基因突变重组与检测技术
临床常用基因突变及融合基因检查方法
临床常用基因突变及融合基因检查方法1. 引言1.1 基因突变及融合基因检查的重要性基因突变及融合基因检查在临床诊断中起着至关重要的作用。
基因突变是导致遗传性疾病和癌症等疾病发生的主要原因之一，通过检测基因突变可以及早发现患者的疾病风险，为个体化治疗提供重要依据。
而融合基因则是某些癌症的特征之一，对于癌症的诊断、治疗和预后判断有着重要意义。
通过基因突变及融合基因检查，可以精准地了解患者疾病的发展过程、临床表现和预后；可以帮助医生选择最适合患者的治疗方案，避免不必要的试错；可以帮助患者及时接受个体化治疗，提高治疗效果和生存率。
基因突变及融合基因检查已经成为临床诊断和治疗的重要辅助手段，对改善患者生活质量和延长患者生存时间起着至关重要的作用。
随着检测技术的不断发展和完善，基因突变及融合基因检查的精准性和灵敏度将进一步提高，有望为临床诊断和治疗带来更多的突破。
加强对基因突变及融合基因检查的研究和应用，对于提高临床诊断的准确性和治疗的有效性具有重要的意义。
1.2 临床常用的基因突变检查方法临床常用的基因突变检查方法主要包括Sanger测序技术、下一代测序技术和PCR技术。
Sanger测序技术是一种经典的测序方法，通过测序反应得出DNA序列，适用于短序列的测序。
尽管这种方法已有一定历史，但仍然被广泛应用于临床基因检测中。
下一代测序技术则是近年来发展起来的新一代测序技术，具有高通量、高效率和低成本的特点，可以同时测序多个样本，广泛用于基因组学研究和个性化医疗中。
PCR技术也是一种常用的基因突变检查方法，通过扩增特定DNA 片段进行检测，具有高灵敏度和特异性，适用于检测患者的基因突变状态。
这些基因突变检查方法在临床诊断中发挥着重要作用，为医生提供了准确的基因信息，指导临床治疗方案的制定。
1.3 临床常用的融合基因检查方法临床常用的融合基因检查方法主要包括荧光原位杂交（FISH）、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和基因组定序。
基因突变和基因重组说
突变和重组一定程度上决定了进化的路径，推 动生命向着更为复杂、适应能力强的方向发展。
基因突变和基因重组对生物多样性的影响
物种多样性
突变和重组带来了物种多样性， 不同的物种之间有着不同的基因 组成和表现形式。
表型多样性
生态多样性
突变和重组导致了表型的多样化， 表现形式丰富多彩，也增加了不 同表型适应环境的可能性。
基因突变和基因重组说
基因突变和基因重组是复杂生物体进化和遗传多样性的基础。了解这些基本 概念将有助于我们更好地理解自然界中各种生命形式的形成和发展。
基因突变的种类和影响
1
插入/缺失突变
2
插入或缺失1个或多个碱基，会导致序列
改变，并且可能严重影响其功能。
3
影响
4
突变可能会导致新结构、新功能和新适 应能力的形成，也可能会导致遗传病的
发生和进化路径的改变。
点突变
发生于单个碱基上的突变，包括错义突 变、无义突变和同义突变。
基因重排
基因片段被剪切、重新排列，导致基因 序列改变，常见于免疫系统的抗原结构。
基因重组的过程和作用
交换
染色体交叉互换可以带来新的重 组组合，增加基因的多样性。
断裂和连接
基因重组的关键步骤是染色体上 的断裂和重组，这样新的序列组 合就可能出现。
突变和重组使得生态系统更加丰 富多样，不同物种之间形成相互 依存的生态网络。
基因突变和基因重组研究的方法
1
分子学方法
包括PCR扩增、DNA测序、凝胶电泳等技术，可以快速检测基因突变和重组。
2
克隆和RFLP分析
对于基因重组的检测，利用克隆和限制性酶切鉴定DNA上的重组位点。
3
基因突变和基因重组(上课用)
02
基因重组
基因重组的定义和类型
定义
基因重组是指生物体在进行减数分裂 形成配子时，随着非同源染色体的自 由组合，位于这些染色体上的非等位 基因也自由组合的现象。
类型
根据重组的来源，基因重组可以分为 同源重组和非同源重组。
同源重组和非同源重组
同源重组
同源重组是指发生在同源染色体之间的基因交换。这种重组 过程发生在减数分裂的偶线期，通过交换非姐妹染色单体上 的等位基因而实现。同源重组的结果通常是产生新的等位基 因组合。
提供依据。
药物研发
基因突变和重组可以影响药物的 疗效和反应，通过研究这些变异 特征，有助于开发更加精准的药
物和治疗方案。
疾病预防和预测
通过对个体的基因突变和重组进 行检测，可以预测个体对某些疾 病的易感性，从而采取针对性的
预防措施。
在农业和生物技术中的应用
1 2 3
作物改良
通过基因突变和重组技术，可以创造出具有优良 性状的作物新品种，提高农作物的产量、抗逆性 和品质。
指染色体数目的增加或减 少，以及染色体结构的改 变，如易位、倒位等。
基因突变的原因和影响
自然因素
诱变因素
如紫外线、化学物质、病毒等可以引起基 因突变。
如辐射、化学诱变剂等可以引起基因突变 。
遗传因素
基因突变的影响
某些基因突变与遗传因素有关，如某些遗 传性疾病。
基因突变可以导致遗传性疾病的发生，如 镰状细胞贫血症；也可以促进生物进化， 产生新的物种和生物多样性。
基因突变和基因重组 (上课用)
目录
• 基因突变 • 基因重组 • 基因突变和基因重组的检测和鉴定方法 • 基因突变和基因重组的应用 • 基因突变和基因重组的伦理和社会问题
基因突变和基因重排的检测方法
基因突变和基因重排的检测方法基因突变和基因重排是影响生命过程的两个关键机制。
突变是指DNA序列发生了错误，而重排则是指基因组中的一段DNA序列被移动或复制到另一个位置。
这些变化会导致有害的影响，如导致癌症、自身免疫性疾病和遗传病等。
因此，检测这些变化变得极其重要，以便及早发现并防止这些疾病的发生。
在过去几十年里，科学家已经开发出了多种基因突变和基因重排的检测方法，其中一些方法在诊断遗传性疾病和癌症等方面证明了非常有效。
下面是一些常见的基因突变和基因重排检测方法。
1. Sanger测序Sanger测序是第一种可靠的DNA测序技术，通过分析DNA序列来检测突变和重排。
将DNA反复复制并添加特定的荧光标记，然后测量不同荧光信号的强度来确定DNA序列。
这种方法可以检测单个基因的突变以及一些基因的重排，并已广泛用于诊断遗传性疾病和癌症等。
2. PCRPCR是另一种常见的基因检测方法，它使用聚合酶链反应技术来扩增DNA片段。
通过扩增目标DNA片段，可以检测基因突变和重排。
PCR可以用于从血液、唾液和口腔黏膜等样本中提取DNA，并且已成为诊断基因突变和重排的主要工具。
3. FISHFISH是一种高度特异性的细胞遗传学方法，可用于检测基因重排。
通过将荧光标记的DNA探针与细胞的染色体配对，科学家可以识别染色体上的重排。
这种方法已被广泛用于癌症分析和遗传诊断等领域。
4. CGHCGH是一种用于检测基因重排的分子遗传学技术。
它可以检测整个基因组上的DNA重排，而不是单个基因。
CGH技术基于比较样品DNA和控制DNA之间的差异，以检测DNA重排的部位和类型。
这种方法已被广泛用于研究人类基因组的变异，并在癌症和遗传性疾病诊断中得到应用。
5. NGSNGS是一种DNA测序方法，可以快速、准确地测定DNA序列。
它通过将样品DNA纳入微型反应器中，然后生成数以百万计的DNA片段。
NGS技术可以同时检测多个基因的突变和重排，并已广泛用于快速检测基因变异。
基因突变检测技术的使用方法
基因突变检测技术的使用方法基因突变检测技术是一种关键的生物学和医学工具，已经在许多领域被广泛应用。
这项技术不仅可以帮助科学家们深入了解基因突变与疾病之间的关联，还可以用于个体化医疗以及药物研发等方面。
本文将介绍基因突变检测技术的使用方法，以及常见的检测方法和应用领域。
基因突变检测技术主要分为两种类型：直接检测和间接检测。
直接检测方法通过测量基因本身的序列来确定突变的存在与否，而间接检测方法则是通过分析基因的表达或功能来间接推断突变的存在。
以下是常见的基因突变检测技术及其使用方法的介绍：1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种直接检测方法，通过扩增基因特定区域的DNA片段，可以快速有效地检测突变。
使用PCR进行基因突变检测的步骤包括：设计引物，PCR扩增，电泳分离和检测结果分析。
通过分析PCR扩增产物的大小和形态，可以确定基因是否存在突变。
2. 基因测序：基因测序是一种直接检测方法，它能够准确地确定基因序列中的所有碱基。
基因测序可以通过Sanger测序或者新一代测序技术（如Illumina测序、Ion Torrent测序等）来进行。
使用基因测序进行基因突变检测的步骤包括：DNA提取，PCR扩增，准备测序文库，测序反应，数据分析和解读结果。
基因测序技术的优势在于它可以确定突变的具体位置和类型。
3. 聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）：PCR-RFLP方法结合了PCR和限制性酶的使用，可以检测与基因突变相关的限制性片段长度多态性。
该方法的使用步骤包括：设计引物，PCR扩增，酶切反应，电泳分离和检测结果分析。
通过比较样品的酶切图谱，可以确定是否存在基因突变。
4. 荧光PCR：荧光PCR是一种直接检测方法，它利用荧光标记的引物或探针来检测目标基因的突变。
荧光PCR的使用步骤包括：设计荧光引物或探针，PCR扩增，荧光检测，结果分析。
荧光PCR可以实现实时监测PCR反应，是一种高效、灵敏和特异性的基因突变检测方法。
临床常用基因突变及融合基因检查方法
临床常用基因突变及融合基因检查方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：临床常用基因突变及融合基因检查方法随着基因组学和分子生物学的发展，基因检测技术在临床诊断中的应用日益广泛。
基因突变和融合基因是许多疾病的发生和发展的关键因素，因此对其检测越来越受到重视。
本文将介绍一些临床常用的基因突变及融合基因检查方法，希望能够帮助读者更深入了解这一领域的知识。
1. PCR技术PCR技术是一种常用的基因检测方法，通过扩增特定基因片段，可以检测到基因的突变。
PCR技术具有高灵敏度和高特异性的优点，可以快速、准确地检测基因突变。
在临床诊断中，PCR技术经常用于检测与疾病相关的基因突变，如遗传性疾病、肿瘤等。
2. 高通量测序技术高通量测序技术是目前最流行的基因检测技术之一，可以同时测序大量基因，并快速高效地识别突变。
高通量测序技术具有高灵敏度、高准确性和高通量的优点，可以帮助医生更准确地诊断疾病，并指导个体化治疗方案的制定。
3. 质谱技术质谱技术是一种基于质量-电荷比的物质分析技术，可以用于检测DNA、RNA等生物分子。
质谱技术具有高灵敏度、高分辨率和高准确性的优点，可以用于检测基因突变、基因表达水平等，对于肿瘤的早期诊断和治疗、药物敏感性的评估等方面具有重要的意义。
1. FISH技术FISH技术是一种常用的融合基因检测方法，通过用荧光染料标记特定基因，可以直接观察到基因的融合情况。
FISH技术具有高分辨率、高灵敏度和高特异性的优点，可以帮助医生准确诊断某些特定的融合基因相关的疾病，如慢性髓性白血病、胃肠道间质瘤等。
在临床实践中，基因突变和融合基因的检测对于疾病诊断、治疗和预后评估具有重要的意义。
随着基因检测技术的不断发展和完善，相信在未来会有更多更高效、更精准的检测方法出现，为临床诊断和治疗带来更多的帮助和改善。
希望本文能为读者对基因突变及融合基因检查方法有更深入的了解和认识。
第二篇示例：临床常用基因突变及融合基因检查方法基因突变是指基因组中的某个基因发生了突变，使其序列发生了改变，导致基因的功能发生变化或失去功能。
基因突变检测
基因突变检测基因突变检测是一种重要的分子生物学技术，它可以用于检测个体体内的基因突变情况。
基因突变是指由于DNA序列发生改变而导致基因功能发生变异的现象。
在人类的遗传疾病中，许多疾病都与基因突变密切相关。
因此，基因突变检测具有较高的临床应用价值。
本文将重点介绍基因突变检测的原理、方法和应用领域。
一、基因突变检测的原理基因突变检测的原理基于对基因序列的分析和比较，通过测定样本的DNA序列来鉴定其是否存在突变。
常见的基因突变包括点突变、插入突变、缺失突变和倒位突变等。
在进行基因突变检测时，我们通常通过PCR扩增或测序等方法对特定的基因区域进行分析，以确定基因是否发生了突变。
二、基因突变检测的方法1. PCR扩增法PCR扩增法是一种常用的基因突变检测方法，它能够在很短的时间内扩增出特定的DNA片段。
通过PCR扩增后，可以使用限制性内切酶酶切分析或直接测序等方法，对扩增产物进行检测。
PCR扩增法具有快速、敏感、特异性高等优点，广泛应用于基因突变的检测。
2. Sanger测序法Sanger测序法是一种广泛应用的基因测序方法，它利用DNA聚合酶合成新链时，加入ddNTP（dideoxynucleotide triphosphate）进入反应体系，从而终止合成链的延伸，形成长度不同的DNA片段。
通过电泳分离这些DNA片段，就可以得到原始序列信息。
Sanger测序法具有准确性高、稳定可靠等优点，在基因突变检测中得到广泛应用。
3. 下一代测序法下一代测序法是近年来发展起来的新一代测序技术，它通过高通量平台，可以在较短的时间内同时测序大量的DNA片段。
下一代测序法拥有高通量、高灵敏度和高分辨率等优势，被广泛应用于基因突变的检测。
它能够更好地满足临床需求，并在基因突变的诊断和治疗中发挥重要作用。
三、基因突变检测的应用领域基因突变检测在医学研究和临床实践中具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 遗传疾病的诊断和筛查基因突变与许多遗传疾病有着密切的关系。
基因突变检测技术简介
基因突变检测技术简介基因突变检测技术是一种用于检测个体基因组中突变的方法。
基因突变是指基因序列发生的变异，可分为点突变、插入和缺失等多种类型。
这些突变可能与遗传性疾病、癌症等疾病的发生有关。
基因突变检测技术的发展，为疾病治疗和预防提供了重要依据。
现今，基因突变检测技术主要应用在两个领域：遗传病筛查和肿瘤突变检测。
在遗传病筛查中，基因突变检测技术广泛应用于新生儿筛查和遗传咨询。
新生儿筛查旨在在婴儿出生后尽早发现可治疗的遗传病。
通过分析婴儿的基因组，可以及早识别出导致遗传性疾病的突变基因，从而及时采取干预措施。
遗传咨询是指向具备遗传病风险的个体提供遗传咨询，帮助他们了解潜在风险，并制定适当的生育计划和预防措施。
基因突变检测技术可通过对个体基因组进行测序，发现其中存在的潜在疾病风险基因，从而提供个性化的遗传咨询。
在肿瘤突变检测领域，基因突变检测技术具有重要的意义。
肿瘤是基因突变导致的一类疾病，通过检测肿瘤细胞中的突变基因，可以实现肿瘤的早期诊断、分型、分级以及预后评估。
同时，肿瘤突变检测还可以指导个体化治疗的选择。
以肺癌为例，肺癌患者的基因突变情况会影响对特定药物的敏感性，通过检测突变基因，可以选择最有效的药物治疗方案，提高治疗效果。
目前，常用的基因突变检测技术包括PCR、Sanger测序、下一代测序（NGS）等。
PCR（聚合酶链式反应）技术是一种高度敏感的突变检测方法。
利用PCR技术可以扩增目标基因或特定片段，通过检测扩增产物的变异位点，确定是否存在突变。
PCR技术具有高度特异性和敏感性的优点，广泛应用于突变的快速检测。
Sanger测序是一种经典且广泛应用的突变检测技术。
该技术通过测序反应逐个回顾目标片段的碱基序列。
当一个碱基被修饰时，会生成特定的信号，从而识别突变位点。
Sanger测序技术具有较高的准确性和可靠性，是突变检测的金标准技术。
下一代测序（NGS）是一种高通量测序技术，已逐渐成为基因突变检测的主流技术。
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基因缺失
基因缺失可以是1-2个碱基，也可以是一个 片段甚或一个外显子的缺失。基因片段的缺 失可使该基因激活，转录异常，使基因正常 的生物学功能丧失。在肿瘤发生中，多为抑 癌基因的缺失。 常见的抑癌基因缺失包括： RB - the retinoblastoma gen p53 gene p16-INK4a
多害少利性：多数有害,少数有利 意义：新基因产生的途径，是生物变异的根本来源， 是生物进化的途径。
目录
点突变的实例： 镰刀型细胞贫血症的形成
病人的血红蛋白的一条多肽链发生了什么变化？
正常 异常
…－脯氨酸－谷氨酸－谷氨酸—…
… －脯氨酸－缬氨酸－谷氨酸 —…
目录
点突变的实例：镰刀型细胞贫血症
DNA
缺 失
┯┯┯ ＡＧＣ ＴＣＧ ┷┷┷
目录
基因突变的原因和类型
物理因素 外界因素
原因
化学因素
生物因素
内部因素
自然突变
DNA修复功能减弱
类型 人工诱变
目录
基因突变的特点和意义
普遍性: 随机性: 特点 生物界中普遍存在 可发生在生物个体发育任何时期
不定向性： 突变无明显偏倚 低频性: 自然状态下突变频率很低10－5-10-8
H-, K-, N-ras, src, raf,
N-, c-, L-myc, c-jun, fos PRAD1 (cyclin D) bcl-2, bcl-X
目录
肿瘤突变—取样的特殊性
Sample Selection by Laser Capture Microdissection
注意事项：必须从肿瘤组织中取样
ETV家族常见融合基因
5' partner TMPRSS2 TMPRSS2 TMPRSS2 HERV-K_22q11.23 SLC45A3 C15orf21 HNRPA2B1 KLK2 CANT1 ACSL3 SLC45A3 FLJ35294 DDX5 TMPRSS2 SLC45A3 EST14 HERVK17 Class I I I II II III IV II II II II II IV I II II II 3' partner ERG ETV1 ETV4 ETV1 ETV1 ETV1 ETV1 ETV4 ETV4 ETV1 ERG ETV1 ETV1 ETV5 ETV5 ETV1 ETV1
目录
一、基因突变的定义
DNA分子中发生碱基对的 替换 、增添和 缺失，而引起的基因序列的改变
┯┯┯┯ ＡＴＧＣ ＴＡＣＧ ┷┷┷┷ ┯┯┯┯ ＡＴＧＣ ＴＡＣＧ ┷┷┷┷ ┯┯┯┯ ＡＴＧＣ ＴＡＣＧ ┷┷┷┷
替 换
┯┯┯┯ ＡＣＧＣ ＴＧＣＧ ┷┷┷┷
增 添
┯┯┯┯┯ ＡＴＡＧＣ ＴＡＴＣＧ ┷┷┷┷┷
mRNA 氨基酸
GAA CTT
GAA 谷氨酸 正常
突变
GTA CAT GUA 缬氨酸 异常
根本 _____原因
_____原因 直接
蛋白质
目录
与肿瘤相关的常见点突变
类型 生长因子 生长因子受体 基因 Sis, α-TGF, Erb (EGFR), HER2/neu,
细胞信号传导因子
转录因子 细胞周期因子 凋亡相关基因
重组DNA技术操作的主要步骤 载体
质粒 噬菌体 病毒
目的基因（外源基因）
基因组DNA cDNA 人工合成
PCR产物
开环载体DNA
限制酶消化 连接酶
目的基因
转化 体外包装，转染
重组体
带重组体的宿主
筛选
表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交
几种不同的蛋白表达系统
T7 promoter
Nco I (70)
临床基因扩增实验室检测 培训课程
基因突变重组 与检测技术
卫生部北京医院 肖飞
内容介绍
一、基因突变的产生与后果
二、基因重组技术 三、基因突变的检测方法
1. 分子杂交技术 2. 基因测序技术 3. 高通量基因测序技术
目录
遗传中心法则回顾
复 制
转录
翻译
逆转录
目录
第一节
基因突变的产生与后果
基因突变的种类 点突变 基因缺失 插入 基因异位或重排 表观遗传学
目录
基因重组—转位
转位：一个或 一组基因从一 处转到基因组 的另一个位置。
这些游动的基 因称为转位子 (transposon)。
目录
基因工程技术
基因工程(genetic engineering) —— 实现基
因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，
又称重组DNA工艺学。
酶
基本要素
目的基因 载体基因 宿主
目录
重组DNA技术中常用的工具酶-限制性核酸内切酶
定义 限制性核酸内切酶(restriction 围切割双链DNA的一类内切酶。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G + GATCC CCTAG G
endonuclease,
RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周
目录
命名
Hin dⅢ
髓细胞白血病
Inv(16):CBF - MYH11 t(8;22): AML - ETO t(9;22): BCR - ABL
目录
表观遗传学
1. 概念：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的
Hale Waihona Puke 表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。
2. 特征: (1)可遗传；(2) 可逆性；(3) DNA不变 3. 表观遗传学的现象：
Xma I (2820) Sma I (2822) Eco RI (2881)
Kan
Xho I (2567)
T7 terminator
2-micron ori
URA3 f1 ori
Amp+
T ADH1
Pac I (2185) Xho I (2195)
pUC ori T CYC1
Nhe I (9811)
(1) DNA甲基化 (2) 组蛋白修饰
(3) MicroRNA
(4) Genomic imprinting (5) 端粒酶
目录
表观遗传学——甲基化
目录
表观遗传学——组蛋白修饰
组蛋白（去）乙酰化 De/Acetylation 组蛋白甲基化 Methylation 组蛋白磷酸化 Phosphorylation 组蛋白泛素化 Ubiquitination
pESC-Ura
13413 bp
Fibrinogen Gamma Chain
哺乳细胞 表达系统
MFa
Kpn I (3702)
GPD Fibrinogen alpha chain MF alpha
Hin dIII (7711)
T CYC1
Spe I (4695) Bam HI (5284)
GPD
Bam HI (7029)
目录
基因重组—转化
转化： 由外来 DNA引 起生物 类型改 变的过 程称为 转化。
细菌的转化
目录
基因重组—转化
病毒癌基因 感染宿主细 胞后，可整 合到宿主染 色体上，从 而使宿主细 胞癌变。
转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体 内的过程。
目录
基因重组—转导
溶原菌中 DNA可以原样地切离出来， 也可以把邻近的宿主DNA在切离时带走 一部分。后者称转导。 带有宿主DNA的噬菌体称转导噬菌体。 来源于宿主的基因称转导基因。
组蛋白糖基化 ADP-Rybosilation
组蛋白与Swi/Snf复合体的结合 Swi/Snf complex, which, in vitro, uses the energy of ATP hydrolysis to disrupt histone-DNA interactions 多数化学修饰的化学基团可以减少组蛋白的正电性，从而使其与 DNA结合变疏松，使染色质结构发生变化。
目录
目的基因
1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第22章）
Fibrinogen Beta Chain MFa
Eco RI (6348)
6104 bp
Bax-ZF5 VP16
Xma I (1623) Sma I (1625)
RSF ori
CK-B
大肠杆菌 表达系统
Hin dIII (1741)
SV40 pA
Bst BI (3623) Pst I (3593) Bam HI (3583)
BGH reverse primer BGH pA f1 origin SV40 early promoter sGFP
目录
质粒 (plasmid)
特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某 些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
目录
载体
克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源DNA序列被扩增而特意
设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
AATTC G A TCTAG
AATTC G GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15º C
GAATTC CTTAAG AGATCT TCTAGA