邻二氮菲测定微量铁含量

邻二氮菲测定微量铁

（重庆医科大学检验医学院2010级生物技术导师：易刚）

作者：李海军李加本李良华李文伟沈俊捷李明义

摘要：目的:利用邻二氮菲作显色剂测定样品中的微量铁并评价该方法的各项性能，熟悉研究工作的方法和步骤。方法：利用可见分光光度法中的标准曲线法，用邻二氮菲作显色剂，通过固定其他条件的方法来分析pH，时间，显色剂加入量对吸光度的影响。通过标准加样回收来检验方法的准确度，连续测定一份样品十次来验证方法的精密度。结果：结果显示显色环境在pH=4.9，波长509.8nm 时吸光度值最大，显色时间在5~60 min内变化较小，显色剂用量对吸光度影响不大，回收率在98.70%~101.70之间，测定十份同一样品的标准偏差s=0.102，变异系数CV=s/x=0.462%，90%置信水平置信区间为22.03±0.059（ug/ml），99%置信水平置信区间为22.03±0.105（ug/ml）。铁离子浓度在0.1ug/ml~5ug/ml的线性超过0.9998。

关键词：邻二氮菲微量铁测定分光光度法显色剂

前言：铁是人体正常生理过程中不可或缺的物质，几乎任何组织都含有铁。缺铁性贫血是铁缺乏最严重的疾病。铁过量是引发或加剧多种慢性疾病（如肿瘤、糖尿病、心血管疾病、神经退化性疾病以及慢性肝病等）的危险因素。目前常用的方法有磺基水杨酸分光光度法、1，10一菲罗啉分光光度法、EDTA配位滴定法测定铁离子含量

1.材料方法

1.1仪器：752型紫外可见分光光度计精密分析天平

试剂：硫酸铁氨浓盐酸邻二氮菲盐酸羟胺醋酸醋酸钠乙醇

1.2方法原理:在pH=3-9范围内邻二氮菲可与亚铁离子快速形成稳定的配合物比

例为3：1，生成的配合物在510nm附近有一吸收峰，据报道其摩尔吸光系10,反应灵敏且铁离子浓度与吸光度符合朗伯比尔定律。本实验数为1.1×4

中使用NaAc：HAc=1：1的缓冲液，用盐酸羟胺还原样品中的铁离子

1.3铁标准液的配制方法

1mg/ml铁标准溶液的配制：准确称量0.4320gNH4Fe(SO4)2.H2O12至烧杯移取5ml 1mol/L盐酸在烧杯溶解，转移至50ml容量瓶，摇匀，转移至试剂瓶。

50ug/ml铁标准溶液的配制：用5ml移液管移取5ml的1mg/ml铁标准溶液和10ml 1mol/L盐酸至100ml容量瓶

1.4 试剂的配制方法：

醋酸钠缓冲液：16.41 g醋酸钠，12.10g冰醋酸溶解至100ml蒸馏水中。

1mol/L盐酸溶液：移取10ml浓盐酸至100ml容量瓶定容移至试剂瓶。

1.5 g/L 的1, 10-邻菲啰啉：称量0.15g 1, 10-邻菲啰啉溶于5ml乙醇，加

lml 1mol/L盐酸，溶解至100ml蒸馏水中。

10%盐酸羟胺溶液：称取盐酸羟胺10g溶解至100ml 蒸馏水中。

1.5检测步骤：按顺序向50ml容量瓶中依次移入样品或铁标准溶液，盐酸羟胺溶

液，醋酸钠缓冲液，邻菲罗琳溶液。加入显色剂前摇匀，加入显色剂摇匀并静置5分钟后测定其吸光度。 1.6

系列显色液：

2.结果

2.1 显色时间：取10号溶液，用1号溶液作参比溶液用1cm 比色皿，测定在

1.2.3.4.5.10.30.60min 时的吸光度变化。结果显示吸光度在5-20min 稳定在5-60min 内变化小于0.4%

2.2 显色剂用量：测定溶液在加入不同量的显色剂时的吸光度变化。可见显

色剂的用量对吸光度影响不大。 显色剂用量 1ml 3ml 5ml 10ml 20ml 吸光度A 0.224 0.225 0.224 0.225 0.229 2.3 pH 的影响：根据NaAc 与HAc 的不同比例配制缓冲液测定显色液在不同

pH 下的吸光度变化。结果显示pH 对吸光度影响较小且在pH=4.9时吸光度最大。由于ph 范围较窄，平直部分不易区分，但吸光度在pH3.6~4.9的变化为1%，较小符合标准。

编号 1 2 3 4 5 6 7

准液加入量（5ug/ml ） 0ml 1ml 2 ml 3 ml 4 ml 5 ml 10ml 盐酸羟胺加入量 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 显色剂加入量 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 缓冲液加入量 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 浓度ug/ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 1 编号 8 9 10 11 样品 标准液加入量（50ug/ml ） 2ml 3ml 4ml 5ml 3ml 盐酸羟胺加入量 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 显色剂加入量 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 缓冲液加入量 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 浓度ug/ml 2 3 4 5

吸光度p H 曲

0.612

0.6140.6160.6180.62

0.6220

1

2

34

5

6

pH

吸光度

系列1

2.4 吸收光谱：分别测定0.3ug/ml ，1 ug/ml ，4 ug/ml 浓度铁溶液在400-600nm

的吸收曲线确定吸收光谱并确定最大吸收波长为509.8nm 。三种浓度的吸收光谱相同。

2.5 标准曲线：在pH4.8，显色剂5ml ，显色时间5~20min ，波长510nm 的情

况下，用50ug/ml 和5ug/ml 浓度铁标准溶液配制不同浓度显色溶液每个溶液测定三次取平均值绘制浓度在0.1ug/ml~5ug/ml 的标准曲线。以吸光度值为纵坐标，对应的浓度为纵坐标的到标准曲线如图。铁浓度在0.1ug/ml~5ug/ml 符合朗伯比尔定律，线性方程为c=5.0085A-0.0845，由

方程计算的摩尔吸光系数为 ε

=1.1167×410L cm/mol ，回归系数

r=0.9999

标准曲线y = 5.0085x - 0.0845

R 2 = 0.9999

01234560

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

吸光度

浓度

2.6 样品浓度测定：向容量瓶中加入5ml 样品，配制10份相同浓度溶液，测

定其吸光度，平均值为0.457，按照上述公式计算其浓度为22.03ug/ml ，

3.94×410mol/L 。十份溶液浓度的平均值为22.04ug/ml ，标准偏差s=0.102，变异系数CV=s/x=0.462%，95%置信水平置信区间为22.03±0.059（ug/ml ），95%置信水平置信区间为22.03±0.105（ug/ml ）。

2.7 回收率：在测定样品浓度时向六份显色溶液中加入1ml 50ug/ml 浓度铁标准溶液再定容，测定浓度，计算其回收率如表。

编号 1 2 3 4 5 6 平均值 样品 测定浓度ug/ml 32.16 32.26 32.36 32.36 32.46 32.46 32.32 22.29

回收率

98.70%

99.70%

100.70

100.70

101.70% 101.70% 100.53%