P53基因突变检测方法

2、试剂和耗材）
GIAGEN,德国QIAamp?DNA Blood Mini Kit （）Platiinim?Taq DNA Polymerase High Fidelity （Invitrogen, 11304-102 Nuclease-Free Water （Promega,P 1195）
d NTP Mix （Promega,P 151B）
PCR引物：北京博迈德科技有限公司合成
DL10000 DNA Marker（TAKARA,大连宝生物）DNA分子定量标准：技术Bioer 产物回收纯化试剂盒（BioSpiii Gel Extraction kit,日本PCR有限公司）公司）
Axygen, 200-1000 ul 吸头（美国110.5〜10 u、2〜20 u k 20-200 □、管EP、
仪.器3 ；Taimon1600R凝胶成像系统分析仪（上海天龙公司）Eppendorf 5417R 高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）公司，美国）Allegra 6R离心机（Beckman-Coulter应涡旋混合器（北京北德科学仪器厂）MVS-1公司，德国）
1000 u 150 口1、200 ul、（Eppendorf^ 口1 移液器、10 U 1、NEWAIR 公司，美国）1【级生物安全柜NU425-400E （拓速冷冻离心机（BECKMAN COULTER 公司，美国）X-15R 公司德国）仪（Eppendorf Eppendorf Masteicycter PCR 公司，美国）（Bio-Rad电泳仪：Universal 024BR电热恒温水浴器（北京来亨科贸有限责任公司）240全自动凝胶成像系统（中国）凝胶成像分析系统：Tocan 测序仪：GenomeLab CEQ/GeXP （BECKMAN COULTER 公司，美国）20 u k 200 ul和1000 ul加样器（吉尔森公司，法国）旋涡震荡器（Scientific Industries公司，美国）
二、实验方法
1、样品采集，送检和保存
乙二胺四乙酸（EDTA） -3K抗凝管采集HIV和HEV合并感染者外周静脉血，于24h内测定CD4+T淋巴细胞计•数，抗凝血经常规离心分离全血中间层，分装后-80°C冻存用于P53基因变异的测定。

2、血浆样本DNA的提取
取200 P1全血中间层于1.5ml无菌EP管中，加入20 口1蛋白酶K；再加入200 ul AL缓冲液，涡旋振荡15秒，56°C孵育10分钟；瞬时离心EP管，加入200 u 1 无
水乙醇，涡旋振荡15秒，再瞬时离心收集管壁残液；将上述混合液加入到QIAMP 离心柱中，6000g离心1分钟，弄去含废液的收集管，更换新的废液收集管，注意不要让离心柱沾染废液；离心柱中加入500 口1缓冲液AW1, 6000g 离心1分钟，弃去含废液的收集管，更换新的废液收集管；离心柱中加入500 u 1缓冲液AW2, 20000g离心3分钟，弃去含废液的收集管，更换新的废液收集管；20000g离心1分钟，弃去含废液的收集管，将离心柱插入1.5ml无菌EP 管中，在离心柱中加入200 U1洗脱液AE （事先预热至70 °C）,室温孵育1分钟后，6000g离心1分钟，EP管中收集的即为LI标DNA； 0.7%TAE-琼脂糖凝胶电泳，验证DNA提取质量,-209保存备用。

3、PCR扩增P53序列
使用引物如下： ------------------------------------------
核昔酸组成名称方向------------------------------------------ Primeil
外侧 5 cttgccacaggtctccccaa Prillier23,外侧aggggtcagaggcaagcaga
反应体系（50ul）
体积（）组分1 »
5 10XPCR 反应缓冲液5 2.5niM) dNTP (1 Primer 1-fonvard (20uM )
1 Primer2-re-\xrse (20uM )
0.5 1) Promega Taq (5U/ u 32.5 DNase/RNase free water
5 DNA提取的50
Total volume
28秒，延伸90秒，55°C退火30秒，72°C PCR反应条件：95°C变性30个循环；
反应产物纯化、PCR440 100V电泳0.5 u g/nil） , ul进行1%琼脂糖凝胶电泳（含澳化乙噪5取终产物min,经Ulha-Violet Product凝胶成像后与marker比对，确认所需片段25 Obp,用QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒纯化基因片段。

5、PCR反应产物测序
将PCR反应产物切胶回收，使用BECKMAN公司的GEXP系统测疗：GenomeLab CEQ/GeXr遗传分析系统测序分析实验步骤:
b配置测序PCR反应试剂:
总体积20ul lOul
纯水(补足至总体积)0-9.5ul O-3.5ul
模板(用量见附0.5-10ul A.5-4ul
引物(5pmol/ul) lul lul
DTCS Mix Sul 4ul
质粒DNA模板的热处理:(线性ONA模板，如果为PCR产物无需加热)；在热循环仪上加
热DNA模板和水:96° C l-3Min；自然凉到室温后再加入其它组分；
2、热循环反应，程序如下：
1、96° C 20sec
2.50° C 20sec
3^ 60° C 4min Back to step 1, for 30 cycles・
4.4° C Holding
3、终止反应
a,按照NaOAC： EDTA： Glycogen = 1： 1： 0.5准备测丿爭反应终止液(即用即配，低温放置):
b,取出测序反应产物，稍微离心：按照2.5ul/10ul向测序反应产物加入反应终上液。

4、乙醇沉淀
a.每个反应管中加入30ul95%冰乙醇/10ul Reaction；轻混匀，离心(4° C, UOOOicf,
15min),去上清：
b.加innul 70%冰乙醇洗脱残留盐，离心(4° C, 12000rcf, 5min).去上淸；
c.再次加100ul 70%冰乙醇洗脱残留的盐,离心(4。

C, 12000rcf, 5min),去上清:
d.低速离心ins,用Tip头吸干残留液体，37° C避光干燥，3〜5 Min。

e.在每个样品管中加入20ul SLS,反复吹打DNA沉淀(10-20次)，静置3min，稍微离心;
5、CEQ上样
a.小心转移样品至CEQ样品板(不要出现气泡)，加•滴石蜡油覆盖样品：
b.在缓冲液板孔内加入3/4体积的测序缓冲液；
上机进行测序反应
ABI 3500 测序
一、实验试剂和耗材准备：
(―)实验试剂：纯化好的PCR产物，测序引物,Bigdye v3. 1, ddHO, P0P7= 胶，
Sequence Standard(3130), 5X Buffer, HiDi
(二)实验耗材：96孔板，0. 2EP管，移液枪，计时器，记号笔
二、实验操作具体步骤：
(―)测序反应体系(标准)：
DNA (35ng/ul) 6ul
引物(20pmol/ul) lul
ddHO 8ul :Bigdye 2ul
5 X Buffer 3ul
总体积20ul
测序PCR循环条件：
96°C1 min
(96°C lOsec, 50°C5sec, 60°C4min) x25 循环
4°C保温
(二)测序产物纯化(酒精/EDTA法纯化)：
1每管加入5 ul 125mM EDTA,加到管底；
2加入60U1100%酒精，封严，震荡4次,室温放置15min;
3 3000g 4°C离心30min,马上倒置96孔板，185g离心lmin;
4加入60ul70%酒精,3000g4°C离心lbmin,马上倒置96孔板，185g离心lmin；570%酒精重复洗涤1次或2次；
6让残余的酒精在室温挥发干，加入10ul Hi-Di屮酰胺，95°C变性4min,迅速置冰上4min,上样电泳。

6、基因测序分析
、统计学处理7
软件进行统计软件编制录入数据库，应用PASW Statistics 18.0采用Epidata学分
析。

P53突变点agt ）后的编码了•为agg,突变变成Ser野生型p53 249 Arg的编码了为gactgtacca ccatccacta caactacatg tgtaacagtt cctgcatggg cggcatgaac
ccca tcctcaccat catcacactg gaagactcca ggtcaggagc cacttgccac agK 16201 egg 16261 cctgcacact ggcctgctgt gccccagcct ctgcttgcct ctgacccct。