基因突变的检测方法

基因突变的检测方法

基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。

PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。

异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。

突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。

变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR 产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程

而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。在DGGE的基础上，又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法（温度梯度凝胶电泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作也较简便，适合于大样本的检测筛选。

化学切割错配法（chemical cleavage of mismatch,CCM）CCM为在Maxam-Gilbert测序法的基础上发展的一项检测突变的技术，其检测突变的准确性可与DNA测序相仿。其基本原理为将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俣变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺或哌啶切割，错配的T能被四氧化饿切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变。该法检出率很高，也是检片段最长的方法，已有报功检测了片段，如果同时对正、反义链进行分析，检出率可达100％。应用荧光检测系统可增强敏感度，可检测到10个细胞中的1个突变细胞。该法中的化学试剂有毒，又发展了碳二亚胺检测法（catodiimide,CDI）,CDI为无毒物质，也可检测大片段DNA的点突变。

等位基因特异性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO） ASO为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR拉增的样品DNA

杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表运河样品中存在与该ASO探针相应的点突变，ASO需严格控制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。目前已有商品化的检测盒检测部分癌基因ASO突变。

DNA芯片技术（DNA chip） DNA芯片技术是90年代后发展的一项DNA分析新技术，它集合

了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术。可用于基因定位、DNA测序、物理图谱和遗传图谱的构建等。在基因突变检测方面DNA芯片也有广阔的前景，其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上，彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA发别与2块DNA 芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥非常重要的作用。

连接酶链反应（ligase chain reaction,LCR）与其他核酸扩增技术比较，其最大特点为可准确区分基因序列中单个基因突变，由Landegree于1988年首次应用于镰刀奖细胞贫血的分子诊断。LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5`-磷酸与另一相邻链3`-羟基连接为基础，应用两对互补的引物，双链DNA经加热变性后，两对引物分别与模板复性，若完全互补，则在连接酶的作用下，使相邻两引物的5`-磷酸与3`-羟基形成磷酸二酯二酯键而连接，前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板，如果配对的碱基存在突变则不能连接和扩增。LCR产物检测最初是通过这32p标记上游引物3`未端，经变性凝胶电泳分离后放射自显影加以鉴定，其检测敏感性达到200个靶分子。也可设计1个横跨两引物的检测探针，用它与LCR产物进行杂交检测。近年有应用荧光素、地高辛等非核素标记方法。Batt在1994年发展了一种更为简的方法，好微孔板夹心杂交法。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性，以及能检测单个碱基突变的能力，因此被应用于肿瘤基因突变的分子诊断，并与PCR结合用以提高其敏感性。

等位基因特异性扩增法（Allele-specific amplification,ASA）ASA于1989年建立，是PCR 技术应用的发展，也称扩增阻碍突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）、等位基因特性PCR（allele-specific PCR,ASPCR）等，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5`端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3`端引物进行两个平行PCR，吸有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3`端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。ARMS和ASPCR借鉴多重PCR原理，可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点。ASA法的检出率依赖于反应条件的优化和可能发生的引物与靶DNA有氏配时错配延伸，特别是当错配碱基为G：T时，这时可通过调整实验条件如引物靶DNA，Taq DNA 聚合酶的浓度等来得高瓜在特异性。在反应体系中加入甲酰胺也可减少非特异性扩增。还可通过在引物3`端的第二个碱基引入一个错配碱基，使之与模板之间形成双重错配以阻止错误延伸。