎症性疾病。
•HBV再激活(HBV reactivation)：HBsAg阳性/抗-HBc阳性，或HBsAg阴性/抗-HBc阳性患者接受免疫抑制治疗或化学治疗时，HBV DNA较基线升高≥2 lgIU/mL，或基线HBV DNA阴性者转为阳性，或HBsAg由阴性转为阳性。
•HBeAg阴转(HBeAg clearance)：既往HBeAg阳性的患者HBeAg 消失。
•HBeAg血清学转换(HBeAg seroconversion)：既往HBeAg阳性的患者HBeAg消失，抗-HBe出现。
•乙型肝炎康复(Resolved hepatitis B)：曾有急性或CHB病史，现为HBsAg持续阴性、抗-HBs阳性或阴性、抗-HBc阳性、HBV DNA低于最低检测下限、丙氨酸转氨酶(ALT)在正常范围。
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乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测
一．检验项目：乙型肝炎病毒分型(B型、C型、D型)和耐药突变基因检测
二．检验目的：在进行抗病毒治疗前和抗病毒治疗中进行乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测，能够：1). 区分中国和其他亚洲国家常见的HBV-B、C、D基因型；
2). 检测HBV抗病毒药物5个热点突变位点的6种突变类型；
3). 对HBV实行动态监控，辅助确定个性化的临床诊疗方案，进行HBV流
行病学研究。
三．临床意义：
HBV基因型分为9种（A-I），其分布具有地域性，中国乃至亚洲流行的乙型肝炎病毒几乎都是B、C型，此外还有少量D型，不同的基因型易发生的突变类型不同，与病情转归也密切相关，如基因型C较B更容易引起严重的肝炎或肝癌，对干扰素的应答率A型高于D型，B型高于C型，C型高于D型。
与C型患者相比，B型患者较早出现HBeAg血清学转换，较少进展为慢性肝炎，肝硬化和原发性肝细胞癌。
核苷（酸）类似物，如拉米夫定（Lamivudine，LMV），替比夫定（Telbivudine,LdT），阿德福韦酯（Adefovir,ADV）和恩替卡韦（Enticavir,ETV）等是抗HBV常见药物。
但这些药物都无法彻底清除大多数乙肝病人体内的HBV，患者需要长期维持治疗。
HBV在宿主体内感染以及抗病毒治疗的过程中会发生基因变异，并在宿主体内免疫系统的压力下和在治疗干预过程中进行变异的优势选择，以达到逃逸免疫、对抗药物、实现物种生存的目的，进而发生耐药。
乙肝病人一旦出现耐药突变，其肝功能恶化的比例将显著增高，甚至快速进展至肝衰竭。
四．标本送检要求：4ml黄色帽血清管，空腹采集后立即送检，室温放置不宜超过2小时，如不能立即送检可于4℃保存一周，如需长期保存请放入－20℃冻存，运输过程中请注意保持低温。
五．开单名称：乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测
进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验”
→选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定
或进入本科室“医生工作站”→选择开单病人“姓名”→选择“项目类别”→选择“检验”→选择“实验室”→选择“乙型肝炎病毒分型和耐药突变基因检测”→确定六．收费：570元/例
七．送检时间：周一至周日8：00am－12：00am
八．送检地点：检验科三楼服务台
九．报告时间：抽血后，7个工作日后进入我院计算机检查报告系统，查看检测结果。
联系电话：84206146
检验科。