基因文库中目的基因的筛选
DNA文库的构建和目的基因的筛选
第八章 DNA文库的构建和目的基因的筛选第一节 概述基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。
通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。
因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内复制，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因。
目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。
随着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有用的基因。
它是大自然恩赐于人类的宝贵资源，等待人们去开发利用。
目的基因用途很广，主要有以下几个方面：①研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。
②与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。
③研究生物种系进化与相关同源性。
④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。
⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。
⑥建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。
根据研究对象的研究目的不同，目的基因可来自原核细胞或真核细胞。
原核生物基因组较简单，较易获得目的基因。
哺乳动物真核细胞基因组庞大复杂，可根据不同的要求选择适宜方法，从中获得目的基因。
要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第一个难题。
欲想获得某个目的基因，必须对其有所了解，然后根据目的基因的性质制定分离的方案。
目的基因的制备是基因工程研究和应用的关键内容之一。
根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个完整的有功能的基因，除了编码区，还包含转录启动区和终止区序列，或者是一个完全的操纵子或基因簇，也可能是只具有编码序列的基因区，甚至是只含启动子或终止子等部件的DNA片段。
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选.pp t
总RNA中富集mRNA是构建cDNA的一个重 要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大 提高筛选到目的基因的可能性。
二、第一链cDNA的合成 由mRNA到cDNA的过程称为反转录，由反转录 酶催化。
常用的反转录酶有2种：AMV（来自禽成髓细
的各种信息（如表达丰度、蛋白性内切酶或机械力量切割成一定长 度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重 组并转化相应的宿主细胞体外反转录成cDNA，与适当的载体连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并 能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息 的自Moloey鼠白血 病病毒）。两者都是依赖于RNA的DNA聚合酶， 有5’→3’DNA聚合酶活性。（目前常用的反转 录酶多是通过点突变去掉RNase H活性的MoMLV）
反转录酶合成DNA时需要引物引导。常用的 引物主要有oligo（dT）引物和随机引物。 ① oligo（dT）引物一般包含15-30个脱氧胸 腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的寡 核苷酸片段； ② 随机引物一般包含6-10个盖基因组的倍数。
1975年Clar（1-p）/ln均插入片段的 长度和： 1）采用部分酶切或随机切割的方法来打断染 色体DNA，以保的插入片段大小所得到的平 均值。
插入效率表示有插入片段的克隆在所检测的
克隆中所占的比例，也是通过电泳检测的。
基因组覆盖倍数的估算方法有2种：
①用公式计算，基因组覆盖倍数=平均插入片 段长度×克隆数/基因组DNA的长度（一般是 约数）； ②结合基因组针筛选到的阳性克隆 的总个数除以使用的总探针数。
三、第二链cDNA的合成 cDNA第二链的合成就是将上一步形成的 mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过 程。 cDNA合成的方法： ①自身引导合成法； ②臵换合成法； ③引导合成法； ④引物-衔接头合成法。
目的基因的分离方法
目的基因的分离方法摘要：介绍了基因工程中分离所需目的基因的主要策略和最新进展。
总结了基因分离中的各种方法，主要有：直接酶切分离法，化学合成法，序列克隆法，功能克隆法，作图克隆法，表型差异克隆法，计算机辅助分离法等，并对其特点和适用范围进行了简单评述。
关键词：目的基因分离方法基因的分离方法都是根据基因的基本特性创建的，包括基因核苷酸顺序的特异性、基因在染色体上的位置特异性、基因编码的mRNA的特性和基因的差异表达等。
每种方法运用这些特性的一种或者多种，产生了各种各样的分离方法。
这些方法又相互之间组合，从而产生了可以在不同条件下有效分离目的基因的分离策略。
1 直接提取纯化此法只适用于分离多拷贝基因，而不适用于单拷贝基因。
并且所得到的目的基因纯度较低。
但是操作简单，对设备的依赖性很低，即使在很简陋的实验室里也能完成操作。
2 在体外用化学合成或酶促合成的方法取得目的基因通过对表达产物的分析和测序，可以预测目的基因的核苷酸序列，然后按照DNA碱基序列顺序，先合成DNA短片段，再通过DNA连接酶作用，将这些短片段依次连接成一个完整的基因。
人工合成基因的最大优点是能够根据需要合成突变基因，而且，所合成的是单基因，无其它有害基因，比较完整；缺点是只适用于较短的基因，操作比较难，费用也比较大。
目前这种方法主要用于PCR引物的合成，一些突变基因的合成等。
3 序列克隆——根据已知基因的序列克隆基因3．1 PCR扩增克隆当已知目的基因的序列时，通常采用PCR的方法来克隆基因。
基本原理和方法是：利用已知目的基因的序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，提取所要从中分离基因的染色体DNA(RNA需要在逆转录酶的作用下合成cDNA的第1条链)，然后通过PCR反应来扩增特定的DNA片段。
扩增的片段经过纯化后，连接到合适的载体上，用酶切分析和序列分析测定所得到的重组子，并与已知基因的序列进行比较，来进行鉴定。
鉴定之后的DNA可以用于基因的表达。
基因工程中筛选目的基因的方法
基因工程中筛选目的基因的方法1. 核酸杂交筛选法！就像在茫茫人海中找到那个与你契合的灵魂伴侣一样，通过核酸杂交这个神奇的手段，能精准地找到我们想要的目的基因呢！比如我们想找一个特定的基因来治疗疾病，就可以用这个方法去把它揪出来。
2. 基因文库筛选法呀！这就好比是一个超级大的基因宝库，你可以在里面尽情地寻找你需要的宝藏——目的基因。
想象一下，在无数的基因中找到那个关键的它，多刺激呀！比如在寻找提高农作物产量的基因时，就可以利用这个方法嘞。
3. PCR 筛选法呢，哇塞，这可厉害了！简直就像拿着一个超级放大镜，一下子就能把目的基因给找出来。
比如说我们在研究一种新型病毒时，利用PCR 就能快速找到相关的目的基因啦。
4. 免疫筛选法，嘿嘿，就像是身体的免疫系统能精准识别敌人一样，通过免疫反应来找到特定的目的基因哟！例如要找一个用于生产抗体药物的基因，免疫筛选法就派上大用场啦。
5. 酶切筛选法呀，这就像是一个精准的剪刀，能把不符合要求的基因剪掉，留下我们想要的目的基因呢！打个比方，在改造某个生物特性时，就可以用这个方法来筛选基因啦。
6. 噬菌体展示筛选法，这可太有意思啦！就如同在一个热闹的基因集市上，让目的基因自己展示出来，然后我们轻松地把它挑出来。
比如要筛选出能特异性结合某种物质的基因，这不就正好可以用这个方法嘛。
7. 酵母双杂交筛选法，哇哦，这就像一个巧妙的牵线搭桥，能找到相互作用的目的基因呢！像探索蛋白质之间的关系时就能用它来找关键基因啦。
8. 基因芯片筛选法，好厉害的感觉哟！如同有一张超级基因地图，一下子就能锁定目的基因的位置。
好比在大规模基因分析中，这个方法就超有用的啦！总之，这些方法就像是一把把钥匙，能帮我们打开基因奥秘的大门，真的超级神奇啊！。
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选
(3) 引导合成法
Okayama-Berg方法
（4）引物-衔接头合成法
4、双链 cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖的分子克隆
1.同聚100dA/dT, 20dG/dC) • 同聚尾结合的质粒： cDNA杂合分子转化 E.coli的效率随宿主不 同而不同。
该法聪明地利用了反转录过程中用接头锚定的方法， 与传统法相比，全长cDNA的比例得到大幅提高
2. G
1. 抑制性扣除杂交 suppression subtractive hybridization, SSH
含目的基因的cDNA：供体 tester 不含目的基因的cDNA：驱动 driver
• RsaI消化tester和driver • 将tester一分为二，分别加上接头1和接头2R • 第一轮杂交中，用过量的driver cDNA分别与带两种 接头的tester cDNA杂交 • 第二轮杂交中，将第一轮杂交的两个体系混合，再 加入过量的driver cDNA • 补平第二轮杂交产物的末端，进行两轮PCR扩增 • 巢式引物进行第二轮PCR扩增，富集差异表达基因 • T/A克length cDN因： • cDNA第二链合成工程中聚合酶的外切酶活性； • mRNA降解； • 反转录酶合成特性，从转录复合体上anism at 5' end of RNA • 指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（源于网织红细胞） 哺乳动物总mRNA可编码 10～100kDa蛋白
小鼠基因筛选实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景基因是生物体内控制遗传信息传递的基本单位，基因突变是生物进化的重要驱动力。
为了研究特定基因的功能，我们采用小鼠作为模型生物，通过基因筛选实验，旨在鉴定和验证与特定表型相关的基因。
二、实验目的1. 构建小鼠基因文库。
2. 通过分子生物学技术筛选与特定表型相关的基因。
3. 验证筛选得到的基因的功能。
三、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠。
2. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶等。
3. 试剂：PCR引物、DNA标记物、DNA探针、克隆载体等。
4. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
四、实验方法1. 构建小鼠基因文库（1）提取小鼠基因组DNA。
（2）使用限制性内切酶切割基因组DNA，获得特定长度的DNA片段。
（3）将切割后的DNA片段连接到克隆载体上，构建小鼠基因文库。
2. 基因筛选（1）根据已知表型，设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因。
（2）对小鼠基因文库进行PCR扩增，筛选出与特定表型相关的基因片段。
（3）将筛选得到的基因片段进行测序，确定其序列。
3. 基因功能验证（1）将筛选得到的基因片段克隆到表达载体中，构建重组表达载体。
（2）将重组表达载体转化大肠杆菌，获得表达目的蛋白的菌株。
（3）通过免疫印迹、免疫荧光等技术检测目的蛋白的表达和活性。
五、实验结果1. 成功构建了小鼠基因文库，文库容量达到预期目标。
2. 通过PCR扩增，成功筛选出与特定表型相关的基因片段。
3. 对筛选得到的基因片段进行测序，确定其序列。
4. 通过基因功能验证，成功表达了目的蛋白，并验证了其功能。
六、实验讨论1. 基因筛选实验中，PCR扩增和DNA测序是关键步骤，需要严格控制实验条件，确保结果的准确性。
2. 在基因功能验证过程中，需要选择合适的表达系统和检测方法，以确保目的蛋白的正确表达和活性。
3. 本研究筛选得到的基因可能与特定表型相关，但其具体功能还需进一步研究。
目的基因序列克隆的筛选与鉴定
目的基因序列克隆的筛选与鉴定目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的，因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。
一般一个载体只携带某一段外源DNA，一个细胞只接受一个重组DNA分子。
最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体（recombinant）。
将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆，所以筛选(dcreening)是基因克隆的重要步骤。
在构建载体，选择宿主细胞、设计分子克隆方案时都必须仔细考虑筛选的问题。
以下就常用技术的基本原理加以介绍。
一、根据重组载体的标志作筛选最常见的载体携带的标志是抗药性标志，如抗氨芐青霉素（anpr）、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)、G418等。
当培养基中含有抗生素时，只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖，这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。
如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活，这个抗药性标志就会消失。
例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因，若将目的序列插入terr基因序列中，转化大肠杆菌，让细菌放在含氨芐青霉素或四环素培养基中，凡未接受质粒DNA的细胞都不能生长；凡在含氨芐青霉素和四环素中都能生长的细菌是含有质粒pBR322的，但其pBR322未插入目的序列，凡在氨芐青霉素中能生长、而在四环素中不能生长的细菌就很可能是含有目的序列的重组质粒。
载体含有lacZ’的蓝白筛选法，近年更被广泛应用。
例如将目的序列插入前面述及的质粒pUC19的多克隆位点，转化大肠杆菌，放入含氨芐青霉素、IPTG、X-gal的培养基中培养，凡能生长并呈白色的菌落，其细菌中就很可能含有插入目的序列的重组质粒，这样就很容易获得目的序列的克隆。
根据重组载体的标志来筛选，可以筛选去大量的非目的重组体，但还只是粗筛，例如细菌可能发生变异而引起抗药性的改变，却并不代表目的序列的插入，所以需要做进一步细致的筛选。
基因工程中目的基因的检测pcr法
基因工程中目的基因的检测pcr法基因工程中目的基因的检测PCR法在现代生物技术领域，基因工程扮演着至关重要的角色。
它涉及到对生物体的基因进行精确的修改和调控，以实现特定的科学或商业目标。
在基因工程的过程中，检测目的基因的存在和表达是至关重要的一步。
聚合酶链反应（PCR）作为一种高效、灵敏的基因检测技术，已被广泛应用于这一领域。
PCR技术的基本原理是利用DNA聚合酶在特定条件下，对目标DNA 序列进行指数级扩增。
这一过程涉及到几个关键步骤：变性、退火和延伸。
通过高温将双链DNA变性为单链，然后通过降温使引物与目标序列特异性结合，在适宜的温度下，DNA聚合酶沿着模板链合成新的DNA链。
通过这一系列的循环，目标DNA序列得以在短时间内大量复制，从而便于检测和分析。
在基因工程中，PCR技术被用于多种目的。
它可以用于验证目的基因是否已成功导入宿主细胞。
通过设计特异性的引物，可以扩增出导入的基因片段，并通过凝胶电泳等方法进行检测。
PCR还可以用于检测目的基因的表达水平。
通过逆转录PCR（RTPCR）技术，可以将RNA转录为cDNA，然后通过PCR扩增，从而间接检测基因的表达量。
为了确保PCR检测的准确性和可靠性，必须严格控制实验条件。
引物的设计至关重要。
引物需要与目标序列完全匹配，并且具有适当的长度和GC含量，以确保高效性和特异性。
实验中的温度控制、试剂浓度和循环次数等参数也需要精确调控。
任何微小的偏差都可能导致结果的误判。
在应用PCR技术进行基因检测时，还需要考虑到可能存在的假阳性或假阴性结果。
假阳性通常是由于交叉污染或非特异性扩增引起的，而假阴性可能是由于模板量不足或扩增条件不适宜导致的。
因此，在实验设计中，应采取适当的对照和重复实验，以验证结果的可靠性。
随着PCR技术的不断发展，出现了许多基于PCR的衍生技术，如定量PCR（qPCR）、多重PCR和高通量PCR等。
这些技术不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还实现了对多个基因的同时检测，大大提高了实验效率。
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基因文库中目的基因的筛选
克隆基因的方法有很多，根据研究基础的不同，可以使用以下的方法克隆目的基因：
1. PCR或RT-PCR法
2. 从基因文库中分离基因
3. 从cDNA文库中分离基因
4. 转座子标签法
5. 图位克隆法
6. 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法
7. 人工合成法
本章中主要介绍从基因文库中筛选目的基因的几种方法。
获的目的克隆的方法有两种
1）目的基因的直接选择
2）从基因文库中筛选
称为鸟枪射击法，建立一个包含所有基因或大部分基因的克隆，从中筛选目的克隆。
一、直接选择
直接选择的基因比较少，如抗生素抗性基因。
如克隆一个kan抗性基因，在R6-5质粒上含有四种抗性基因：kan, 氯霉素、链霉素、硫胺类药物，kan抗性基因存在于13个EcoRI片段中的一段中。
将R6-5的片段插入pBR322的EcoRI位点中，连接混合物中将含有13个不同片段的大量重组拷贝，其中部分是kan抗性的。
只有含kan的克隆才能在含有kan的培养基上正常生长。
1.1 标记援救可以扩大直接选择的范围
利用E. coli的突变系可扩展该项技术。
例如要从E. coli中克隆trpA基因，编码色氨酸合成
酶，一个突变系不能合成色氨酸，只有加入色氨酸后才能存活。
因此E. coli的突变体可以用来克隆trpA基因。
首先从一个正常个体中提取总DNA，然后酶切，连接产生大量重组DNA分子，其中一个将携带完整的trpA基因。
连接混合物用来转化缺陷型E. coli细胞，大部分转化子是缺陷型的，携带trpA的重组子将是野生型的，可以在基本培养基上生长。
1.2 标记援救的范围和限制
存在两个限制因素：
1）必须存在着目的基因的突变品系
2）需要一种只有野生型能够生长的培养基。
一般而言，标记援救适用于微生物的合成酶，可以在基本培养上选择。