关于纤维素合酶交互蛋白1(CSI1)连接微管和纤维素合酶复合体的研究
纤维素酶的基因克隆及表达研究进展(好嗯).doc
湖北大学毕业论文设计题目纤维素酶的基因克隆及表达研究进展专业年级2007 生物工程学生姓名许莹学号014607200446指导老师江正兵2010年 12 月 5 日目录1.前言----------------------------------------------------------------------41.1 纤维素酶的组成--------------------------------------------41.2纤维素酶的分类与分布-------------------------------------51.3纤维素酶降解纤维素的机理研究--------------------------61.4纤维素酶的分子结构----------------------------------------71.5 纤维素酶在畜禽生产中的应用----------------------------91.5.1 在牛日粮中的应用------------------------------91.5.2 在鸡日粮中的应用------------------------------91.5.3 在猪日粮中的应用------------------------------10 2．纤维素酶的研究现状及展望-------------------------------------10 3. 纤维素酶的基因克隆与表达------------------------------------103.1 纤维素酶的基因克隆方法-----------------------------------103.2 纤维素酶活力的测定---------------------------------------103.3 实验材料试剂----------------------------------------------123.4 克隆基因--------------------------------------------------133.5 重组质粒的构建-------------------------------------------133.6 完整基因序列的克隆和分析--------------------------------134. 实验分析及讨论--------------------------------------------------14参考文献----------------------------------------------------------15Cloning and Expression of Cellulase ResearchCellulose is an important enzyme product, is a complex enzyme, mainly by the exo β-glucanase, endo-β-glucanase and β-glucosidase enzyme component, there is a high energy Xylanase activity. Since cellulose in feed, alcohol, textile and food industries have great market potential, has been optimistic about the industry at home and abroad, will be following the glucoamylase, amylase and protease enzymes after the fourth-largest industrial species, even in China Entirely possible to become the first major enzyme species, the cellulase enzyme preparation industry is a new growth point.Cellulose is composed of many highly synergistic enzymes composed of catalytic reactions based on their different functions can be divided into endoglucanase (1,4-β-D-glucan glucanohydrolase or endo-1 ,4-β-D-glucanase, EC3.2.1.4, the C1 enzyme), from fungi referred to as EG, from bacteria called Cen, exo-glucanase (1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase or exo-1,4-β-D-glucannase, EC.3.2.1.91), from the fungus referred to as CBH, from bacteria called Cex) and β-glucanase (β-1, 4 - glucosidase, EC.3.2 .1.21) referred to as BG.Cellulose molecule is a globular catalytic (Catalytic Domain, CD) or through an hydroxy amino acid proline-rich connecting bridge (Linker) and no catalytic domain of cellulose synthesis (carbohydrate-binding modules, CBM) three Parts. Only a small number of microorganisms and higher plants, cellulose produced no such domain.China is a very tight national feed resources, land-less population, the contradiction between human and animal food fight is very prominent. China's feed industry and to maintain the sustainable development of animal husbandry, must solve the feed problem, otherwise would severely hinder its development. Cellulose is a very rich natural resources, is a glucose molecule 800-1200 polymerization. Therefore, it can make full use of agricultural products by microbial fermentation of waste, straw, bran production of cellulase additives used to improve livestock and poultry production performance, improve feed utilization, improve the nutritional value of feed, lower feed costs and improve economic efficiency, with Broad development prospects, the future should further strengthen the research and development of cellulase.前言纤维素酶（cellulase），是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。
一个新杉木纤维素合酶ClCesA基因的克隆与植物表达载体构建
一个新杉木纤维素合酶ClCesA基因的克隆与植物表达载体构建魏晓骁;王士亚;陈潇潇;汪凤林;曹光球;曹世江【摘要】In order to explore the molecular mechanism of Chinese fir wood formation, total RNA was extracted from Chinese fir new leaves and cDNA was synthesized. A new ClCesA was cloned using RT-PCR. The length of open reading frame of ClCesA is 2955 bp, with 984 amino acids. Based on TMHMM Server v. 2.0 and MEGA5.1 software, ClCesA proteins consist of 8 across-membrane structures, with average 18 amino acid residues and zinc finger in N end. Also, a conservative DDDQXXLRW structure domain was found in ClCesA protein. Phylogenetic tree analysis showed that ClCesA may be associated with secondary cell wall formation. The flu-orescent quantitative PCR analysis showed that ClCesA can be expressed in organsof root, stem and leaf in Chinese fir, with the highest expression in the root and the least in leaf. Lastly, a plant overexpression vector pGWB506-35s-ClCesA-GFP was successful-ly constructed from pGWB506 vector which contains GFP tag and hygromycin resistance gene by Gateway technology.%为探索杉木木材形成的分子机制,以杉木嫩叶总RNA反转录的cDNA为模板,运用RT-PCR技术克隆出一个新杉木纤维素合酶基因ClCesA.该基因的开放阅读框(ORF)为2955 bp,共编码984个氨基酸.通过TMHMM Server v.2.0和MEGA 5.1软件预测ClCesA蛋白的跨膜结构和功能,发现该蛋白N端含有锌指结构,共有8个跨膜结构,平均跨膜区域18个氨基酸残基,并具有保守的DDDQXXLRW结构域.系统进化树分析结果表明,ClCesA可能与细胞次生壁形成有关.荧光定量PCR分析表明,ClCseA基因在杉木的不同器官(根、茎、叶)中均有表达,但在杉木根中的表达含量最高,茎中次之,叶中最低.随后,为后续该基因功能验证提供基础,将ClCesA 克隆到含有GFP标签和潮霉素抗性的pGWB506载体,构建植物过表达载体pGWB506-35S-ClCesA-GFP.【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(046)001【总页数】7页(P66-72)【关键词】杉木;纤维素合酶;基因克隆;表达分析;载体构建【作者】魏晓骁;王士亚;陈潇潇;汪凤林;曹光球;曹世江【作者单位】福建农林大学林学院;国家林业局杉木工程技术研究中心,福建福州350002;福建农林大学林学院;国家林业局杉木工程技术研究中心,福建福州350002;福建农林大学林学院;国家林业局杉木工程技术研究中心,福建福州350002;福建农林大学林学院;国家林业局杉木工程技术研究中心,福建福州350002;福建农林大学林学院;国家林业局杉木工程技术研究中心,福建福州350002;福建农林大学林学院;国家林业局杉木工程技术研究中心,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】Q785;S791.27纤维素作为地球上最丰富的可再生资源，是木材次生木质部细胞壁的主要组成成分之一，约占木材干重的40%，是决定木材品质的重要因子之一.为此揭示植物纤维素生物合成机制对木材材质改良、木材定向培育都具有十分重要的意义.纤维素合酶(CesA)是纤维素生物合成的关键酶之一[1,2].研究表明，CesA基因通过在转录水平上对纤维素合成进行调控，对植物细胞壁发育起到重要作用[3-5].美国密西根大学在2000年初次从欧洲颤杨(Populus tremuloides)中克隆得到林木的纤维素合酶基因PtrCesA1[6]，并且研究发现该基因主要在植物茎中表达，表达高峰期主要出现在次生壁形成期间.此后，在毛果杨(Populus trichocarpa)[7]、大青杨(Populus ussuriensis)[8]、松树(Pinus radiata)[9]、苎麻(Boehmeria nivea)[10]、桉树(Eucalyptus)[11]、马尾松(Pinus massoniana)[12]、杉木(Cunninghamia lanceolata)[13]、毛竹(Phyllostachys edulis)[14]等木本植物中都陆续克隆分离出CesA基因，其中毛果杨中鉴定出18个CesA基因[7]，杂交杨(Populus tremula (L)×P.tremuloides)中鉴定出10个CesA基因，绿竹(Bambusa bambusaoldhami)中鉴定出8个CesA基因[14].这些基因共同构成了林木的纤维素合酶基因家族.对ClCesA基因功能的研究结果表明，PtrCesA1、PtrCesA2、PtrCesA3这3个基因可能组成同一个纤维素合成酶复合体，共同完成杨树次生壁的合成[15]；而PtrCesA4、PtrCesA5、PtrCesA7这3个基因可能与初生壁的形成有关[16].在毛果杨中，PtCesA4、PtCesA5、PtCesA7、PtCesA8、PtCesA17和PtCesA18在木质部特异高表达[17].Song et al[18]通过研究杨树的纤维素合酶发现，杨树的木质部细胞膜上至少具有2种纤维素合酶复合体，复合体Ⅰ由CesA4、CesA7、CesA8、CesA17和CesA18组成，参与细胞次生壁的合成；复合体Ⅱ由CesA3、CesA10、CesA11、CesA13、CesA15和CesA16组成，参与细胞初生壁和次生壁的合成.杉木作为中国南方重要的速生用材树种之一，用途非常广泛.近几年，与杉木材性相关的分子机制研究取得一定进展[19,20]，而有关杉木的纤维素生物合成分子机制的研究报道甚少.彭沙沙等[21]克隆了杉木纤维素合成酶类似蛋白ClCslD1；而庞景等[13]克隆了杉木纤维素合成酶基因CesA，通过将本研究克隆出的基因ClCseA与庞景等克隆的CesA基因的DNA和蛋白序列进行比较，发现2个基因在核苷酸的编码区有11处位点存在差异，分别为773、821、1 249、1 537、1 545、1 554、2 166、2 436、2 580、2 823、2 856位点；在氨基酸的编码区序列也发现3处位点存在差异，分别为258、274、513位点.由于杉木基因组测序未完成，关于杉木纤维素合成酶基因家族的数量、各个基因的确切功能，以及各基因间的相互作用关系均不清楚.虽然克隆出的2个基因存在相似性，但也存在差异，有可能为2个不同的基因.关于基因的功能尚需进一步验证.探索杉木中纤维素合酶基因家族的功能，特别是相关次生细胞壁形成的纤维素合酶基因，对于利用现代分子生物学手段改良杉木木材品质具有重要意义.本研究以杉木三代种子园种子发育植株为材料，利用RT-PCR技术分离克隆出1个新的杉木ClCesA基因，长度为2 955 bp，编码984个氨基酸；同时进行了生物信息学分析以及不同器官表达情况的研究；采用Invitrogen公司的gateway特异性位点重组技术将ClCesA基因构建到植物表达载体中，以期为进一步的功能解析提供依据，同时也为杉木材性的改良提供重要的基因资源.1.1 材料收集与RNA提取试验材料由国家林业局杉木工程技术研究中心提供，为杉木种子发育而成的杉木幼苗.取长势好的杉木幼嫩叶片组织0.2 g，按照TIANGEN公司的总RNA提取试剂盒操作说明书提取杉木总RNA，通过1%(质量分数)的琼脂糖凝胶电泳和超微量分光光度计Nanodrop分别检测样品的RNA质量及浓度.1.2 ClCesA基因克隆与序列分析利用NCBI网上的GenBank数据库查询到已知杉木的DNA序列，采用gateway 技术设计特异引物(表1).取检测合格的杉木总RNA，利用TIANScript cDNA第一链合成试剂盒进行第1条链cDNA的合成.合成的cDNA稀释10倍后进行PCR反应，具体反应体系见表2.反应程序为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，53 ℃退火3 min，72 ℃延伸3 min，共30循环；最后72 ℃延伸10 min.扩增后的产物经1%(质量分数)的琼脂糖凝胶电泳检测后，通过BP连接到pDONR207载体上，热激转化到大肠杆菌DH-5α感受态细胞，进行Gen抗性筛选.选取单菌落做菌落PCR，将检测为阳性的菌落进行液体LB过夜培养，使用天根质粒试剂盒提取质粒，并送铂尚生物公司进行全长测序.利用实时荧光定量PCR仪研究ClCesA基因在不同组织的表达情况.qPCR扩增试剂为SYBR Premix Ex Taq，采用的荧光染料为SYBR GreenⅠ，以杉木EF1α基因作为内参基因.在进行qCR分析前，先使用普通PCR检测体系的反应条件，如退火温度、模板量等，并将PCR 产物进行测序，以保证qPCR结果的准确性.1.3 植物表达载体的构建使用Gateway BP反应试剂盒，将回收带有attB位点的ClCesA基因PCR产物与入门载体pDONR207在室温下进行BP反应1 h.反应体系为：PCR产物0.6 μL，入门载体0.4 μL，BP酶0.25 μL.随后将反应产物全部转化到E.coli Trans 5α感受态细胞，涂布于含Gen(50 mg·L-1)的LB平板；次日随机挑选阳性克隆摇菌并提取质粒，经PCR检测验证正确后进行测序，即可获得入门克隆载体pDONR207-ClCesA.参考Gateway LR反应试剂盒的操作说明书，将入门载体与目的载体pGWB506进行LR反应，室温25 ℃，反应后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂布于LB平板(含50 mg·L-1潮霉素)，37 ℃培养过夜.次日挑单菌落，摇菌后用试剂盒提取质粒，经PCR检测载体构建的正确性，并进行测序验证.1. 4 纤维素合酶基因的序列分析在DNAMAN V6软件上设计引物；通过Vecter NTI软件进行序列比对；在TMHMM Server v.2.0软件上进行蛋白质结构分析；运用MEGA 5.1软件通过邻接法构建不同植物的基因进化树；采用Microsoft Excel 2007软件对基因表达进行作图.2.1 杉木总RNA提取杉木叶片总RNA经1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳，结果见图1.从图1可以看出，RNA条带完整，28 S rRNA和18 S rRNA 2条主带明显，28 S rRNA的亮度约为18 S rRNA的2倍，且无DNA污染.采用超微量分光光度计进行浓度测定和质量分析、检测，结果显示，样品总RNA浓度为231 μg·μL-1，D260 nm/D280nm=1.86，其浓度与质量均满足反转录的要求，可用于后续试验.最后，将总RNA 样品置于-80 ℃冰箱保存.2.2 扩增产物的碱基序列测定与分析取上述总RNA，采用天根公司的逆转录酶试剂盒获得cDNA，通过RT-PCR反应得到1个约3 000 bp的产物(图2)，将该产物连接到pDONR207载体且转化DH-5α，挑取阳性克隆测序.测序结果显示该序列与CesA基因的同源性很高，并含有保守结构域.其氨基酸序列及结构如图3所示.2.3 蛋白质跨膜结构的预测从图4可以看出，新的ClCesA蛋白具有8个跨膜区，分别为175～197、204～223、760～782、794～816、831～853、878～900、910～932、945～964，最大跨膜区域为22个氨基酸残基，最小跨膜区域为12氨基酸残基，平均跨膜区域为18个氨基酸残基.2.4 基因序列系统发生树本研究运用MEGA 5.1软件构建系统进化树，将克隆到的杉木ClCesA基因编码区与拟南芥(Arabidopsis thaliana, At)、颤杨(P.tremuloides, Ptr)、欧洲山杨×颤杨(Populus tremula×P.tremuloides, Ptt)、火炬松(Pinus taeda L., Pt)、银灰杨(Populus canescens (Ait.) Smith, Pca)、毛白杨(Populus tomentosa Carrière, Pto)的初生壁和次生壁形成的CesA基因进行系统进化树分析.初生壁有关基因有AtCesA1(O48946)、AtCesA2(O48947)、AtCesA5(Q8L778)、AtCesA9(Q9SJ22)、PtrCesA7(AAO25581)、PttCesA2(AAT09895)、PtrCesA4(AAO25536)、PtrCesA6(AAP40636).次生壁有关基因有PtCesA1(AAX18647)、PtCesA2(AAX18648、PtCesA3(AAX18649)、PtrCesA2(AAM26299)、PtrCesA7(AAO25581)、PtrCesA3(AAQ08987)、PcaCesA1(AAC78476)、PttCesA1(AAT09894)、PttCesA3-1(AAT09896)、PttCesA3-2(AAT09897)、AtCesA4(Q84JA6)、AtCesA8(Q8LPK5)、PtoCesA1(AAY21910).从图5可以看出ClCesA分布在次生壁较密集的分支，且与杉木ClCesA1在一个小分支，说明两者的亲缘关系较近，可能执行类似的功能，由此推测ClCesA基因可能与次生壁合成有关.2.5 ClCesA基因在不同组织的表达杉木纤维素合酶基因在不同器官表达情况的分析结果(图6)显示，杉木的根、茎、叶3个器官均有纤维素合酶基因表达，而且相对表达量在杉木根中最高，茎中次之，叶中最低.因此，可以推测ClCesA基因与杉木木材生长发育的调控有着密切关系.2.6 植物过表达载体的构建将检测正确的入门载体pDONR207-ClCesA和目的载体pGWB506进行LR反应，获得植物表达载体pGWB506-35S-ClCesA-GFP，载体构建策略如图7所示.使用特异性的载体引物和基因特异性引物做菌落PCR，扩增出1 000 bp的片段(图8)，表明LR反应成功.重组质粒的测序结果显示，ClCesA并未产生突变，并且和原序列相同，说明本试验的植物表达载体连接正确.通过序列比对与分析，Pear et al[22]首先从棉花中克隆得到与细菌CelA基因同源的纤维素合酶基因GhCesA1、2.通过基因组学分析研究，Richmond et al[23]得到了拟南芥基因组中的10个CesA基因的蛋白质序列结构特点.Suzuki et al[17]分析了杨树基因组的18个CesA基因的结构特点.目前为止，研究发现CesA基因编码的蛋白质有着相类似的结构，共有8个跨膜结构域， N端有2个， C端有6个.1个锌指结构域在N端，可能和蛋白质之间的相互作用有关.CesA蛋白都含有较典型的结构如DDDQxxRW(天冬氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸、谷氨酞胺-x-x精氨酸—色氨酸)[24].通过对CesA基因功能的研究，已陆续鉴定出与初生壁和次生壁形成相关的基因.在欧洲颤杨中，PtrCesA1、PtrCesA2、PtrCesA3可能形成一个纤维素合成酶复合体，共同完成杨树次生壁的合成[15,24]，而PtrcesA4、PtrCesA5、PtrCesA7可能与初生壁的形成有关[16].本研究克隆到一个新杉木ClCesA基因，通过系统进化树，该基因与聚类在一个进化分支并在根中表达量最高，推测该基因可能参与植物次生细胞壁的形成.而庞景等克隆到的2个CesA基因，ClcesAl与PtrCesAl的同源性最高；ClCesA2与ZmCesA2聚类在一起，两者在茎中高度表达.本研究中所用材料为培养30 d左右的杉木种子萌发而成的幼苗，而庞景所用的杉木材料为1年生杉木幼苗，且纤维素合酶CesA在植物不同发育阶段、不同器官中的表达量不同，所以这可能是造成ClCesA在杉木器官中表达量不同的原因.植物中除了CesA基因外，还有类纤维素合酶(cellulose synthase-like, CSL)基因家族参与纤维素的生物合成.拟南芥CSL蛋白有9个家族，分别为CSL(A/B/C/D/E/F/G/H/J)[25]；在基因序列上，CSL基因与CesA基因具有部分同源，主要参与各种β-聚糖链的合成[23,25].彭莎莎等[21]也从杉木中克隆到了CSL基因，并分析其序列结构特点.【相关文献】[1] KUMAR M, TURNER S. Plant cellulose synthesis: CESA proteins crossing kingdoms[J]. Phytochemistry, 2015,112:91-99.[2] KAUR S, DHUGGA K, GILl K. Novel structural and functional motifs in cellulose synthase (CesA) genes of bread wheat (Triticum aestivum L.)[J]. PLoS ONE, 2016,11(1):e0147046. [3] DESPREZ T, JURANIEC M, CROWELLE E F. Organization of cellulose synthase complexesinvolved in primary cell wall synthesis in Arabidopsis thaliana[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007,104(39):15 572-15 577.[4] TAYLOR N G. Cellulose biosynthesis and deposition in higher plants[J]. New Phytologist, 2008,178(2):239-252.[5] TANAKA K, MURATA K, YAMAZAKI M. Three distinct rice cellulose synthase catalytic subunit genes required for cellulose synthesis in the secondary wall[J]. Plant Physiology, 2003,133(1):73-83.[6] WU L, JOSHI C P, CHIANG V L. A xylem-specific cellulose synthase gene from aspen (Populus tremuloides) is responsive to mechanical stress[J]. The Plant Journal,2000,22(6):495-502.[7] DJERBIJ S, LINDSKOG M, ARVESTAD L. The genome sequence of black cottonwood (Populus trichocarpa) reveals 18 conserved cellulose synthase (CesA) genes[J]. Planta, 2005,221(5):739-746.[8] 许雷,刘一星,方连玉.大青杨纤维素合成酶PuCesA6基因cDNA的克隆及序列分析[J].西南林业大学学报,2012,32(5):26-32.[9] KRAUSKOPF E, HARRIS P J, PUTTERILL J. The cellulose synthase gene PrCESA10 is involved in cellulose biosynthesis in developing tracheids of the gymnosperm Pinus radiata[J]. Gene, 2005,350(2):107-116.[10] 刘昱翔,陈建荣,彭彦,等.苎麻纤维素合成酶基因BnCesA4 cDNA序列的克隆与表达分析[J].作物研究,2014,28(5):472-478.[11] RANIK M, MYBURG A A. Six new cellulose synthase genes from Eucalyptus are associated with primary and secondary cell wall biosynthesis[J]. Tree Physiology, 2006,26(5):545-556.[12] 阮维程,潘婷,季孔庶.马尾松纤维素合成酶基因PmCesA1的克隆及其分析[J].分子植物育种,2015,13(4):861-870.[13] 庞景,童再康,黄华宏,等.杉木纤维素合成酶基因CesA的克隆及表达分析[J].浙江农林大学学报,2015,32(1):40-46.[14] 邓小波,胡尚连,曹颖,等.绿竹与毛竹纤维素合成酶(CesA)的生物信息学分析[J].福建林学院学报,2011,31(1):84-90.[15] SAMUGA A, JOSHI C P. Cloning and characterization of cellulose synthase-like gene, PtrCSLD2 from developing xylem of aspen trees[J]. Physiologia Plantarum,2004,120(4):631-641.[16] KALLURI U C, JOSHI C P. Differential expression patterns of two cellulose synthase genes are associated with primary and secondary cell wall development in aspen trees[J]. Planta, 2004,220(1):47-55.[17] SUZUKI S, LI L, SUN Y H. The cellulose synthase gene superfamily and biochemical functions of xylem-specific cellulose synthase-like genes in populus trichocarpa[J]. PlantPhysiology, 2006,142(3):1 233-1 245.[18] SONG D, SHEN J, LI L. Characterization of cellulose synthase complexes in Populus xylem differentiation[J]. New Phytologist, 2010,187(3):777-790.[19] 蒋向辉,佘朝文,许栋,等.杉木CCoAOMT基因部分cDNA克隆与序列分析[J].中南林业科技大学学报,2009,29(6):24-28.[20] 吕运舟,郑佳,陈金慧,等.参与杉木次生壁合成调控的转录因子ClMYB4的克隆及在大肠杆菌中表达[J].分子植物育种,2012,10(5):512-519.[21] 彭沙沙,童再康,黄华宏,等.杉木纤维素合成酶类似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息学分析[J].浙江农林大学学报,2012,29(1):1-6.[22] PEAR JR, KAWAGOE Y, SCHRECKENGOET W E. Higher plants contain homologs of the bacterial celA genes encoding the catalytic subunit of cellulose synthase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1996,93(22):12 637-12 642.[23] RICHMOND T A, SOMERVILLE C R. The cellulose synthase superfamily[J]. Plant Physiology, 2000,124(2):495-498.[24] SAMUGA A, JOSHI CP. A new cellulose synthase gene (PtrCesA2) from aspen xylem is orthologous to Arabidopsis AtCesA7 (irx3) gene associated with secondary cell wall synthesis[J]. Gene, 2002,296(1):37-44.[25] LIEPMAN A H, CAVALIER D M. The cellulose synthase-like A and cellulose synthase-like C families: recent advances and future perspectives[J]. Front Plant Sci, 2012,3(109):1-7.。
蛋白酶体激活因子REG_的重组表达及其体外功能的初步探讨
论 著蛋白酶体激活因子REG 的重组表达及其体外功能的初步探讨吴 敏1,聂 晶2,张令强1,2,汪 渊1[摘要] 目的 蛋白酶体激活因子11S调节蛋白复合物 亚单位(11S regu lator co m plex gamm a subun it,REG )的重组表达,初步探讨其与骨形成负调控分子酪蛋白激酶 2相互作用蛋白 1(case i n ki nase 2i nte racti ng prote i n 1,CK IP 1)的相互作用。
方法 首先以质粒pC M V M yc REG 为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增出765bp的R EG c DNA片段,然后亚克隆到原核表达载体p GEX 4T 2并转化入大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达,表达产物超声破碎后进行SD S PAGE和W este rn印迹鉴定,进而通过G ST Pu ll down实验验证REG 是否与CK IP 1存在相互作用。
结果 通过测序证实原核表达载体p GEX 4T 2 REG 构建成功,进一步表达鉴定发现G ST REG 蛋白主要以可溶性的形式存在于裂解上清中;G ST Pull down实验表明REG 与CK I P 1存在明显的相互作用。
结论 REG 与CK IP 1在体外存在相互作用,为进一步深入研究R E G 对CK IP 1的调控作用奠定了基础。
[关键词] 重组表达;质粒;蛋白酶体激活因子REG ;酪蛋白激酶 2相互作用蛋白 1;聚合酶链反应[中图分类号] Q556[文献标志码] A[文章编号] 1000 5501(2010)01 0005 04A preli m inary study on reco m binant expression and function in vitro of proteaso m e activator REGWU M in1,N I E J ing2,Z HANG L ing qiang1,2*,WANG Yuan1*(1.L abo ra t o ry o f M o l ecular B io l ogy,A nhu iM edica l U n i versity,H efe i230032,China;2.State K ey Labo ra tory of P ro teo m i cs,B eiji ng Proteo m ics R esearch Cente r,Be iji ng Instit u te of R adiati on M ed ici ne,Be iji ng100850,Ch i na)*C orres ponding au t hor,Z HANG Li ng q i ang,Em ai:l z hang l q@n i c.bm.i ac.c n;W ANG Yuan,E m ai:l w angyuan@ [Abstract] O bjective T o st udy the expression o f the f used proteasom e acti v ator REG (11S regu lator co m plex ga mm a subunit)us i ng gene reco m bi na tion techno l ogy and to furt her st udy t he i nteracti on bet w een R EG and case i n k i nase 2i nte r ac ting prote i n 1(CK IP 1)in v itro.M ethod s F irstl y,the f u ll length cDNA frag m ent o f REG w as a m plified through PCR usi ng the plas m i d p C M V M yc REG as temp l ate and subcloned i nto the prokaryo ti c expression vector p G EX 4T 2be fore be i ng transf o r m ed into E.coli BL21cells.T he prote i n expression was i nduced by i sopropy l D th i oga l actos i de(IPTG).Sec ond l y,the prote i n expression w as m on itored by SDS PAG E and W estern blotting a fter u ltrasonicati on.F i nall y,the G S T Pull down assay w as perfor m ed to i nvestigate the i nteracti on be t w een REG and CK I P 1in v itro.R es u lts T he prokaryotic expressi on construc t p GEX 4T 2 REG was g enerated successf u lly and confir m ed by DNA sequenc i ng.Expressi on ana l ys i s showed that t he GST REG pro te i n w as easil y expressed and i so lated m a i n l y i n the l y sate supernatant a fter son ica ti on and centr if ugation.The GST Pull do w n assay revea l ed the strong m utua l i nte raction bet w een REG and CK IP 1in vitro.Con clusi on T he proteasome acti v ator REG cou l d interactw it h the nega tive regulator of osteoblastogenesis CK IP 1in vitro and the current study has shed ligh t on f urther i nvesti ga ti ons of t he ir phys i o l og ica l re l evance.[K ey word s] reco m binant expression;p l as m i ds;proteasom e acti vato r REG ;case i n ki nase 2interacti ng pro te i n 1;po l y m ase cha i n reacti on[基金项目] 国家重大科学研究计划(2006CB910802);国家自然科学基金重点项目(30830029);国家重点实验室自主研究重点课题(SKLP K200802)项目部分基金资助[作者简介] 吴 敏,女,硕士研究生,主要从事细胞生物学研究[作者单位] 1.安徽医科大学分子生物学实验室和生物化学与分子生物学教研室,合肥 230032;2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京蛋白质组研究中心,蛋白质组学国家重点实验室,北京100850[通讯作者] 张令强,Emai:l z hangl q@nic.b m.i ;汪 渊,E m ai:l w angyuan@ 蛋白酶体系统是生物体内一类受多种复杂因素调控的重要蛋白质降解系统,通过降解受损伤的或错误折叠的蛋白质进而调节整个细胞过程,如细胞周期、细胞凋亡、信号转导和免疫应答等[1]。
纤维素酶基因工程菌pHBM_End培养条件的研究[1]
![纤维素酶基因工程菌pHBM_End培养条件的研究[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/ae73998db9d528ea81c77944.png)
基金项目：四川省教育厅自然科学科研项目（２００５Ａ０３０）＊通讯作者纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖和葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶三大类（谢占玲和吴润，２００４），在协同作用下它们可以将纤维素物质彻底水解成葡萄糖，进而发酵产生乙醇，解决能源再生以及环境污染等问题。
目前，纤维素酶成本高及酶活力低严重制约其在生产中的广泛应用。
为解决这个问题，一方面需要筛选高产量和高酶活力的纤维素酶产生菌，另一方面就是通过现代的基因工程手段，构建高效表达的基因工程菌，或通过对已知的纤维素酶进行分子改造以提高其比活力。
由于筛选原始菌株工作量大，且产量一般情况下较基因工程菌低，所以构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。
目前，国内外鲜见在巨大芽孢杆菌中表达内切葡聚糖酶的报道。
本试验以工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ为研究对象，对其产酶条件进行优化，通过优化培养条件以进一步提高表达量，为实现基因工程菌产业化奠定基础。
１材料与方法１．１菌种来源四川农业大学生命科学与理学院生物化学与分子生物学实验室自行构建保存的基因工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ。
１．２培养基ＬＢ培养基：１％胰蛋白胨，１％Ｎａ－Ｃｌ，０．５％酵母浸出粉，ｐＨ７．０～７．５；配制固体培养基时需加入１．５％～２．０％的琼脂粉；配制抗生素培养基时需加入四环素（终浓度为１０μｇ／ｍＬ）。
ＬＢ－ＣＭＣ培养基：在ＬＢ培养基中加入０．５％的羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）。
１．３生物量测定将培养液稀释２５倍，用７２１－型分光光度计在６００ｎｍ下测定光密度，以未接种的培养基等量稀释液作对照。
１．４酶活力测定参照郑淑霞等（２００４）方法。
以１ｍＬ１％（ｍ／Ｖ）羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）溶液为底物，加入０．１ｍＬ适当稀释的酶液并混匀，置水浴锅中５０℃静置保温３０ｍｉｎ，然后加入２．５ｍＬ二硝基水杨酸钠（ＤＮＳ）溶液，混匀后置１００℃煮沸５ｍｉｎ，取出后用流水冷却至室温，定容至５ｍＬ，最后在５３０ｎｍ波长处测得各管溶液的吸光值并计算酶活力。
纤维素合酶的结构及纤维素的合成过程
纤维素合酶的结构及细胞壁中纤维素的合成过程（综述）莫文洲(中国农业大学农学与生物技术学院植物108，1001080823)摘要：纤维素地球上最丰富的生物大分子和最重要的可再生资源，，植物纤维素的生物合成需要多个纤维素合成酶与其他相关酶，本文综述了从蛋白结构和基因组成上总结了纤维素合酶的特点以及植物细胞壁中纤维素合成的过程。
关键词：纤维素合酶纤维素的合成纤维素是地球上数量最多的有机大分子物质，是构成细胞壁的基础物质，占初生细胞壁物质的20%~30%。
纤维素分子是由β（1-4）连接的D-葡聚糖组成的高分子聚合物，并通过分子内氢键使其形成一种类螺旋状的结构。
随着社会的快速发展，人类对植物纤维的需求激增，而过度利用自然界的植物纤维资源将对人类生存造成极大的破坏。
植物纤维素生物合成机制的研究对材质改良，木材定向培育以及农业、造纸等化工业都十分重要。
而纤维素主要有纤维素合酶来合成，所以对植物纤维素台酶基因及其蛋白的研究显得更有价值。
要掌握纤维素合成酶基因的调控。
1.纤维素合酶的结构1.1纤维素合酶蛋白结构特点在不同植物的纤维素合成中，不同的纤维素合成酶(CesA)基因的具体作用是不同的，并且在纤维素的生物合成中，需要多个纤维素合成酶基目的共同作用。
纤维素的糖基转移酶有两个催化位点。
所有的CesA和Csl蛋白都具有跨膜蛋白的特征，在N一端与C一端具2个或多个跨膜区域，其中间为亲水胞内区，CesA与Csl蛋白之间最大的同源性出现在中间胞内区。
植物纤维素合成酶的N末端一段氨基酸可形成一个特殊的结构域，类似于锌指状或LIM 转录因子构向，此种该结构域具有保守序列CxxC(半胱氨酸氨一x 半胱氨酸氨)，与蛋白间的相互作用有关。
其次，植物纤维素合成酶包含有2个高变区，其中一个在N端，约150个氨基酸残基，富含酸性氨基酸，另一个在A 区与B区之间，约5O个氨基酸。
A 区和B区是植物纤维素合成酶基因所特有的保守区，A 区含有几个保守的天冬氨酸残基，排列特征为Dx⋯xDxD(D 为天冬氨酸)。
GasderminD蛋白的研究进展
网络出版时间：２０２３－０５－１５０８：２０：０８ 网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．ｒ．２０２３０５１１．１５５６．００２．ｈｔｍｌＧａｓｄｅｒｍｉｎＤ蛋白的研究进展李陈广１，２，麦凤怡３，梁靖蓉１，２，肖礼祖１，２，张治国１（１．深圳大学医学部生物医学工程学院，广东深圳 ５１８０６０；２．华中科技大学协和深圳医院疼痛科，广东深圳 ５１８０５２；３．南方科技大学医学院，广东深圳 ５１８０５５）ｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２２０２０１５文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）０５－０８１７－０６中国图书分类号：Ｒ３２９ ２４；Ｒ３４１；Ｒ３６４ ５摘要：细胞焦亡作为一种新的程序性的炎症性坏死，与微生物感染和自身免疫性疾病等密切相关。
而近年来才发现，ＧａｓｄｅｒｍｉｎＤ是细胞焦亡的执行蛋白，其切割会导致细胞膜上形成孔洞，诱导细胞焦亡发生，释放ＩＬ １β和ＩＬ １８等炎性收稿日期：２０２２－１０－１５，修回日期：２０２２－１２－１８基金项目：中国博士后基金面上项目（Ｎｏ２０２１Ｍ６９２２０７，２０２１Ｍ７０２２７６）；深圳市南山区科技计划项目（ＮｏＮＳ２０２１０５８，ＮＳ２０２１０８５）作者简介：李陈广（１９９０－），男，博士，研究方向：免疫药理学，Ｅ ｍａｉｌ：３３７９１６５０７＠ｑｑ．ｃｏｍ；张治国（１９７８－），男，博士，教授，研究方向：生物医学信息监测与分析，通信作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｚｇｚｈａｎｇ＠ｓｚｕ．ｅｄｕ．ｃｎ因子，加剧炎症反应的发生。
随着对ＧａｓｄｅｒｍｉｎＤ研究的深入，逐渐明确了其蛋白结构以及活化位点，并进一步发现其除能被炎症小体激活外的其他活化途径。
ＧａｓｄｅｒｍｉｎＤ的活化能够诱导细胞膜孔洞的形成并调节炎症因子的分泌，但并不一定意味着细胞的死亡，这些研究的发现让我们更深入了解ＧａｓｄｅｒｍｉｎＤ的功能以及细胞焦亡和程序性坏死。
某大学生物工程学院《细胞生物学》考试试卷(1315)
某大学生物工程学院《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（50分，每题5分）1. 微管存在于所有真核生物细胞中。
（）答案：错误解析：人的红细胞中没有微管，另外，原核生物中没有微管。
2. 在细胞水平上进行的任何遗传操作，通过细胞培养和植株再生，最终可以将细胞的遗传修饰变成植物的遗传修饰，从而改变整个植物的遗传特性。
（）答案：错误解析：植物细胞具有细胞全能性。
3. 核仁同其他细胞的细胞器一样，具有被膜包裹。
（）答案：错误解析：核仁无被膜包裹。
4. 细胞是生命活动的基本功能单位，也是生命的唯一表现形式。
（）答案：错误解析：病毒等是以非细胞的生命形式来表现。
5. 受体都分布于质膜表面，在信息传递和细胞识别过程中起信号接收器的作用。
（）答案：错误解析：受体分为胞内受体和胞外受体两种类型。
6. 在泛素化途径降解蛋白质过程中，泛素随靶蛋白一同被蛋白酶体降解。
（）答案：错误解析：泛素并不被降解，它可以循环利用。
7. 常染色质的所有基因都具有转录活性。
（）答案：错误解析：8. 单一核糖体只能合成一种类型的蛋白质。
（）答案：错误解析：细胞质所有的核糖体都是相同的，可以合成任何由特定mRNA翻译的特定蛋白质。
翻译后，核糖体从mRNA上释放出来，再开始翻译新的mRNA。
9. 借助于组合调控，一种关键的基因调控蛋白可以将一种类型的细胞转换成另一种类型的细胞，但是不可能诱发整个器官的形成。
（）答案：错误解析：借助于组合调控，一种关键的基因调控蛋白可以将一种类型的细胞转换成另一种类型的细胞，也可能诱发整个器官的形成。
10. 高尔基复合体顺面膜的结构近似质膜。
（）答案：错误解析：高尔基复合体的顺面膜是中间多孔而呈连续分支状的管网结构，膜厚约6nm。
比高尔基体其他部位略薄，但与内质网膜厚度接近。
大连理工大学 生物化学_修志龙_综合习题测试二
综合习题测试（二）一、糖（1）糖的概念及其分类糖类的元素组成、化学本质及生物学作用旋光异构单糖、二糖、寡糖和多糖的结构和性质糖聚合物及其代表和它们的生物学功能糖蛋白的生物活性糖的鉴定原理一、基本概念糖的生物学功能、醛糖、酮糖、单糖、寡糖、还原糖、构型、构像、变旋、对映体、异头物、糖苷、糖苷键、氨基糖、肽聚糖、脂多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、凝集素二、基本问题1. 常见单糖、寡糖、多糖、糖衍生物及特点；2. 单糖的化学性质；3. 还原糖的定性、定量方法；4. 糖肽连键的类型；习题一、判断题1.[ ]人体不仅能利用D-葡萄糖而且能利用L-葡萄糖。
2.[ ]同一种单糖的α-型和β-型是对映体。
3.[ ]由于酮类无还原性,所以酮糖亦无还原性。
4.[ ]果糖是左旋的，因此它属于L-构型。
5.[ ]糖原、淀粉和纤维素分子中都有一个还原端,所以它们都有还原性。
6.[ ]从热力学上讲,葡萄糖的船式构象比椅式构象更稳定。
7.[ ]一切有旋光性的糖都有变旋现象。
8.[ ]α-淀粉酶和β-淀粉酶的区别在于α-淀粉酶水解α-1,4糖苷键，β-淀粉酶水解β-1,4糖苷键9.[ ]糖对于生物体来说所起的作用就是作为能量物质和结构物质。
10.[ ]天然葡萄糖只能以一种构型存在，因此也只有一种旋光度。
12.[ ]构成淀粉,纤维素和半纤维素的基本单位都是葡萄糖.二、填空题1、糖是具有_____结构的一大类化合物。
根据其分子大小可分为_______、_______和______三大类。
2.蔗糖是由一分子______和一分子________组成,它们之间通过_______糖苷键相连。
3.糖苷是指糖的___________和醇、酚等化合物失水而形成的缩醛(或缩酮)等形式的化合物。
4.糖原和支链淀粉结构上很相似,都由许多_______组成,它们之间通过_______和______两种糖苷键相连。
两者在结构上的主要差别在于糖原分子比支链淀粉________、_______和________。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
The origin of the paper
Shundai Li， Lei Lei，Chris R. Somerville, and Ying Gu Center for Ligno Cellulose Structure and Formation（纤维素结构及形成）, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State University （宾夕法尼亚州立大学）, University Park,PA 16802; and Energy Biosciences Institute, University of California, Berkeley（贝克莱）, CA 94720 Contributed by Chris R. Somerville, November 14, 2011 (sent for review September 5, 2011)
前言
在研究微管在纤维素合成的作用时，一个改进的试验方法通过使皮 层微管及纤维素 合酶复合体同时可视化而成功。 CESA复合体可由活细胞成像直接观察到CESA复合体沿着细胞质膜在 平行于底层的皮层微管的轨迹移动。当微管组织经安磺灵（一种微管抑 制除草剂）处理后变得混乱时，CESA复合体的成分的轨迹也随之改变。 上述这些实验为验证皮层微管的空间取向定位确定了纤维素微纤维沉积 的空间定位提供了有力的证据。
7.CEAS复合体与皮层微管的链接依赖CSI1
8.结果讨论
1.CSI1与皮层微管共区域化
CESA复合体仅仅沿着平行于微管的轨迹移动。在载有YFP-TUA5(黄色荧光α-微管蛋白) 和(RFP)-CSI1（红色荧光纤维素合酶链接蛋白1）的转基因线上，检测CSI1是否与微管 链接。如Fig. 1A中，(RFP)-CSI1信号与YFP-TUA5的有很大部分的重叠，及Fig. 1B中信 号强度表。进一步的确定CSI1和微管的空间关系，将之定义为共区域化。 在表达RFPCSI1及YFP-TUA5的细胞单束光照射部分，观察到84 ± 4%RFP-CSI1粒子与微管对齐链接 （Fig. 1C 及 Table 1）。在RFP-CSI1 与YFP-TUA5之间广泛的匹配安装，表明了RFPCSI1绑定链接在皮层微管上（Fig. 1D）.RFP-CSI1 与YFP-TUA5的延时观测，显示了在 一定的时间段内两种分子系统的动态行为（movie S1).微管是高度动态的并且以
CSI1 is a microtubule-binding protein.
Fig. 2. CSI1 is a microtubulebinding protein.
(A) Microtubule-binding assay. Coomassie-stained gels show supernatants and pellets after the microtubule-binding assay. S, supernatant fraction; P, pellet fraction; + or −,presence or absence of microtubules in the assay. The positions of positive control (MAP2), negative control (BSA), tubulin, and CSI1 are indicated by arrows. (B) Quantitative analysis of the binding properties between CSI1 and microtubules. The disassociation constant (Kd) for CSI1, determined by best fit to the data, is 1.07 ± 0.33 μM. The data were collected from three technical replicates.
/content/109/1/185.full
Abstract
Cellulose synthase (CESA) complexes can be observed by live-cell imaging（活细胞成像） to move with trajectories（轨 迹） that parallel the underlying cortical microtubules（皮层微 管）. Report ：CESA interactive protein1 (CSI1) is a microtubule-associated protein that bridges CESA complexes and cortical microtubules. In vivo imaging（活体成像） of CSI1, CESA complexes, and microtubules , the association of CESA complexes and cortical microtubules is dependent on CSI1. In vitro microtubule-binding assay（体外微管连接试 验),CSI1 directly binds to microtubules .
Cellulose synthase interactive protein 1 (CSI1) links microtubules and cellulose synthase complexes
关于纤维素合酶链接蛋白1（CSI1）连接微管和 纤维素合酶复合体的研究
2013-03-29
西南科技大学
2.CSI1是一种微管绑定蛋白
CSI1与微管的链接可能通过直接绑定到微管或者绑定到微管相关蛋白 （microtubule-associated proteins ，MAPs）完成的。 为了测试CSI1直接绑定微管的可能性，进行体外微管绑定分析法微管 于体外聚合并与已知的与微管相关的蛋白质（MAP2，阳性控制），BSA(阴 性控制)，或者亲和纯化，他-标记CSI1已经在大肠杆菌中表达。 经孵化后，样品经离心分离，存于沉淀与上清液中的蛋白质经 SDS/PAGE（Fig. 2A）电泳分析检测，不像BSA但与MAP2类似，CSI1与聚合 的微管共同沉淀。 CSI1绑定到微管在2 μM时是饱和的，解离常数Kd= 1.07 ± 0.33 μM(Fig. 2B and Fig. S1)，这个数值与得到确认的微管绑定蛋白的解离 常数相当。
在此，我们提出最近确认的CESA链接蛋白1（CSI1）介导着微管与纤 维素合酶之间的 交互链接的结论。
研究结果：
1.CSI1与皮层微管共区域化
2.CSI1是一种微管绑定蛋白与 3.CSI1的共区域化依赖于微管与CESA复合体
4.CESA的移动速度依赖于微管 5.CSI1功能缺失的安磺灵拟表型效应
6.CSI1的缺失使CESA复合体与微管分离
Li S et al. PNAS 2012;109:185-190
©2012 by National Academy of Sciences
3.CSI1的共区域化依赖于微管和CESA复合体
为确定CSI1的共区域化至细胞质膜是否依赖于微管的功能，用微管紊乱药物 安磺灵处理同时表达CSI1-RFP 和GFP-MAP4-MBD的拟南芥种苗。 用20μM的安磺灵处理7小时，除去生长在黑暗条件下的种苗的表皮细胞里的微 管组织，随之在CSI1组织中引起明显的变化(Fig. S2）。 用20 μM安磺灵处理10小时后，并没能明显的将GFP-CESA6（绿色荧光蛋白） 从细胞质膜上移除，而且荧光信号继续集中于线性轨迹上，即使移动速度有轻微 的减少（Fig. 3A and Movie S2）。 为了确定CESA复合体的完整性对于CSI1的质膜共区域化是否重要，用纤维素抑 制剂异恶草胺表达CSI1-RFP的拟南芥种苗。异恶草胺的作用是快速从质膜上清除 CESA复合体。加入异恶草胺30分钟后，观察到CSI1-RFP粒子强度明显降低（Fig. S3），经测异恶草胺作用后的CESA复合体也有类似变化。
0.5μm/min的平均净增长速度经历了“踏车运动”的过程。观察到RFP-CSI1 粒子系统
沿着与微管重合的轨迹移动，且没有连接微管末端的倾向。
Fig. 1. CSI1 colocalized with cortical microtubules. (A) Two-channel confocal imaging of epidermal cells in 3-d-old darkgrown hypocotyls expressing markers for cortical microtubules (YFP-TUA5) and CSI1 (RFP-CSI1). (Scale bar, 5 μm.) (B) Plot of a line scan showing a strong correlation between the spatial localization of YFP-TUA5 and RFP-CSI1. (C) Colocalization analysis of YFP-TUA5 and RFP-CSI1. White dots represent colocalized RFP-CSI1 with microtubules. RFP-CSI1particles that did not colocalize with microtubules are green. Analysis was performed in six cells from six seedlings (Table 1). YFP-TUA5 is displayed in pseudocolor red and RFP-CSI1 is displayed in green for better visualization in colocalization analysis. (Scale bar, 10 μm.) (D) Time-average image showing thatCSI1 moved along the underlyingmicrotubules. Average of 31 frames (duration 150 s, 5-s interval) shows identical localization of YFPTUA5 and RFP-CSI1.(Scale bar, 10 μm.)