分子生物学实验方案设计

梅衣属ITS条形码物种的快速鉴定

实验目的：

一、学习并熟练地衣DNA提取技术

二、掌握PCR技术的原理及操作

三、DNA条形码技术的应用

实验技术路线：

1、地衣总DNA的提取

2、PCR扩增

3、基因测序

4、基因序列对比

地衣总DNA提取：

1.取带有子囊盘或未有子囊盘的带藻地衣体30~300mg，用无菌水冲洗，除去表面杂质，再用DNA提取液浸泡2~3h（4℃）。

2.将地衣体取出，滤纸吸干表面液体，剪碎放于预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状。

3.将粉末小心、全部转入1.5ml离心管中，加入400μL DNA提取液，混匀。

4.加入10% SDS 50μL 、氯化苄150μL，振荡混合，于50℃保温1h，每隔10min振

荡混合一次。

5.保温1h后，每管加入3mol/L NaAc 50μL，混匀冰浴15min.

6.用等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）和等体积酚：氯仿（1：1）各抽提一次，直至无白色沉淀为止。

7.移上清液于另一离心管，加入2倍体积无水乙醇，4℃放置2~3h ，15000r/min，离

心10min（4℃），弃上清液。

8.将沉淀用70%乙醇冲洗2次后，真空干燥，再加入50~80μL TE缓冲液，保存于冰

箱（4℃）

PCR扩增：

稀释50 倍用于后续 PCR 操作。真菌 ITS rDNA 由通用引物 ITS5 （ 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）、 ITS4 （ 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。

PCR 反应条件：95℃预变性 5min；95℃变性 30s，52℃退火 30s，72℃延伸 2min，反应 32 个循环；72℃延伸 10min，4℃保存。反应结束后，PCR 产物通过 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检验,ABI3730DNA 分析仪测序。

序列比对：

所获测序结果序列包含小亚基部分结尾序列、ITS1-5.8S-ITS2、大亚基部分起始序列，去除大小亚基部分序列后所得片段大小约 500bp，即为所需的序列

利用 DNAMAN（Lynnon Biosoft）软件将测序结果同 GenBank 下载数据进行比对分析，如果序列长度不同，则只保留共有区段。

如果该DNA序列与GenBank中梅衣属的某个种的序列相同，则可确定所测定的地衣是

哪个种。

实验试剂：

一、DNA提取

1、DNA提取液（50mmol/L Tris HCL pH9.0;12.5mmol/L EDTA pH8.0）:

（1）称取7.5712gTris,加入150ml蒸馏水，加HCL调pH至9.0，定容至250ml

（2）称取3.6531gEDTA，加入20ml蒸馏水，调pH至8.0，定容至250ml

2、10%SDS:称取10gSDS，加入100ml蒸馏水

3、NaAc：0.51g醋酸钠固体，加蒸馏水溶解，定容25ml

4、TE缓冲液：（1）1mol/L Tris-HCL(pH8.0) 1ml

(2)0.5mol/L EDTA(pH8.0) 0.2ml

超纯水至100ml

5、氯化苄

二、pcr试剂准备

1. DNA模版

2．对应目的基因的特异引物

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、详细配制比例

1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。10×PCR buffer 5μl

dNTP mix （2mM） 4μl

引物1（10pM）2μl

引物2（10pM）2μl

Taq酶（2U/μl）1μl

DNA模板（50ng-1μg/μl）1μl

加ddH2O至50μl

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：

模板DNA 2μL

引物1 1μL

引物2 1μL

dNTP 1.5μL

MgCl2 2μL

10×buffer 2μL

ddH2O 10μL

Taq酶 0.5μL