心肾不交所致失眠大鼠模型_郜红利

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心肾不交所致失眠大鼠模型

郜红利1，涂星2*，卢映2，孙敏红3，张方

4

（1．湖北民族学院中医药学院，湖北恩施445000；2．广州中医药大学第一临床医学院，广东广州510405；3．湖北省恩施州疾病控制中心，湖北恩施445000；4、湖北省恩施自治州优抚医院，湖北恩施

445000）

收稿日期：2013-10-12作者简介：郜红利（1967—），男，副教授，研究方向：民族药物的开发与利用。E-mail ：349523825@qq．com *通信作者：涂

星（1987—），男，博士生，研究方向：中药药理学，药物制剂新剂型与新技术。E-

mail ：kuangsheng1234@126．com 摘要：目的

建立同时符合中医“心肾不交”和下丘脑-垂体-肾上腺轴紊乱的失眠大鼠模型。方法

采用母乳鼠分离

法、多种焦虑刺激和腹腔注射对氯苯丙氨酸造失眠模型，并考察受试大鼠的一般行为学、血象及血浆Orexin 、促肾上腺皮质激素释放激素（CＲH ）、促肾上腺皮质激素（ACTH ）的水平。结果模型组大鼠睡眠时间显著减少，目光呆

滞，双目、口唇呈苍白色，爪甲较光滑，皮毛重度枯槁蓬乱；血象检查血浆中红细胞数目和血红蛋白水平显著降低；

血浆中ACTH 、Orexin 、CＲH 水平显著性升高。结论本实验的失眠大鼠模型能体现了“心肾不交”所致下丘脑-垂

体-肾上腺轴内分泌紊乱的失眠发生特点。

关键词：失眠；心肾不交；下丘脑-垂体-肾上腺轴；动物模型；激素分泌中图分类号：Ｒ285.5

文献标志码：A

文章编号：1001-1528（2014）06-1138-04doi ：10.3969/j．issn．1001-1528.2014.06.006

Ｒat model for insomnia caused by heart-kidney imbalance

GAO Hong-li 1，

TU Xing 2，

LU Ying 2，

SUN Min-hong 3，

ZHANG Fang 4

（1．Institute of Traditional Chinese Medicine ，Hubei Institute for Nationalities ，Enshi 445000，China ；2．The First Affiliated Hospital of Guangzhou Uni-versity of Chinese Medicine ，Guangzhou 510405，China ；3．The Enshi Center for Disease Control and Prevention ，Enshi 445000，China ；4．Special Care Hospital of Enshi ，Enshi 445000，China ）

ABSTＲACT ：AIM To establish a rat model for insomnia that was consistent with both heart-kidney imbalance

and disorder of hypothalamic-pituitary-adrenal （HPA ）axis．METHODS

Maternal separation ，multiple anxiety

stimulation ，and the abdominal administration of chlorophenylalamine were adopted to induce rats with insomnia．The general behavior of rats was observed and their hemogram and the levels of ACTH ，orexin ，CＲH were meas-ured．ＲESULTS

Compared to the control group ，the rats in the model group showed sleep-less ，glassy-eyed ，

pale lips ，and withered fur．The number of red blood cells and the hemoglobin concentration in plasma decreased significantly as well ，while the level of ACTH ，orexin and CＲH significantly increased．CONCLUSION The in-somnia rats can present the symptom of heart-kidney imbalance and dysfunction of hypothalamic-pituitary-adrenal

axis．

KEY WOＲDS ：insomnia ；heart-kidney imbalance ；hypothalamic-pituitary-adrenal （HPA ）axis ；animal model ；hormone secretion

8

311

失眠（insomnia）是指患者对睡眠时间和（或）睡眠质量不满足并影响白天社会功能的一种主观体验［1］。研究表明，应激是导致失眠的重要原因，其病理生理基础是下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）过于兴奋和亢进，orexin是一种兴奋性神经肽激素，有强大的促觉醒效果，在维持觉醒状态中起着关键作用，HPA轴通路分泌的促肾上腺皮质激素释放激素（CＲH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）对于应激和觉醒状态维持也具有重要意义［2-5］。目前，由于中医药治疗疾病辨证论治的特色，缺乏中医症候动物模型给研究者带来了巨大的难题。本实验拟采取多因素共同作用制作“心肾不交”所致HPA轴紊乱的动物模型，并对其进行评价，以期为后续研究提供合理科学的研究对象。1材料

1.1动物健康SD大鼠窝鼠（出生2d）3窝，每窝8只，雌雄不限，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（粤）2013-0020。大鼠饲养环境为温度（20?2）?，相对湿度50% 70%，自然光节律。

1.2药物与试剂对氯苯丙氨酸（PCPA，美国sigma公司）；ACTH、orexin、CＲH酶联免疫试剂盒（Ｒ＆B公司，U.S.A），其他试剂均为分析纯。

1.3仪器酶标仪（MK3型，Thermo Labsystem 公司）；微量有机分析专用超纯水机（伊洋企业发展有限公司）；大鼠自主活动测试仪（成都泰盟科技有限公司）；全自动无创血压测量系统BP-100A （成都泰盟科技有限公司）；Anke TGL-16B离心机；JK5200B超声波清洗器；分析天平等。

2方法

2.1失眠动物模型的制作［6-7］将出生2d的3窝乳鼠按窝分成两组，正常组1窝8只，模型组2窝16只，与母鼠同笼饲养。模型组第3天开始乳鼠与母鼠每天分离180min，至第21天离乳；第22天至第35天，每天对乳鼠随机给予刺激：四肢束缚2h、4?冰水游泳5min、禁食24h、禁水24h、夹尾1min、明暗颠倒24h、电击足底10min（电流强度1mA，电压30V，每隔10s刺激1次，每次持续1s，共60次）、鼠笼倾斜45?24h、潮湿垫料24h等10种刺激随机不连续地刺激，每天1种，每种刺激平均出现1 2次，使动物不能预料刺激的发生；第35 37天，每天上午8?00—8?30按10mL/kg用量腹腔注射PCPA液。正常组小鼠前35d不做任何处理，第35 37天同时间等量腹腔注射弱碱性生理盐水（pH7 8）。2.2模型的评价

2.2.1大鼠一般行为学通过摄像头观察睡眠时间，正常状态下观察活动量、精神状况、双目、口唇、爪甲、皮毛等。第37天观察比较各组大鼠的体表特征，并进行体表特征积分评分［7］。评分标准：①精神状态及对外界的刺激反应；②眼睛眼裂变窄，嗜睡等；③面部、口鼻黏膜和爪；④食欲、体质量和消瘦程度；⑤皮毛毛色和光泽。按照5个等级进行积分，状态好的5分，状态差为1分，共计25分。将大鼠放入自主活动仪中，待小鼠适应5min后，计数并打印3min内站立次数，连续2次，取平均值进行统计分析。

2.2.2血象分别于21、35、37d将大鼠抓取固定，充分暴露胸部，眼科剪去毛，常规消毒，以4号针头注射器选取心搏最强处进针，调整进针深浅，缓慢抽动注射器，取少许血液，进行血象检查。

2.2.3心率和收缩压大鼠在安静清醒状态下，放置在自制透明玻璃盒（12cm?5cm?7cm，大鼠可前后活动，不能转身）中，日光灯照射尾部加温，用全自动无创血压测量系统测量大鼠尾动脉血压，第21、第35、第37天每只大鼠平行测定3次，读取收缩压和取心率。

2.2.4血浆ACTH、orexin、CＲH的检测第37天抓取正常组和模型组大鼠各8只，眼眶静脉丛采血3 4次，收集静脉血4mL，3000r/min离心5min，取上清液，采用酶联免疫吸附法按照ELISA试剂盒说明书检测ACTH、orexin、CＲH的水平。

2.3数据处理与分析采用SPSS1

3.0统计软件进行数据的处理和分析，计数资料均采用均数?标准差（x?s）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为有显著性统计学差异，以P＜0.01为有极显著性差异。

3结果

3.1大鼠一般行为学造模开始前各组动物均睡眠良好，精神状态，目光有神，双目、口唇呈粉红色，爪甲光滑，皮毛润泽，呈白色。模型组37d，动物在睡眠剥夺早期表现为一定的兴奋性行为，如活动增多，对外界声、光等刺激敏感；睡眠剥夺中后期行为由兴奋逐渐转为抑制状态，多数动物目光呆滞，双目、口唇呈苍白色，爪甲较光滑，皮毛重度枯槁蓬乱，抓取时反抗剧烈。其体表特征和自主

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活动情况观察结果见表1。

表1大鼠一般行为学特征变化分析（x?s，n=8）Tab.1Behavioral characteristics change analysis of insom-nic rats（x?s，n=8）

组别3min内大鼠活动次数大鼠体表特征评分

正常对照组7.10?1.52424.50?0.527

模型对照组31.13?3.441*14.63?1.188*

注：与正常对照组比较，*P＜0.013.2血象检查结果结果见表2，在第22天时外周血红细胞总数和血红蛋白水平模型组与正常组无显著性差异，但数值略有降低；在第35天时模型组与正常组的外周血红细胞总数和血红蛋白水平有显著性差异，模型组显著低于正常组；在第37天时，模型组与正常组的外周血红细胞总数和血红蛋白水平有极显著性差异，模型组极显著低于正常组。

表2不同阶段大鼠血象检查结果（x?s，n=8）

Tab.2Blood picture test results of insomnic rats at different stages（x?s，n=8）

组别

红细胞总数/（?1012·L－1）血红蛋白/（g·L－1）

第22天第35天第37天第22天第35天第37天

正常组8.52?1.388.47?1.528.54?1.08134.52?3.67136.18?4.04142.43?3.12模型组8.31?0.987.23?1.05* 4.57?1.36＊＊129.61?2.72110.31?1.75＊＊89.45?2.37＊＊

注：与正常对照组相较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

3.3大鼠尾血压值及心率的变化结果见表3，在第22天时模型组与正常组大鼠收缩压无显著性差异，但数值略有升高，而心率有显著性差异；在第35天时模型组与正常组的收缩压有显著性差异，心率有极显著性差异；在第37天时，模型组与正常组的收缩压和心率均有极显著性差异，模型组显著高于正常组。

表3不同阶段大鼠尾血压值及心率变化结果（x?s，n=8）（1mmHg=0.133kPa）Tab.3Blood pressure and heart rate changes of insomnic rats at different stages（x?s，n=8）

组别

收缩压/mmHg心率/（次·min－1）

第22天第35天第37天第22天第35天第37天

正常组114.72?19.68115.97?12.56117.36?11.22381.32?33.51389.27?41.37382.62?37.19模型组128.51?12.18*131.29?13.11*144.82?9.59＊＊389.92?42.72*412.31?52.39＊＊428.67?22.42＊＊

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

3.4血浆ACTH、orexin、CＲH水平结果见表

4，由表可见，模型组大鼠血浆中ATCH、CＲH和

orexin水平较正常组大鼠极显著性升高（P＜

0.01）。

表4两组大鼠血浆ATCH、orexin和CＲH水平分析

（x?s，n=8）

Tab.4ACTH，orexin and CＲH in blood between the two

groups（x?s，n=8）

组别

ATCH

/（ng·L－1）

CＲH

/（ng·mL－1）

orexin

/（?10－3·ng·mL－1）

正常组543.65?23.9216.92?2.1722.66?5.72

模型组973.68?79.82＊＊31.08?1.78＊＊32.73?13.02＊＊

注：与正常对照组比较，＊＊P＜0.01

4讨论

现代研究表明，儿童受虐待是一个常见的可能导致个体在成人期易患失眠症的早期应激，该个体伴有持续的HPA系统活性增强及皮质醇的响应性增加［8-9］。本研究中采取母婴分离方法造成幼儿期的早期应激，发现其对大鼠一般行为学及血象无明显影响，但显著性增加大鼠的收缩压、加速心脏搏动，表明母婴分离操作可能会导致大鼠心气虚的症状。

在导致失眠的环境危险因素中，有一大部分与HPA轴亢进有关，而环境应激所致心理层面反应以及生理层面的HPA轴内分泌紊乱是主要原因［10-11］。本研究对HPA轴中ATCH、CＲH的水平进行了考察，发现模型组大鼠血浆中orexin、ACTH和CＲH的水平较正常组大鼠极显著性升高，提示通过多因素刺激可以导致HPA轴激活，使CＲH、ACTH合成和分泌增多，而这些激素分泌量的增加可促使大脑皮质或脑干神经元觉醒，可能是orexin促进觉醒的机制之一。

对氯苯丙氨酸是一种5-HT合成抑制剂，运用PCPA腹腔注射大鼠可以抑制大鼠大脑5-HT合成，造成昼夜节律小时，几乎达到完全失眠［12-13］。现代研究表明，PCPA诱导的动物模型属于中医心肾不交的症候模型［14］。本研究在中医心肾不交理论的指导下，采取多因素共同作用制作失眠大鼠模型时也出现了HPA轴内分泌紊乱的特点，表明该模型能满足HPA轴紊乱的相关机制和给药研究的

0411

需要。

综上所述，在早期母婴分离的基础上，采用多种物理刺激法结合腹腔注射PCPA剥夺睡眠法制作HPA轴紊乱的失眠大鼠模型，较成功的模拟出失眠的相关症候，这为探索失眠发生发展机制奠定了重要基础，也为治疗失眠的中药新药开发提供了更加科学合理的动物模型。但本研究缺乏对该失眠动物模型进行药物反证，尚有待进一步研究和探讨。

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