上海交大医学院细胞生物学技术考试重点样本

一、显微镜技术

1、分辨率( resolution) : 用于表示人眼和仪器, 能够辨别两点之间最小距离

的标志, 是衡量显微镜性能的重要指标。

人眼的分辨率由人眼的生理结构决定。光镜由光波波长和物镜数值孔径决

定。电镜由电子束半波长决定。分辨率极限：人眼(0.1mm);光镜(0.2卩m); 电镜

( 0.2nm) 。

显微镜技术优化核心是提高分辨率, 体现在两个方面： ( 1) 光源的采用( 2) 样品制备和信号呈现方法使信噪比提高。

2、显微镜分类：

(1)光学显微镜：普通光学显微镜; 荧光显微镜( 激光扫描共聚焦显微镜、超高分辨率荧光显微镜、活细胞荧光工作站) ; 相差显微镜：观察活细胞; 微分干涉相差显微镜( DIC) ：活细胞三维立体投影影像

(2)电子显微镜：透射电子显微镜( TEM) ; 扫描电子显微镜( SEM) ; 分析电子显微镜; 高压电子显微镜; 冷冻电子显微镜

(3 )扫描探针显微镜：原子力显微镜

3、普通光学显微镜主要三部分：聚光镜、物镜、目镜; 光源：可见光样品制备5步：固定( 甲醛) ; 脱水( 乙醇) ; 包埋( 石蜡) ; 冰冻切片( 1-10 卩m);苏木精伊红染色(HE染色)

4、荧光显微镜光源：高压汞灯、弧光灯

荧光的来源： ( 1) 细胞和组织自发荧光( 2) 外源导入荧光蛋白：动态检测、活体检测、长时间检测、容易融合( 3) 荧光染料：吖啶橙染色DNA( 绿) 、RNA( 橙) ( 4) 荧光标记抗体：荧光染料与抗体共价结合( 5) 荧光探针：金属离子探针、细胞内pH值~、细胞内活性氧~、线粒体跨膜电位~。

5、荧光素( Fluorphore) ：吸收能量后具有发光现象的物质, 一般为吸收短波长的能量后发散出长波长的光, 并随照射停止而消失。荧光素发射光减弱( 光漂白) 或消失( 淬灭) 。

6、激光扫描共聚焦显微镜( LSCM)：以激光作为激发光源, 采用光源针孔与检测

针孔共聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统。

7、简述激光扫描共聚焦显微镜的原理(光源点，物点，像点，三点共轭)

以激光作为激发光源；结构上采用双针孔装置，形成物像共聚焦的独特设计；激光经过聚光镜焦平面上针孔形成点光源，再经物镜在焦平面对样品逐点扫描。样品上每个照射点经反射镜在像焦平面的探测针孔处成像，被光电倍增管探测器接收，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面共聚焦图像。

&激光扫描共聚焦显微镜的功能：

(1) 薄层断层扫描(光学切片)

(2) 多通道同时扫描：激光共聚焦显微镜能够多激光多通道同时扫描

(3) ZOOM成像：在不变换镜头的情况下，对某幅图片的局部放大，并进行精细逐点扫描成像，获得高分辨率图像。

(4) 多维度扫描：Z轴扫描(垂直)或T扫描(时间)

(5) 荧光定量分析

9、激光扫描共聚焦显微镜技术在医学及生物学研究中的应用

(1) 静态：分子定位、定量分析、分子间相互作用

(2) 动态：分子或细胞活动的动态变化：蛋白质的移位；蛋白质相互作用的研究(FRET)

；分子运动的测量(FRAP);离子浓度变化趋势的检测

10、简述激光扫描共焦显微镜与荧光显微镜的差别。LSCM勺优缺点。

LSCM勺优缺点：

LSCM优点:(1) 高水平分辨率：0.18卩m( 2)高垂直分辨率：沿Z轴逐层扫描(3) 高灵敏度，信噪比良好(4)能定时、定位、定性、定量

缺点：(1)分辨率极限：0.15卩m( 2)观测厚度：50-100卩m( 3)逐点扫描,成

像速度慢(4)伪彩色

11、LSCM和电子显微镜的区别

12、超高分辨率荧光显微镜的原理：”突破”衍射极限，提高分辨率(50nm)

(1) 基于点扩展函数调制：点扩展函数变小

(2) 基于随机单分子定位：不会有两个靠的很近的点同时亮起来

13、电子显微镜：以电子束为光源，电磁场为透镜，利用电子信号成像，具有高分辨率和放大倍数的显微镜，用于研究组织和细胞的超微结构。

14、电子束：又称电子射线，电子束带负电荷，具有光的波动性、可折射性，电镜利用电子束作为”光源”成像。

15、透射电子：当样品厚度小于100nm时，部分电子可穿透样品，将穿透样品的电子叫做透射电子，利用透射电子信息成像的称为透射电镜。

16、二次电子：在入射电子的轰击下，样品表面5-50 nm深度激发出来的电子称为二次电子，利用二次电子信息成像的称为扫描电镜。

17、TEM成像和工作原理：

(1) 电子束投射在样品上，部分电子直接穿透样品产生透射电子

(2) 带有样品信息的透射电子经成像系统放大，投射到荧光屏上

(3) 透射电子多，荧光屏亮；反之荧光屏暗，荧光屏的亮暗程度与样品微细结构一一对应，产生具有一定反差的黑白影像

18、超薄切片：将环氧树脂包埋的组织块切成100nm以下的薄切片称为超薄切片, 超薄切片经电子染色后在TEM 下观察组织细胞内部的超微结构。

19、血管灌注固定: 血管灌注固定是经过血管灌注适量的固定剂, 在动物体内把活

细胞在原位及时固定。血管灌注固定速度快, 固定均匀, 可减少离体或死亡后缺氧引起自发性的变化影响, 特别是对脑、心肌、肾脏等对缺氧比较敏感的组织尤为重要。

20、TEM 的样品制备

（ 1）超薄切片技术（ 9 步） : 取材（ 1 分钟内将新鲜标本放入固定液） ; 预固定（新鲜配制 2.5%戊二醛） ; 后固定（ 1%锇酸） ; 脱水（乙醇和丙酮） ; 浸透; 包埋聚合（环氧树脂） ; 修块; 切片（半薄切片: 500nm; 超薄切片: 50-100nm） ; 染色（甲苯胺蓝）。

（ 2）负染色技术: 经过重金属盐在样品四周堆积, 加强样品外周的电子密度, 衬托样品的形态和大小。（染色液: 磷钨酸、醋酸双氧铀）

（ 3）免疫电镜技术: 是将免疫学方法与电子显微镜技术相结合, 利用抗原与抗体特异结合的特性, 在超微结构水平定位特异大分子的技术。

A、包埋前法：先免疫标记，后包埋，制备超薄切片；包埋后法：先包埋，制备超薄切片, 后免疫标记; 冷冻超薄切片法: 将标本直接切成超薄切片, 进行免疫反应, 电镜观察。

B、推荐固定液：3〜4 %多聚甲醛 + 0. 1 %〜0.5 %戊二醛；

C、要求：免疫组化结果一定要好；固定液配制要新鲜；尽快处理标本。

21 、在样本制备过程中为什么要进行半薄切片定位?

（ 1）选取超薄切片的部位, 超薄切片的面积一般要小于0.5mm2, 要经过半薄切片来选取有意义的部位。

（ 2）对同一部位进行光、电镜对比观察, 在较大范围内了解组织结构、病变部位和病理性质, 有利于更确切的认识超薄切片中的结构及其相互关系。

22、要了解细胞内部的超微结构变化, 选择哪种类型的电镜, 为保证生物样品良好的超微结构, 在样本取材及固定时应注意什么?

了解细胞内部的超微结构变化应选择透射电子显微镜（ TEM）

为保证良好的超微结构, 在样本取材及固定时应注意做到快、小、轻、冷。( 1) 快: 在1 分钟内固定组织, 尽可能保持其活体状态, 因为瞬间的拖延都会导致细