基于核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术
国家科学技术进步奖
国家科学技术进步奖（2019年度）一、项目基本情况二、项目简介（限1200字）食品农产品中影响质量安全的主要有生物性因素和化学性因素等，包括食源性致病微生物、腐败菌、食品过敏源、食品掺伪、农兽药残留、重金属等危害因素。
近年来，随着转基因食品的商业化生产，对其安全性国内外争论不断。
该项目围绕保障食品农产品质量安全的国家重大需求，在19项国家及省部级计划项目支持下，开展食品农产品质量安全快速检测技术与装备的研究，京津冀粤产学研协作联动，针对常规检测方法存在灵敏度不高、速度不快、高通量不够、不能现场检测、操作繁琐等技术难题，取得以下创新性成果：1. 首次发现Bst 酶扩增DNA的一种新特性，并阐明其扩增机制，以此为基础，首创跨越式滚环等温扩增检测新方法；首次建立可视化的单引物等温扩增技术。
2. 首创等温（恒温）扩增实时荧光检测新技术，并首次建立了多种致病微生物，食品掺伪和过敏源的等温扩增实时荧光检测新方法；率先开发实时荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）技术、基因芯片技术检测多种食源性致病菌的方法；发明了HPLC检测致病微生物的方法。
3. 首创了Special-Base焦磷酸测序检测方法，实现了四种转基因成分同时精准鉴定。
率先开发转基因食品的等温扩增实时荧光检测技术和便携式转基因成分检测箱，实现了现场可视化快速检测。
首次制定微流控数字PCR检测技术规范。
首次发明了转基因玉米快速检测的微流控芯片。
4. 首创胶体金刚碳试纸条检测新技术。
首次建立了农兽药残留、重金属的胶体金刚碳检测新方法。
5. 研发和量产了实时荧光定量PCR仪GNM C7-8、等温实时荧光检测仪、4种食品安全检测仪器，打破了进口仪器垄断的现状，填补了国内空白。
研发和量产了268种食源性致病微生物、腐败菌、食品过敏源、食品掺伪、农兽药残留、重金属的检测试剂盒。
项目发表论文331篇，其中SCI收录81篇（JCR二区38篇），EI收录16篇，出版教材3部，申请专利61项，现已授权发明专利27项，授权实用新型专利5项，软件著作权14项，制定标准63项，其中国家标准6项，行业标准13项，地方标准11项，企业标准33项，研制268套试剂盒和6种装备。
食品安全快速检测技术在食源性致病菌检测中的应用
食品安全快速检测技术在食源性致病菌检测中的应用作者：胡婵娟胡莉吴志豪戚俊峰来源：《食品安全导刊·下》2024年第05期摘要：本文针对食源性致病菌检测的迫切需求，深入分析了主要致病菌的特性，并探讨了食品安全快速检测技术的多种方法及其面临的挑战。
文章重点介绍了核酸扩增、免疫分析、生物传感等技术的优势与局限，同时针对样品基质复杂性、低丰度致病菌的富集分離以及现场快速检测设备的稳定性问题，提出了具体的技术改进对策。
通过优化检测技术，可显著提升食源性致病菌检测的灵敏度、特异性和操作便捷性，为食品安全监管提供强有力的技术支撑。
关键词：食源性致病菌；快速检测；核酸扩增The Application of Fast Food Safety Detection Technology in the Detection of Foodborne PathogensHU Chanjuan1， HU Li1， WU Zhihao1， QI Junfeng1，2*（1.School of Biological and Food Engineering， Huanghuai University， Zhumadian 463000， China; 2.Department of General Medicine， Affiliated Zhumadian Central Hospital of Huanghuai University， Zhumadian 463000， China）Abstract： This article focuses on the urgent need for the detection of foodborne pathogens，analyzes in depth the characteristics of the main pathogens， and explores various methods and challenges of rapid food safety detection technology. The article focuses on the advantages and limitations of technologies such as nucleic acid amplification， immunoassay， and biosensing. At the same time， specific technical improvement measures are proposed to address the complexity of sample matrices， the enrichment and separation of low abundance pathogenic bacteria， and the stability of on-site rapid detection equipment. By optimizing detection techniques， the sensitivity，specificity， and operational convenience of detecting foodborne pathogens can be significantly improved， providing strong technical support for food safety supervision.Keywords： foodborne pathogens; rapid detection; nucleic acid amplification食源性疾病是由污染的食物或水引起的疾病，已成为全球公共卫生的重大问题。
多种基于微流控芯片的检测方法用于细菌检测
多种基于微流控芯片的检测方法用于细菌检测邵奕霖;徐小平;高菊逸【摘要】致病菌常规检测方法以培养鉴定为主,该方法周期长,培养条件苛刻,难以做到快速检测.微流控芯片具有小型化、高通量、快速、集成、耗材少等优点,近年得到了快速发展并逐步应用于各个领域.利用微流控芯片技术可实现细菌的快速检测,将该技术与其他技术相结合也得到了广泛应用.该文就近些年联合其他细菌检测方法设计的微流控芯片进行了综述,并探讨各种协同方法的优缺点及临床应用前景或价值.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2017(035)004【总页数】2页(P296-297)【关键词】微流控芯片;细菌;快速检测【作者】邵奕霖;徐小平;高菊逸【作者单位】南昌大学研究生院医学部,南昌330006;香港大学深圳医院,广东深圳518053;香港大学深圳医院,广东深圳518053;香港大学深圳医院,广东深圳518053【正文语种】中文【中图分类】R446.6微流控芯片(microfluidic chip)技术是在微米级通道内操控微量流体的技术，通过微进样技术和对微通道内流体的控制，可将芯片分隔成多个功能模块，包括样品分选室、富集室、反应室、检测室等，也被称为微整合分析芯片(micrototal analytical systems)。
微流控芯片在细菌检测上具有巨大潜力，已发展成多学科交叉的新型研究领域。
目前利用传统检测方法设计制作的芯片包括化学芯片和基因芯片。
现就几种芯片的优缺点综述如下。
细菌悬液经负压吸引通过检测孔时，因细菌体积大小、表面性质的不同产生不同的脉冲信号，经放大、分选后累加记录，可将脉冲信号转化为细菌数量和种类等相关信息。
近些年，电阻抗技术也被应用到微流控芯片上。
Mejri等[1]制作的芯片有3个3 mm×3 mm独立检测室，每个检测室包绕有交错的微金电极，联合红外光谱检测大肠埃希菌，检出限(limit of detection，LOD)达到104 CFU/mL。
1063期-1：【科普】全球体外诊断（IVD）市场（58~63）
1063期-1：【科普】全球体外诊断（IVD）市场（58~63）第八章：分子检测概述分子诊断在临床医学方面正在成为一个占主导地位的平台并且代表诊断市场一个增长最快的部分。
它的出现完全是从研究走到临床试验。
现在仪器自动化很多的样品制备和分析步骤,这些在过去都是劳动密集型的。
新的测试正在启动。
许多分子测试都是CE标志和FDA准入的，还有很多正在发展之中。
分子技术在临床医学的应用已在世界各地得到了广泛的关注。
他们已经在诊断系统留下了印记,并将在接下来的5年里继续这样做。
在过去的几年里活动的数量是不错的，显示行业正在向测试,技术和能够支持基于分子的病人护理的基础设施工具方向发展,尽管仍有足够多的障碍和挑战需要克服。
分子诊断市场的主要增长动力,是持续发现的证明临床实用性的遗传标记,越来越多的采用基于遗传的诊断测试,和报销的扩张计划,包括更多的诊断测试的批准。
最具吸引力的增长领域是组织学分析的分子测试,女性健康,传染性疾病、器官移植测试和肿瘤。
在技术方面这个市场的一个主要的驱动力是技术进步带来的新测试和技术。
虽然PCR是一种标准技术用于进行扩增反应,该方法却非常复杂,由于需要多次热循环和冷却,在这个过程中,它会消耗更多的能量。
作为替代PCR的方法,等温核酸扩增避免了重复变性的需要，及在等温条件下放大反应的发生时冷却。
这极大地改善了进行分子诊断的微流控芯片的设计。
大多数的微流体装置采用等温核酸扩增方法是在研发阶段。
预计增加的小型化的核酸诊断将促进市场的发展。
等温的关键供应商是Eiken,Becton,Dickson and Co.bioMerieux s.a.Novartis International AG, and Quidel Corp。
分子诊断行业也经历了一个快速转向增加样本分析的自动化的过程和在单一的小型设备上集成的样本分析。
小型化提供了减少样品体积的机会,使最终用户能够自动化和分析样本。
医疗保健服务的重大变化预示着一个诊断测试新时代需求的开始。
结核病分子诊断技术的开发与应用
结核病流行病学研究
追踪Байду номын сангаас染源
利用分子诊断技术对结核分枝杆菌进行 基因分型，追踪结核病的传染源和传播 途径，为疫情防控提供科学依据。
VS
研究菌群演变
通过分析不同地区、不同时间段结核分枝 杆菌的基因序列差异，研究菌群演变规律 和传播特点，为制定防控策略提供数据支 持。
04 结核病分子诊断技术的挑 战与展望
临床挑战
01
02
03
早期诊断
结核病早期感染时菌量较 低，传统诊断方法阳性率 较低，需要分子诊断技术 提高早期诊断的准确率。
无症状感染者诊断
部分结核病患者无明显症 状，通过分子诊断技术发 现无症状感染者，以控制 结核病的传播。
监测治疗效果
分子诊断技术可用于监测 结核病患者在治疗过程中 的病情变化，为指导治疗 方案提供依据。
一种在等温条件下进行的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强等特点，适用于基层医疗机构的结核病诊断 。
微流控芯片技术
将PCR扩增、检测等步骤集成在微流控芯片上，实现样品的快速处理和自动化检测，提高诊断效率和准确性。
03 结核病分子诊断技术的应 用
临床样本的检测
检测结核分枝杆菌
利用分子诊断技术，通过检测临床样本中的结核分枝杆菌特 异性基因序列，快速准确地诊断结核病。
区分活动性与非活动性结核
通过分析结核分枝杆菌基因表达的差异，区分活动性结核病 和非活动性结核病，为患者提供个性化治疗方案。
耐药性结核病的检测
检测耐药基因
运用分子诊断技术，直接检测结核分枝杆菌中的耐药基因，快速筛选出耐药性结核病，指导临床合理 用药。
监测药物敏感性
通过定量检测结核分枝杆菌在药物作用下的基因表达变化，实时监测药物敏感性，为临床医生提供调 整治疗方案的依据。
具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片的生产技术
本技术属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片。所述芯片由若干病原检测单体组合而成；病原检测单体上各样液池由通道联通，所述通道通过遮蔽技术由纳米材料构建。本技术可以直接从组织裂解液中一步到位进行扩增，能有效降低样品检测成本，提高检测效率，保障检测准确性，从根本上增进对虾种业的疫病筛查能力。
权利要求书1.一种具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片，其特征在于：由若干病原检测单体组合而成；病原检测单体上各样液池由通道联通，所
述通道通过遮蔽技术由纳米材料构建。
2.如权利要求1所述的具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片，其特征在于：样液池包括按液体流向依次排布的加样池、核酸变性池、扩
增检测池和溢流池；加样池、核酸变性池之间为核酸提取通道。
3.如权利要求2所述的具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片，其特征在于：核酸提取通道结构表面利用固相可逆化固定原理进行分子改
性。
4.如权利要求2或3所述的具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片，其特征在于：所述芯片分为上下两层，所有通道、核酸变性池、扩增
检测池和溢流池均设置在芯片下层，加样池贯穿芯片上下层。
5.如权利要求2或3所述的具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片，其特征在于：扩增检测池设有若干个，围绕核酸变性池按中心对称呈
辐射状圆形分布，其外围为溢流池。
6.如权利要求2或3所述的具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片，其特征在于：所述芯片为长方形，尺寸为25×80mm；芯片上、下层的
厚度均为2.0mm；通道的宽度为0.1mm，深度为0.1mm；核酸变性池直径为2.0mm，深度为1.0mm；扩增检测池直径为1.0mm，深度为1.0mm；溢流池直径为1.1mm，深度为1.0mm；加样池直径为2.0mm，深度为2.0mm；芯片的材质为聚甲基丙烯酸甲酯。
7.如权利要求1-3任一项所述的具有集成处理及扩增显色功能的自驱动微流控芯片，其特征在于：所述构建通道的纳米材料为超亲水ZXL-CQS纳米自
211087440_等温扩增荧光法快速鉴定羊肉掺假
分析检测等温扩增荧光法快速鉴定羊肉掺假段真文，许绍坤，张 薇，李鲜鲜，董文玥（云南瑞栢泰生物科技有限公司，云南昆明 650000）摘 要：本文建立了快速鉴定羊肉掺假的等温扩增荧光检测方法。
针对羊的线粒体Cytb基因设计两套引物，在恒温下，以直扩法处理的样本为模板进行扩增，通过特异性、灵敏度实验对该方法体系进行验证和分析。
结果表明，最佳反应温度为65 ℃，最低检测限为5.54×10-5 ng·μL-1。
本研究建立的等温扩增荧光法快速鉴定羊肉掺假结果准确可靠、反应快速，具有良好的特异性和灵敏度，可以同时满足实验室和现场检测要求，为快速鉴定羊肉种属提供了一种新的检测方法，为其他肉类种属快速鉴定提供理论依据。
关键词：等温扩增荧光检测方法；羊肉掺假；现场检测Rapid Identification of Mutton Adulteration by Isothermal Amplification Fluorescence MethodDUAN Zhenwen, XU Shaokun, ZHANG Wei, LI Xianxian, DONG Wenyue(Yunnan Rabetai Biotechnology Co., Ltd., Kunming 650000, China)Abstract: An isothermal amplification fluorescence detection method was developed for the rapid identification of mutton adulteration. Two sets of primers were designed for the mitochondrial Cytb gene of sheep. At constant temperature, the samples processed by direct expansion method were used as templates for amplification. The method system was verified and analyzed by specificity and sensitivity experiments. The results show that the optimum reaction temperature is 65 ℃ and the minimum detection limit is 5.54×10-5ng·μL-1.The isothermal amplification fluorescence method established in this study for rapid identification of mutton adulteration has accurate and reliable results, rapid response, good specificity and sensitivity, and can meet the requirements of laboratory and field detection at the same time, providing a new detection method for rapid identification of mutton species and providing theoretical basis for rapid identification of other meat species.Keywords: isothermal fluorescence amplification technology; meat adulteration; field detection随着肉类价格差异逐步拉大，以次充好的现象时有发生，这种行为不仅损害消费者的权益和健康，还会扰乱市场经济[1]。
重组酶聚合酶扩增技术的研究进展及其应用
重组酶聚合酶扩增技术的研究进展及其应用杜亚楠;赵笑;范小瑞;张琪;赵凯;许燕【摘要】重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种新型的恒温核酸扩增技术.本文介绍了RPA技术的扩增原理、引物设计、成本分析及产物检测等内容,归纳了RPA技术与其他等温扩增方法的优缺点,并对RPA技术在病原微生物、基因突变和食品安全检测中的应用现状进行了阐述.希望RPA技术可以得到更多生物学家的关注,更好地应用于生命科学的各个领域.【期刊名称】《上海农业学报》【年(卷),期】2018(034)006【总页数】6页(P117-122)【关键词】重组酶聚合酶扩增;核酸检测;引物设计;产物检测;研究进展【作者】杜亚楠;赵笑;范小瑞;张琪;赵凯;许燕【作者单位】上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海市农业科学院生物技术研究所,上海201106;上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海市农业科学院生物技术研究所,上海201106;上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234【正文语种】中文【中图分类】Q78核酸体外扩增技术是生命科学研究中最常用的技术之一。
聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，简称PCR)发明于1983年，目前已经成为应用最为广泛的核酸扩增技术[1]。
该技术特异性强、灵敏度高，但需要昂贵的控温循环仪，难以推广到现场检测。
近年来，随着分子生物学技术的不断发展，恒温核酸扩增技术的出现解决了PCR技术在仪器上的局限性。
该技术不需要温度循环且反应更加快速，非常适用于资源有限地区的现场检测[2]。
目前已报道的的恒温扩增技术有十几种[3]。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，简称RPA)是一种由重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换Bsu聚合酶参与的恒温扩增新技术[4]，可在23—45℃下连续进行反应，反应时间只需5—20min，特异性强、灵敏度高，非常适用于疾病诊断和现场检测。
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基于核酸等温扩增的病原微生物微流控检测技术
何祥鹏 1,2，邹秉杰 2 ，齐谢敏 2，陈杉 2 ，陆妍 2，黄青 3，周国华 1,2
【摘 要】 摘要:病原微生物的快速检测对疫情的预防控制至关重要。基于 PCR
的病原微生物核酸检测方法克服了传统病原微生物培养方法耗时长、免疫学检 测存在
窗口期等问题，已成为目前最主要的病原微生物筛查方法。然而，对精 确控温热循环
仪的依赖却严重限制了其在资源匮乏地区的应用。虽然基于核酸 等温扩增的病原微生
物检测方法可摆脱对高精度温控设备的依赖，但仍需要进 行样本核酸分离提取、扩增
与检测等步骤。近年来，微流控技术与核酸等温扩 增技术相结合，诞生了多种病原微
生物等温扩增微流控检测技术。该技术通过 设计芯片结构、优化进样模式及检测方式，
实现了病原微生物核酸提取、扩增 与检测一体化，并具备多重检测、定量检测等功能，
具有对仪器依赖度小、对 操作人员要求不高、样本量需求小和自动化程度高等优点，
适合于在多种环境 下的病原微生物快速检测。本文从核酸等温扩增原理、进样方式、
检测方式等 方面对核酸等温扩增病原微生物微流控检测技术进行了综述，以期为病原
微生 物的快速筛查提供更多的方案思路，提升公共卫生领域对传染性疾病的防控能 力。
【期刊名称】《遗传》
【年(卷),期】2019(041)007
【总页数】 14
【关键词】 关键词 : 病原微生物检测；等温扩增；微流控芯片
世界卫生组织 (World Health Organization,WHO) 发布的《 2018 世界卫生统 计报
告》指出，病原体依然是危害人类健康与生命的重要原因之一，尤其对