第9章__蛋白质工程中的基因突变方法
蛋白质工程试题
蛋白质工程试题1.蛋白质分子的构型与构象构型：是分子中原子的特定空间排布。
当构型相互转变时，必须有共价键的断裂和重新形成。
基本构型有L-型和D型两种。
这种构型无法通过单键的旋转相互转换。
构象:是组成分子的原子或基团围绕单键旋转而成的不同空间排布，构象的转换不要求有共价键的断裂和重新形成,在化学上难以区分和分离。
2.内核假设原理所谓内核是指蛋白质在大自然的进化中形成的保守内部区域。
这样的区域一般由氢键连接而成的二级结构单元组成。
内核假设原理就是所有蛋白质的折叠形式主要决定于其内核中残基的相互作用和组织形式。
遵循这样的内核原理意味着蛋白质工程无法创造出超越天然蛋白质所具有二级结构的新蛋白质二级结构。
3. van't Hoff焓平衡常数与焓/熵的关系式为：－RT lnK = △H - T△S。
取对数可以变为： lnK = －△H/RT + △S/R。
进一步推导可以变为：d（lnK）/d（1/T）= －△H/R。
基于此，以lnK对1/T可以得到一条曲线。
在这条曲线上任何一点的斜率就是△H/R，其中的△H称为van't Hoff焓。
通过解析van't Hoff焓随温度变化的曲线特点，可以用于测定蛋白质体系构象平衡的转变，主要是两态转变模型的分析。
也就是通过这样的曲线分析，可以预测蛋白质天然构象退在折叠时的容易程度。
4. 盒式突变法也称为片断取代法（DNA fragment replacement）。
这一方法的要点是利用目标基因中具有的适当的限制性酶切位点，用具有任何长度、任何序列的DNA片断来置换或者取代目标基因上的一段DNA序列。
5、熔球态在折叠途径中第一个可以观测到的中间体是柔性无序的为折叠多肽链卷折成局部有组织的球状体，称为熔球体melton globule。
熔球体具有天然态的大多数二级结构，但不如天然结构致密，蛋白质内部的密堆积相互作用尚未形成，环肽区和表面结构多数处于未折叠状态，侧链可以活动。
蛋白突变体制备
蛋白突变体制备随着生物技术的不断发展，蛋白质工程已经成为了一种重要的技术手段。
蛋白质工程的主要目的是通过改变蛋白质的结构和功能，使其具有更好的性能。
其中，蛋白突变是一种常用的蛋白质工程方法。
蛋白突变是指通过改变蛋白质的氨基酸序列，使其产生新的结构和性质。
蛋白突变可以通过多种方法实现，包括基因工程，化学合成和光化学方法等。
其中，基因工程是最常用的方法之一。
基因工程是指通过改变基因序列，使细胞产生新的蛋白质。
基因工程可以通过多种方法实现，包括PCR扩增，限制性内切酶切割和连接等。
基因工程的主要优点是可以精确地控制蛋白质的氨基酸序列，从而实现对蛋白质结构和性质的改变。
基因工程的具体步骤包括：1.设计突变体的氨基酸序列在进行蛋白突变之前，需要先设计突变体的氨基酸序列。
可以通过多种方法实现，包括计算机模拟，结构比较和随机突变等。
2.克隆突变体基因将设计好的突变体氨基酸序列克隆到适当的载体上。
适当的载体可以是质粒或病毒。
克隆过程需要使用PCR扩增和限制性内切酶切割等技术。
3.表达突变体将克隆好的突变体基因转化到表达宿主中，如大肠杆菌等。
表达宿主需要具有高效的转化能力和适当的表达条件。
4.纯化突变体通过多种方法纯化突变体，包括离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析等。
纯化突变体需要具有高纯度和高活性。
蛋白突变的应用蛋白突变可以应用于多种领域，包括药物研发，生物技术和工业生产等。
以下是一些蛋白突变的应用实例。
1.药物研发蛋白突变可以用于药物研发，包括药物设计和药物筛选等。
例如，通过蛋白突变可以改变药物的亲和力和特异性，从而提高药物的疗效和减少副作用。
2.生物技术蛋白突变可以用于生物技术，包括酶工程和抗体工程等。
例如，通过蛋白突变可以改变酶的催化活性和特异性，从而提高酶的效率和特异性。
3.工业生产蛋白突变可以用于工业生产，包括食品加工和化学工业等。
例如，通过蛋白突变可以改变食品的口感和营养价值，从而提高食品的品质和竞争力。
蛋白质工程定向进化
蛋白质工程定向进化一、前言蛋白质是生命体系中最基本的分子之一，也是生物学研究的重要对象。
随着现代生物技术的不断发展，蛋白质工程技术也得到了快速发展。
其中，蛋白质工程定向进化技术是一种重要的手段，可以用于改良蛋白质性质或者合成新的功能性蛋白质。
本文将对蛋白质工程定向进化技术进行详细介绍。
二、蛋白质工程定向进化技术概述1. 蛋白质工程简介蛋白质工程是指通过人为设计和改造来改变蛋白质的结构和功能，以满足特定需求的一种技术。
它主要包括两个方面：基因重组技术和突变策略。
基因重组技术主要通过DNA重组来改变目标基因序列从而实现目标蛋白表达；突变策略则主要通过引入突变来改变目标蛋白的结构和功能。
2. 定向进化简介定向进化（Directed Evolution）是一种利用自然选择原理加速分子优化的方法。
它通过在大量变异体中筛选出具有所需性质的分子，进而实现对分子性质的改良和优化。
定向进化可以应用于各种生物分子，如蛋白质、核酸等。
3. 蛋白质工程定向进化技术蛋白质工程定向进化技术是将蛋白质工程和定向进化结合起来的一种手段。
它通过引入随机突变和筛选来改变目标蛋白的结构和功能，从而实现对目标蛋白性质的改良和优化。
三、蛋白质工程定向进化技术原理1. 随机突变随机突变是指在目标基因序列中引入随机变异，使得产生大量具有不同性状的突变体。
随机突变可以通过多种方式实现，如自然突变、PCR扩增等。
2. 筛选筛选是指在大量随机突变体中选择具有所需性状的分子。
筛选方法包括：基于酶活性或者细胞生存能力等可测量特征进行筛选；利用选择压力诱导所需特征表达等。
3. 重复迭代重复迭代是指不断进行随机突变和筛选，以逐步优化分子性状。
这个过程需要进行多次，每一轮都会产生新的突变体，进而实现对分子性质的改良和优化。
四、蛋白质工程定向进化技术应用1. 蛋白质结构优化蛋白质工程定向进化技术可以用于优化蛋白质结构，从而提高其稳定性和活性。
例如，通过引入突变来改变酶的催化活性中心的位置和大小，从而提高酶的催化效率。
使用基因工程技术进行蛋白质工程的基本步骤
使用基因工程技术进行蛋白质工程的基本步骤蛋白质工程是一种广泛应用于生物技术领域的技术手段，通过对蛋白质的结构和功能进行改造和优化，从而实现对蛋白质的改良。
基因工程技术在蛋白质工程中发挥着重要的作用，为我们提供了一种有效的手段来进行蛋白质的改造。
基因工程技术通常依赖于重组DNA技术，通过将特定的基因片段插入到宿主细胞的染色体中，使得宿主细胞能够产生目标蛋白质。
下面将介绍使用基因工程技术进行蛋白质工程的基本步骤。
第一步是蛋白质工程的目标确定。
在蛋白质工程中，我们需要明确要改造的目标蛋白质。
这包括选择合适的蛋白质基因、确定改造的目的以及预期的效果。
目标蛋白质可以是从天然来源中获取的，也可以是人工设计的。
第二步是基因克隆。
基因工程技术中的基因克隆是一项关键步骤，它涉及到从天然来源中提取目标基因，并将其插入到适当的载体中。
常用的载体包括质粒和病毒。
一旦目标基因被插入载体中，它们可以被引入宿主细胞。
第三步是转染和表达。
转染是将重组DNA传递到宿主细胞中的过程，常用的方法包括电穿孔、化学转化和病毒介导的转染。
一旦目标基因被成功转入宿主细胞，我们可以通过诱导宿主细胞表达目标蛋白质。
第四步是蛋白质纯化和分析。
一旦目标蛋白质被宿主细胞表达，我们需要对其进行纯化和分析。
蛋白质纯化是将目标蛋白质从其他细胞组分中提取出来的过程，常用的方法包括柱层析、电泳和过滤。
纯化后，目标蛋白质可以通过质谱、动态光散射和圆二色光谱等方法进行分析。
第五步是蛋白质改造和优化。
蛋白质工程的关键目标是改造和优化蛋白质的结构和功能。
这可以通过点突变、插入、缺失或循环重排等方法来实现。
改造后的蛋白质可以进一步进行表达和分析。
最后一步是功能验证和应用。
改造后的蛋白质需要进行进一步的功能验证和应用。
这包括通过生物学活性测定、结构分析和生物学特性评估等方法来验证改造后蛋白质的功能以及适用性。
总的来说，使用基因工程技术进行蛋白质工程的基本步骤包括目标确定、基因克隆、转染和表达、蛋白质纯化和分析、蛋白质改造和优化，以及功能验证和应用。
蛋白质工程的过程
蛋白质工程的过程介绍蛋白质工程是一项将现有蛋白质进行改造或者设计全新蛋白质的技术。
通过蛋白质工程，可以改善蛋白质的功能、稳定性、表达效率等特性，为生物学研究、医药开发和工业生产等领域提供了极大的帮助。
蛋白质工程的目的蛋白质工程的主要目的是通过改变蛋白质的氨基酸序列来赋予其新的功能或改善其已有的功能。
具体而言，蛋白质工程可以实现以下几个目标：1.改善蛋白质的稳定性：通过改变蛋白质的氨基酸序列，可以增加其对热、酸、碱等环境条件的稳定性，从而延长其在应用过程中的寿命。
2.提高蛋白质的表达效率：通过优化蛋白质的基因序列，可以提高其在宿主细胞中的表达效率，从而增加蛋白质的产量。
3.改善蛋白质的功能：通过改变蛋白质的氨基酸序列，可以赋予其新的功能，例如增强其酶活性、结合能力等。
蛋白质工程的方法1. 随机突变随机突变是一种常用的蛋白质工程方法。
通过引入随机突变，可以改变蛋白质的氨基酸序列，从而改变其功能或性质。
随机突变可以通过多种方法实现，例如化学突变剂诱导、PCR扩增时出错等。
2. 有序突变与随机突变相比，有序突变是一种更为定向的蛋白质工程方法。
通过有序突变，可以在特定位置上引入特定的氨基酸，从而实现对蛋白质性质的改变。
有序突变通常依赖于现有的蛋白质结构信息，可以利用计算方法进行蛋白质设计和模拟，预测突变后的蛋白质结构和性质。
3. 重组蛋白质重组蛋白质是一种将多个不同蛋白质的结构域或功能域进行重组的方法。
通过将具有不同功能的蛋白质进行重组，可以构建出新的蛋白质，同时继承了原始蛋白质的有益性质。
4. 蛋白质设计蛋白质设计是一种全新的蛋白质工程方法。
通过理论计算和实验验证，可以将氨基酸序列进行合理设计，从而构建出具有特定功能的全新蛋白质。
蛋白质设计的目标是通过合理的构建和设计，打造出具有高效率和高稳定性的蛋白质。
蛋白质工程的应用领域1.生物学研究：蛋白质工程为生物学研究提供了重要工具。
通过改变蛋白质的性质，可以揭示其在生物过程中的功能和作用机制。
蛋白质工程
蛋白质工程一、名词解释：1.蛋白质工程:是研究蛋白质结构和定点改造蛋白质结构的一门学科。
它运用基因工程手段，通过有控制的基因修饰和基因合成，对现有蛋白质进行定向改造，以期获得性能更加优良、更符合人类社会需要的蛋白质分子。
2. 抗体:指机体的免疫系统在抗原刺激下产生的可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
3. 人-鼠嵌合抗体：用鼠可变区和人恒定区融合形成的抗体。
4.人源化抗体：将鼠杂交瘤抗体的超变区嫁接到人抗体上形成的抗体。
5. 一级结构：是多肽链中氨基酸残基从N-末端到C-末端的排列顺序及二硫键的位置。
6.二级结构：是指多肽链主链借助氢键排列成特有的规则的反复构象。
7.超二级结构（结构模体）：一级顺序上相邻的二级结构在三维折叠中，彼此靠近、按特定的几何排布形成排列规则的、在空间结构上可以辨认的、可以同一结构模式出现在不同蛋白质中的二级结构组合体，称为结构模体。
8.发夹式β模体（或ββ组合单位）：两段相邻的反平行β链被一环链连接在一起构成的组合单位，其形貌与发夹相似，称为发夹式β模体。
9.希腊钥匙模体：四段紧邻的反平行β链以特定的方式来回往复组合，其形貌类似于古希腊钥匙上特有的回形装饰纹，故称为希腊钥匙型模体。
11.结构域：二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为结构域。
12.三级结构：在二级结构、结构模体的基础上，进一步盘曲、折叠形成的，涉及主链、侧链在内的所有原子和基团的空间排布。
13.四级结构：是指在多条肽链组成的一个蛋白质分子中，各亚单位在寡聚蛋白质中的空间排布及亚单位间的互相作用。
14.优势构象：任何氨基酸侧链中的组成基团都可以绕着其间的C-C单键旋转，从而产生各种不同的构象。
AA分子的各种构象异构体并不是平均分布的, 总是以其最稳定的构象为重要的存在形式即为优势构象。
15.交错构象：是能量上最有利的排布，在这种构象中，一个碳原子的取代基正好处在另一个碳原子的两个取代基之间。
基因工程技术在蛋白质研究中的创新应用方法
基因工程技术在蛋白质研究中的创新应用方法蛋白质作为细胞的基本生物大分子，承担着各种重要的生物学功能。
在过去的几十年中，基因工程技术已经在蛋白质研究领域展现出了巨大的创新潜力。
通过基因工程技术，科学家们能够改变蛋白质的结构和功能，以及开发全新的蛋白质，从而为生物学研究和医学应用带来了许多突破性进展。
首先，基因工程技术在蛋白质研究中的创新应用方法之一是基因克隆和表达。
通过将感兴趣的蛋白质编码基因克隆到表达载体中，并在宿主细胞中高效地表达，科学家们能够大量获得特定蛋白质。
这一技术被广泛应用于蛋白质纯化和结构研究，为了进一步了解蛋白质的结构和功能。
其次，基因工程技术在蛋白质研究中的另一个创新应用方法是定点突变。
通过基因工程技术，科学家们可以在特定的氨基酸位点上改变蛋白质的氨基酸序列，从而研究该位点对蛋白质功能的影响。
通过引入突变，科学家们可以评估蛋白质的结构稳定性、催化活性、配体结合亲和力等特性。
这种方法为蛋白质工程和药物设计提供了关键的信息。
另外，基因工程技术还可以用于蛋白质亚细胞定位和蛋白质相互作用的研究。
通过将荧光蛋白等标记蛋白的编码基因融合到感兴趣的蛋白质基因中，科学家们可以追踪和观察蛋白质在细胞中的分布和运动。
这种方法有助于揭示蛋白质在细胞中的功能定位和相互作用网络，为生物学研究提供了有力的工具。
此外，基因工程技术还为蛋白质工程和新药开发提供了创新的策略。
通过基因工程技术，科学家们可以设计和合成新的蛋白质，例如抗体和酶。
这些蛋白质具有特定的功能和药物潜力，可以用于治疗癌症、自身免疫病等疾病。
此外，基因工程技术还可以用于优化蛋白质的表达和产量，提高生产效率。
总结起来，基因工程技术在蛋白质研究中的创新应用方法包括基因克隆和表达、定点突变、蛋白质亚细胞定位以及蛋白质工程和药物开发。
这些技术为研究蛋白质的结构、功能以及开发新的蛋白质药物提供了有力的工具和方法。
随着技术的不断进步和创新，基因工程技术在蛋白质研究领域的应用前景将会更加广阔。
《蛋白质工程》课件
生物医学
蛋白质工程可用于研究 和治疗疾病，例如设计 和优化抗体、酶和细胞
因子等。
农业与食品工业
蛋白质工程可用于改良 农作物和食品品质，提
高产量和营养价值。
环保与能源领域
蛋白质工程可用于设计 和优化微生物，以实现 废物处理、生物燃料生
产等目标。
CHAPTER 02
蛋白质的结构与功能
蛋白质的一级结构
重要性
功能域和活性位点是理解蛋白质功能的关键，对蛋白质工程和药物 设计具有重要意义。
影响因素
功能域和活性位点的形成受一级结构、二级结构和高级结构的影响 ，同时与蛋白质与其他分子的相互作用有关。
CHAPTER 03
蛋白质工程的遗传操作
基因突变技术
随机突变
01
通过化学诱变、物理诱变等方法在基因序列中引入随机突变，
定义
蛋白质的二级结构是指局部主链的折叠方式，常见的二级结构包括 α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等。
重要性
二级结构是构成蛋白质三级结构的重要基础，对蛋白质的功能具有 重要影响。
影响因素
二级结构的形成受一级结构的影响，同时与蛋白质所处的环境条件有 关。
蛋白质的高级结构
定义
蛋白质的高级结构是指整条肽链 中不同二级结构的组合方式，包 括蛋白质的构象、亚基聚合方式 以及与其他分子间的相互作用等
通路分析
通过分析蛋白质在生物体内的相互作用网络，揭示其在信号转导、代谢等通路中的作用，为药物研发 和疾病治疗提供靶点。
CHAPTER 05
蛋白质工程的实验技术
蛋白质的分离与纯化
蛋白质的分离与纯化是蛋白质工程实 验技术的关键步骤之一，其目的是将 目标蛋白质从复杂的生物样本中分离 出来，并提高其纯度。
蛋白质工程详细介绍蛋白质工程的方法和应用
蛋白质工程详细介绍蛋白质工程的方法和应用蛋白质工程详细介绍蛋白质工程是一种利用分子生物学和蛋白质化学的方法，对蛋白质进行定向的修饰和改造，以获得理想的蛋白质产物。
它的发展为生物药物研发和产业化提供了重要的技术支持，也为基因工程、农业生物技术等领域的发展带来了巨大的机遇。
本文将详细介绍蛋白质工程的方法和应用。
一、蛋白质工程的方法蛋白质工程的方法包括：1. 重组蛋白质表达系统：通过将目标蛋白质基因导入到适当的宿主细胞中，利用细胞的代谢途径合成目标蛋白质。
2. DNA重组技术：改变目标蛋白质的基因序列，以改变其结构和功能。
3. 非天然氨基酸插入：在蛋白质序列中插入非天然的氨基酸，改变蛋白质的性质。
4. 点突变：通过改变蛋白质特定氨基酸的编码，改变蛋白质的结构和功能。
5. 蛋白质折叠机理研究：通过研究蛋白质的二级、三级结构以及其折叠机理，为蛋白质工程提供理论基础。
二、蛋白质工程的应用蛋白质工程在许多领域有着广泛的应用，下面将介绍其中几个主要方面。
1. 生物药物蛋白质工程为生物药物的研发和产业化提供了关键技术。
通过工程改造，可以改善生物药物的稳定性、生物活性和药效持续时间等性质，提高其疗效和安全性。
蛋白质工程还可以生产重组蛋白、抗体和疫苗等生物药物，为疾病治疗提供新的手段。
2. 农业生物技术蛋白质工程在农业生物技术领域的应用主要包括转基因植物和转基因动物的产生。
通过引入外源基因，可以使植物和动物表达陌生蛋白，以改善农业产量、品质和抗逆性等特性。
蛋白质工程还可以改善植物和动物的饲料价值，提高畜禽养殖的效益。
3. 工业酶蛋白质工程在酶工业生产中有着重要的应用。
通过工程修饰，可以提高酶的催化效率、热稳定性和耐受性，从而降低生产成本，提高工业酶的使用效果。
蛋白质工程还可以创造新的工业酶，满足不同生产过程中对酶的需求。
4. 蛋白质结构与功能研究蛋白质工程在研究蛋白质结构和功能方面起到至关重要的作用。
通过蛋白质工程技术，可以合成具有特定功能的人工蛋白，深入研究蛋白质的结构与功能之间的关系。
【完美打印稿】生物奥赛遗传第九章 基因突变
第九章基因突变基因突变（gene mutation）是指染色体上的某一位点发生了化学变化，也称为点突变（point mutation），它通常可引起一定的表型变化。
广义的突变包括染色体畸变和基因突变，狭义的突变专指点基因突变。
实际上微小的染色体崎变和点突变界限并不明确。
基因突变的发生和DNA复制、DNA损伤修复、癌变和衰老都有关系，它也是生物进化的重要途径。
第一节基因突变的概述一、基因突变的概念和形成的原因1．基因突变的概念基因突变首先由T. H. Mangan（1910）等在果蝇中发现并肯定的，到1927年H. J. Mu1ler和1928年L. J. Stadler分别用X射线照射果蝇和玉米，最先诱发了突变。
基因突变是DNA分子上微小的改变，它是由于碱基的替换、增添、缺失造成的。
基因突变既可在自然界自发产生，即自发突变（spontaneous mutation），也可人为地施加物理或化学因素诱发产生，即诱发突变（induced mutation）。
一般情况下，染色体结构变异可用细胞学方法进行鉴定（如缺失环、重复环等），而且难以发生回复突变；基因突变不能在光学显微镜下观察，只能借助子代的分离比检测出来，而且具有可逆性，能发生回复突变，即基因可发生A→a，也可发生a→A。
2．自发突变的机制现已知引起自发突变原因主要有：（1）外界环境的影响：自然界中的各种射线（如宇宙中短波幅射、土壤中放射性元素等）都会引起基因突变。
但由于宇宙射线在到达地球前被大气层基本消耗了，因此作用不大。
温度的剧烈变化是另一种诱变因素。
有人曾认为温度骤变是还阳参Crepis自发突变的原因。
一般情况下，突变率随温度的升高而增加。
（2）生物自身产生的诱变物质的作用：在用H2O2处理生物时，加入过氧化氢酶可以降低诱变作用，如果同时再加入氰化钾（KCN）则诱变作用大幅度提高，这是因为KCN是过氧化氢酶的抑制剂。
而生物体内在代谢的过程中，经常要产生一些中间产物，如过氧化物。
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3.鸟枪合成突变法 鸟枪合成突变法
用这种方法,可在基因的一个很大 用这种方法 可在基因的一个很大 区域中同时引入多种突变. 区域中同时引入多种突变 首先将这一区域的基因序列分解成 若干可互相黏结的片段,然后合成各种 若干可互相黏结的片段 然后合成各种 所需突变的寡核苷酸,将这些寡核苷酸 所需突变的寡核苷酸 将这些寡核苷酸 与目的基因双链一起退火.一次连接即 与目的基因双链一起退火 一次连接即 得到含各种突变的基因大段序列. 得到含各种突变的基因大段序列
正 链 负链
错配部位
5)将此闭环双链 将此闭环双链DNA纯化 纯化. 将此闭环双链 纯化 6)将纯化的双链闭环 将纯化的双链闭环DNA用大肠杆菌进 用大肠杆菌进 将纯化的双链闭环 行转化,复制 其复制转化产物中含有所 行转化 复制,其复制转化产物中含有所 复制 需的突变基因. 需的突变基因
正链 负链
1.经典的寡核苷酸诱导的定点突变 经典的寡核苷酸诱导的定点突变
大体步骤: 大体步骤 1) 制备含有目的基因 即欲突变的基因) 制备含有目的基因(即欲突变的基因 目的基因 即欲突变的基因 的单链DNA(简称正链). 的单链 简称正链 简称正链
目的基因(正链) 目的基因(正链) 正链
突变点
2) 合成含有所需要突变序列的寡核苷酸引物 这种 合成含有所需要突变序列的寡核苷酸引物.这种 引物中间部分是所需突变序列,与目的基因的欲 引物中间部分是所需突变序列 与目的基因的欲 突变部位错配.其两端部分是互补区 其两端部分是互补区. 突变部位错配 其两端部分是互补区
带有目的基因 寡核苷酸 的DNA
置换后的DNA 置换后的
置换出来的 片段
1. 盒突变
盒突变是这类方法的代表. 盒突变是这类方法的代表 所谓盒,就是指与目的基因的欲突 所谓盒 就是指与目的基因的欲突 变部位相应的、 变部位相应的、由化学合成的一系列 双链寡核苷酸。 双链寡核苷酸。这一系列双链寡核苷 酸可能带有各种可能选用的突变系列。 酸可能带有各种可能选用的突变系列。 当进行突变处理时， 当进行突变处理时，根据实际需要把 各种突变盒插入目的基因中， 各种突变盒插入目的基因中，就象把 盒式录音带插入录音机一样。 盒式录音带插入录音机一样。
破坏嘧啶) 肼(破坏嘧啶 破坏嘧啶
在溴乙啶存在下,限制性酶只切断 在溴乙啶存在下 限制性酶只切断 双链中一条链,在基因中形成单链缺口 在基因中形成单链缺口, 双链中一条链 在基因中形成单链缺口 再用核酸酶稍加扩大缺口,然后采用限 再用核酸酶稍加扩大缺口 然后采用限 制底物(只供应三种或两种核苷酸 只供应三种或两种核苷酸)或 制底物 只供应三种或两种核苷酸 或 用硫取代核苷酸底物的方法,让其 用硫取代核苷酸底物的方法 让其 DNA聚合酶填补缺口 此过程有可能 聚合酶填补缺口,此过程有可能 聚合酶填补缺口 出现错误掺入,从而造成非定点突变 从而造成非定点突变. 出现错误掺入 从而造成非定点突变
带有目的 基因的 DNA
多种寡核苷 酸
置换后的 DNA
置换出来的 片段
2. TAB突变 突变
向目的基因中原有的某些限制 位点处插入多种六核苷酸系列(相当 位点处插入多种六核苷酸系列 相当 于二氨基酸密码子,TAB就是 就是two 于二氨基酸密码子 就是 amino acid bases的意思 在蛋白质 的意思),在蛋白质 的意思 的某些部位插入2个氨基酸 个氨基酸,并不会 的某些部位插入 个氨基酸 并不会 很大地影响立体结构,但却可以影响 很大地影响立体结构 但却可以影响 其功能. 其功能 目前,大量的六核苷酸序列已经 目前 大量的六核苷酸序列已经 商品化. 商品化
（二）寡核苷酸置换的定点突变
上述的寡核苷酸诱导的定点突变只 适用于将蛋白质中的某一氨基酸转变 为预定的另一种氨基酸。 为预定的另一种氨基酸。但如果事先 不能确定转变产物， 不能确定转变产物，需要将每一种可 能的代替氨基酸逐一实验的时候， 能的代替氨基酸逐一实验的时候，就 要求同时进入某一点的多种突变。 要求同时进入某一点的多种突变。 适合这类要求的突变方法， 适合这类要求的突变方法，就是 寡核苷酸置换的定点突变法。 寡核苷酸置换的定点突变法。
ห้องสมุดไป่ตู้
优点
1).可以精确地在基因的预定位置导入任 可以精确地在基因的预定位置导入任 何所需要的突变,并有有效的筛选手段 何所需要的突变 并有有效的筛选手段 可以取得突变基因. 可以取得突变基因 2).对目的基因本身的结构没有任何要求 对目的基因本身的结构没有任何要求, 对目的基因本身的结构没有任何要求 可以直接地用于各种需要突变的基因. 可以直接地用于各种需要突变的基因 3).此法步骤简单 技术成熟 在蛋白质工 此法步骤简单,技术成熟 此法步骤简单 技术成熟,在蛋白质工 程研究中得到广泛的应用. 程研究中得到广泛的应用
按照突变引入的方式， 按照突变引入的方式，定点突 变又可以分为寡核苷酸诱导的定点 变又可以分为寡核苷酸诱导的定点 突变和寡核苷酸置换的定点突变两 突变和寡核苷酸置换的定点突变两 大类。 大类。 （一）寡核苷酸诱导的定点突变 这是一种非常重要的突变方法， 这是一种非常重要的突变方法， 技术非常成熟。 技术非常成熟。
第九章 蛋白质工程中的 基因突变方法学
蛋白质工程的长远目标是创造人们 需要的各种性能优越的人造蛋白质。 需要的各种性能优越的人造蛋白质。 而在目前阶段， 而在目前阶段，则以通过基因突变制 取天然蛋白质的各种人工产物为主。 取天然蛋白质的各种人工产物为主。 蛋白质工程使用的基因突变全部 属于体外突变。按照它们对突变位点 属于体外突变。 确定的程度，可以大致分为定点突变 确定的程度， 和非定点突变两大类。 和非定点突变两大类。
正链
负链
经突变后的目的基因
7) 将复制的混合物分离提纯 测定突变 将复制的混合物分离提纯,测定突变 部位的序列.与预定序列比较 与预定序列比较,符合者 部位的序列 与预定序列比较 符合者 即是所要求的突变基因. 即是所要求的突变基因 8)将符合的突变双链放进寄主细胞进 将符合的突变双链放进寄主细胞进 行表达,合成相应的蛋白质 行表达 合成相应的蛋白质. 合成相应的蛋白质
一. 定点突变
定点突变是对已知序列的基因 或 定点突变是对已知序列的基因(或 是对已知序列的基因 DNA)中任意指定位置进行突变的技 中任意指定位置进行突变的技 其中包括核苷酸的置换、 术.其中包括核苷酸的置换、插入、或 其中包括核苷酸的置换 插入、 删除。 删除。 在蛋白质工程中， 在蛋白质工程中，这项技术主要 应用在需要突变的氨基酸位置可以预 先确定的场合。 先确定的场合。
2. 化学诱变产生非定点突变
化学诱变剂在体内和体外都可以 产生非定点突变: 产生非定点突变 亚硝酸(引起脱氨 引起脱氨) A I 亚硝酸 引起脱氨 G X C U 甲酸(脱嘌呤 脱嘌呤) A N 甲酸 脱嘌呤 G N
C N T N C U 亚硫酸氢钠 用这些试剂处理目的基因,就可 用这些试剂处理目的基因 就可 以发生碱基转变,引起多位点突变 引起多位点突变. 以发生碱基转变 引起多位点突变
2)设法使合成的 设法使合成的DNA双链中 不带突变 双链中,不带突变 设法使合成的 双链中 的正链部分在后代中的比例尽量减少. 的正链部分在后代中的比例尽量减少 而带有突变基因的负链部分在后代中 尽量提高.所采用的方法有 所采用的方法有:偶联双引 尽量提高 所采用的方法有 偶联双引 物法、异源M13双链法、dUMP正链 双链法、 物法、异源 双链法 正链 法等。 法等。
这类方法的过程是， 这类方法的过程是，用带有各种所需 要突变序列的寡核苷酸， 要突变序列的寡核苷酸，在体外直接置换 目的基因中的欲突变部位而实现突变。 目的基因中的欲突变部位而实现突变。置 换过程需要限制性酶切和连接酶连接， 换过程需要限制性酶切和连接酶连接，所 以必须在双链DNA之间进行。寡核苷酸是 之间进行。 以必须在双链 之间进行 双链，目的基因也是双链。 双链，目的基因也是双链。
3)合成双链 合成双链DNA:将突变引物 端磷酸化 与 将突变引物5‘端磷酸化 合成双链 将突变引物 端磷酸化,与 正链混合退火,形成一小段错配的双链 形成一小段错配的双链. 正链混合退火 形成一小段错配的双链
寡核苷酸 引物
正链 正链
寡核苷酸 引物
4)用大肠杆菌 用大肠杆菌DNA聚合酶 延长形成 聚合酶I延长形成 用大肠杆菌 聚合酶 互补链,这条链称为负链.用 这条链称为负链 互补链 这条链称为负链 用T4DNA 连接酶封口. 连接酶封口
二. 非定点突变
非定点突变是指那些不能预先确 定产生突变位点的点突变技术. 定产生突变位点的点突变技术 非定点突变有多项技术.
1.错误掺入 错误掺入 1)局部部位的错误掺入突变 局部部位的错误掺入突变
2) 均匀分布的错误掺入突变
如果非定点突变只分布在基因的 少数部位,就不利于制造各种可能形成 少数部位 就不利于制造各种可能形成 的产物,对蛋白质工程的研究不适宜 的产物 对蛋白质工程的研究不适宜. 对蛋白质工程的研究不适宜 可用性质不同的几种核酸酶处理 目的基因,各种酶作用位点不同,造成 目的基因,各种酶作用位点不同,造成 各种酶作用位点不同 在目的基因的不同位点上形成若干缺 口,然后再限制底物供应或用硫取代核 然后再限制底物供应或用硫取代核 苷酸,让其修复 让其修复,这样就可以在多个位 苷酸 让其修复 这样就可以在多个位 点上进行突变了. 点上进行突变了
2. 对经典方法的改进
现有的改进主要集中在两方面: 现有的改进主要集中在两方面 1)尽量增加突变引物与正链退火后形 尽量增加突变引物与正链退火后形 成局部错配双链的稳定性,使其尽少 成局部错配双链的稳定性 使其尽少 遭受破坏,从而使突变率接近 遭受破坏 从而使突变率接近50%的 的 从而使突变率接近 理论值.所采取的方法有 双引物法、 理论值 所采取的方法有:双引物法、 所采取的方法有 双引物法 退火产物直接转化法. 退火产物直接转化法