水稻原生质体 高尔基体 亚细胞定位
水稻原生质体 亚细胞定位
水稻原生质体亚细胞定位
水稻原生质体的亚细胞定位可以分为以下几个方面：
1.细胞壁：水稻原生质体中的细胞壁是由纤维素、半纤维素和鞣质等
多种复杂化合物组成的，其主要功能是提供细胞形态的支持和维持细胞的
稳定性。
2.细胞膜：水稻原生质体的细胞膜是由磷脂双分子层和膜蛋白组成的，其主要功能是控制细胞内外物质的运输和细胞对外界环境的响应。
3.叶绿体：水稻原生质体中的叶绿体是光合作用的主要场所，其内部
含有类囊体、色素分子和酶等多种结构和物质。
4.线粒体：水稻原生质体中的线粒体是细胞内能量合成的主要场所，
其内部含有呼吸链复合物、ATP合成酶和核酸等多种结构和物质。
5.内质网：水稻原生质体中的内质网主要参与细胞对外界物质的吸收、存储和分泌等生物化学反应，在原生质体中主要定位于细胞质中。
6.高尔基体：水稻原生质体中的高尔基体是负责蛋白质和脂类物质的
修饰和运输的主要细胞器，其主要定位于细胞质中的区域。
高尔基体概述
高尔基体概述高尔基体（Golgi apparatus）是由许多扁平的囊泡构成的以分泌为主要功能的细胞器。
又称高尔基器或高尔基复合体；在高等植物细胞中称分散高尔基体。
最早发现于1855年，1898年由意大利人卡米洛•高尔基（Camillo Golgi，1844-1926）在光学显微镜下研究银盐浸染的猫头鹰神经细胞内观察到了清晰的结构，因此定名为高尔基体。
因为这种细胞器的折射率与细胞质基质很相近，所以在活细胞中不易看到。
高尔基体从发现至今已有100多年的历史，其中一半以上的时间是进行关于高尔基体的形态甚至是它是否真实存在的争论。
细胞学家赋予它几十种不同的名称，也有很多人认为高尔基体是由于固定和染色而产生的人工假像。
直到20世纪50年代应用电子显微镜才清晰地看出它的亚显微结构。
它不仅存在于动植物细胞中，而且也存在于原生动物和真菌细胞内。
形态与组成高尔基体是由数个扁平囊泡堆在一起形成的高度有极性的细胞器。
常分布于内质网与细胞膜之间，呈弓形或半球形，凸出的一面对着内质网称为形成面（forming face）或顺面（cis face）。
凹进的一面对着质膜称为成熟面（mature face）或反面（trans face）。
顺面和反面都有一些或大或小的运输小泡，在具有极性的细胞中，高尔基体常大量分布于分泌端的细胞质中。
顺面和反面都有一些或大或小的运输小泡（图6-24），在具有极性的细胞中，高尔基体常大量分布于分泌端的细胞质中（图6-25）。
图6-24高尔基体各部分的名称图6-25培养的上皮细胞中高尔基体的分布（高尔基体为红色，核为绿色）引自/因其看上极像滑面内质网，因此有科学家认为它是由滑面内质网进化而来的。
扁平囊的直径为1μm，由单层膜构成，膜厚6~7nm，中间形成囊腔，周缘多呈泡状，4~8个扁平囊在一起，某些藻类可达一二十个，构成高尔基体的主体，称为高尔基堆（Golgi stack）。
高尔基体膜含有大约60%的蛋白和40%的脂类，具有一些和ER共同的蛋白成分。
不同水稻品种OsVDAC8的表达模式比较与亚细胞定位分析
不同水稻品种ＯｓＶＤＡＣ８的表达模式比较与亚细胞定位分析蒋晓涵，覃永华，刘学群，李开，王春台∗（中南民族大学生命科学学院生物技术国家民委重点实验室／武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，湖北武汉４３００７４）摘要㊀［目的］研究ＯｓＶＤＡＣ８的理化性质和表达模式，为探究ＯｓＶＤＡＣ８的功能提供基础㊂［方法］用生物信息学分析ＯｓＶＤＡＣ８的结构特征及表达谱，然后通过定量ＰＣＲ对３个不同水稻品种日本晴（ＮＩＰ）㊁粤泰Ａ（ＹＴＡ）㊁粤泰Ｂ（ＹＴＢ）不同发育时期的不同组织中ＯｓＶ⁃ＤＡＣ８的表达模式进行分析，并通过ＢｉＦＣ对亚细胞定位进行验证㊂［结果］ＯｓＶＤＡＣ８编码区全长１０１４ｂｐ，编码３３７ａａ，生物信息学分析结果显示，ＯｓＶＤＡＣ８是具有１个结构域的稳定的定位于线粒体的亲水蛋白，通过１１次跨膜形成特异的桶状结构㊂在ＡＴＧ上游含有１３个与水稻生长发育及胁迫应答相关的顺式作用元件㊂ＲｉｃｅＸＰｒｏ和ＭＳＵＲｉｃｅＧｅｎｏｍｅＡｎｎｏｔａｔｉｏｎＰｒｏｊｅｃｔ水稻基因表达数据库分析结果表明，ＮＩＰ中ＯｓＶＤＡＣ８在生殖生长期的茎和花序出现前后幼穗中表达水平最高，在胚乳和根中的表达量较低㊂对ＮＩＰ㊁ＹＴＡ㊁ＹＴＢ３个水稻品种中ＯｓＶＤＡＣ８的表达谱分析结果显示，ＯｓＶＤＡＣ８在３个水稻品种四叶期的叶鞘表达水平都非常高，在花粉内容物充实期都很低，但幼穗发育的不同时期３个品种中表达水平差异很大，ＮＩＰ中幼穗发育的整个时期表达量比较稳定，ＹＴＢ中表达量较低，而在ＹＴＡ幼穗发育的中后期表达水平逐渐下降㊂亚细胞定位结果显示，ＯｓＶＤＡＣ８定位于线粒体，与预测结果一致㊂［结论］ＯｓＶＤＡＣ８在３个水稻品种中表达模式不同，ＹＴＢ中整个幼穗发育过程中表达量较低，ＹＴＡ幼穗发育的中后期表达水平逐渐下降，而ＮＩＰ中幼穗发育的整个时期表达量都比较稳定㊂ＯｓＶＤＡＣ８定位于线粒体㊂关键词㊀水稻；ＯｓＶＤＡＣ８；表达模式；亚细胞定位中图分类号㊀Ｓ５１１㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀０５１７－６６１１（２０２４）０４－００８１－０６ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２４．０４．０１７㊀㊀㊀㊀㊀开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＰａｔｔｅｒｎｓｉｎＤｉｆｆｅｒｅｎｔＲｉｃｅＶａｒｉｅｔｉｅｓａｎｄＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＯｓＶＤＡＣ８ＪＩＡＮＧＸｉａｏ⁃ｈａｎ，ＱＩＮＹｏｎｇ⁃ｈｕａ，ＬＩＵＸｕｅ⁃ｑｕｎｅｔａｌ㊀（ＨｕｂｅｉＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＳｐｅｃｉａｌＰｌａｎｔｓｉｎＷｕｌｉｎｇＡｒｅａｏｆＣｈｉｎａ，ＫｅｙＬａｂｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｔａｔｅＥｔｈｎｉｃＡｆｆａｉｒｓＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ⁃ＣｅｎｔｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｆｏｒＮａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｗｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ４３００７４）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀［Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｐｈｙｓｉｃａｌａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆＯｓＶＤＡＣ８ｆｏｒｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｂａｓｉｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｉｎ⁃ｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＯｓＶＤＡＣ８．［Ｍｅｔｈｏｄ］ＴｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｏｆＯｓＶＤＡＣ８ｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ⁃ｔｉｃｓ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆＯｓＶＤＡＣ８ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆｔｈｒｅｅｒｉｃｅｖａｒｉｅｔｉｅｓ，Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ（ＮＩＰ），ＹｕｅｔａｉＡ（ＹＴＡ）ａｎｄＹｕｅｔａｉＢ（ＹＴＢ）ａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｓｔａｇｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，ａｎｄｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈＢｉＦＣ．［Ｒｅｓｕｌｔ］Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ１０１４ｂｐａｎｄｅｎｃｏｄｅｓ３３７ａａｉｎｔｈｅＯｓＶＤＡＣ８ｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＯｓＶＤＡＣ８ｉｓａｓｔａｂｌｅｈｙ⁃ｄｒｏｐｈｉｌｉｃｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｏｎｅｄｏｍａｉｎｌｏｃａｌｉｚｅｄｔｏｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，ａｎｄｆｏｒｍｓａｓｐｅｃｉｆｉｃｂａｒｒｅｌ⁃ｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｔｈｒｏｕｇｈ１１ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｔｈｅｒｅａｒｅ１３ｃｉｓ⁃ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｒｉｃｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎｔｈｅｕｐｓｔｒｅａｍｏｆＡＴＧ．ＡｎａｌｙｓｉｓｖｉａｒｉｃｅＸＰｒｏａｎｄＭＳＵＲｉｃｅＧｅｎｏｍｅＡｎｎｏｔａｔｉｏｎＰｒｏｊｅｃｔｒｉｃｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｂａｓｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＯｓＶＤＡＣ８ｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｓｔｅｍａｎｄｐａｎｉｃｌｅｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｔｈｅａｐ⁃ｐｅａｒａｎｃｅｏｆｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｇｒｏｗｔｈｐｅｒｉｏｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｌｏｗｉｎｔｈｅｅｎｄｏｓｐｅｒｍａｎｄｒｏｏｔｉｎＮＩＰ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＯｓＶＤＡＣ８ｉｎｔｈｒｅｅｒｉｃｅｖａｒｉｅｔｉｅｓＮＩＰ，ＹＴＡａｎｄＹＴＢｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｌｅａｆｓｈｅａｔｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＯｓＶＤＡＣ８ｗａｓｖｅｒｙｈｉｇｈｉｎｔｈｅｆｏｕｒ⁃ｌｅａｆｓｔａｇｅｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｒｉｃｅｖａｒｉｅｔｉｅｓａｎｄｖｅｒｙｌｏｗｉｎｔｈｅｐｏｌｌｅｎｃｏｎｔｅｎｔｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓｔａｇｅ，ｂｕｔｖｅｒｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｔｈｅｔｈｒｅｅｒｉｃｅｖａｒｉｅｔｉｅｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆｙｏｕｎｇｐａｎｉｃｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＩｎＮＩＰ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｗａｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｓｔａｂｌｅｄｕｒｉｎｇｔｈｅｗｈｏｌｅｓｔａｇｅｏｆｙｏｕｎｇｐａｎｉｃｌｅｄｅ⁃ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｗｈｉｌｅｉｎＹＴＢ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｗａｓｌｏｗ，ａｎｄｉｎＹＴＡ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｄｅｃｒｅａｓｅｄｇｒａｄｕａｌｌｙｄｕｒｉｎｇｔｈｅｍｉｄｄｌｅａｎｄｌａｔｅｓｔａｇｅｏｆｙｏｕｎｇｐａｎｉｃｌｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＴｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＯｓＶＤＡＣ８ｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｔｏｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ，ｗｈｉｃｈｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓ．［Ｃｏｎｃｌｕｔｉｏｎ］ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆＯｓＶＤＡＣ８ｗｅｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｉｃｅｖａｒｉｅｔｉｅｓ．ＯｓＶＤＡＣ８ｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｔｏｍｉｔｏ⁃ｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｒｉｃｅ；ＯｓＶＤＡＣ８；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎ；Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ基金项目㊀国家自然科学基金项目（３１１７０２２６）㊂作者简介㊀蒋晓涵（１９９９ ），女，湖北荆门人，硕士研究生，研究方向：分子遗传学㊂∗通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事分子遗传学研究㊂收稿日期㊀２０２３－０３－１９㊀㊀电压依赖性阴离子通道（ＶＤＡＣ）是定位于线粒体外膜的主要转运蛋白，最初从酵母中分离出来，存在于从真菌到动物和植物的所有生物体中［１］㊂哺乳动物和昆虫ＶＤＡＣ是一个由１９条反向平行反向链组成的桶状结构，其中Ｎ端螺旋折叠到孔中［２］㊂所有生物体的ＶＤＡＣ具有相似的基本电生理特性（电导㊁选择性和电压依赖性）［３］㊂线粒体和细胞质之间的无机离子和代谢物的交换对于许多线粒体功能是必不可少的㊂多种转运蛋白（离子通道㊁载体和ＡＢＣ转运蛋白）介导通过线粒体内膜（ＭＩＭ）的选择性转运［４］㊂相比之下，ＶＤＡＣ是线粒体外膜（ＭＯＭ）中多种化合物的主要转运途径，如无机离子（如Ｋ＋㊁Ｎａ＋和Ｃｌ－）㊁代谢物（如ＡＴＰ和ＡＭＰ）和大分子（如ｔＲＮＡ）等［５］㊂ＶＤＡＣ的开放状态对多价阴离子代谢物（如ＡＴＰ）具有阴离子选择性和渗透性㊂而ＶＤＡＣ的关闭状态使通道有阳离子选择性㊂然而，通道仍然具有足够的电导性，可以传输小离子［６］㊂ＶＤＡＣ的开放／关闭对机体的细胞器代谢具有重要的调节作用㊂除了调节代谢物转运的功能外，ＶＤＡＣｓ还参与了细胞的程序性死亡［７］㊂植物ＶＤＡＣ不仅参与植物发育过程，还参与环境应激反应［８］㊂拟南芥ＡｔＶＤＡＣ２和ＡｔＶＤＡＣ４中的Ｔ－ＤＮＡ插入敲除突变导致成熟叶片的生长严重迟缓㊂除ａｔｖｄａｃ３外，所有敲除突变体的花粉粒数㊁花粉发芽率和发芽花粉管长度均显著降低［９］㊂ＡｔＶＤＡＣ１能调节拟南芥对农杆菌感染的能力［１０］，ＡｔＶＤＡＣ２参与盐胁迫反应途径［１１］㊂小麦ＴａＶＤＡＣ１的过表达（ＯＥ）增强了转基因拟南芥对盐胁迫的耐受性并降低了对安徽农业科学，Ｊ．ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．２０２４，５２（４）：８１－８６㊀㊀㊀干旱的抗性［１２］㊂ＡｔＶＤＡＣ３和硫氧还蛋白ｍ２（ＡｔＴｒｘｍ２）之间存在相互作用均调节ＲＯＳ的积累，且ＡｔＶＤＡＣ３的过表达增加了Ｈ２Ｏ２的积累，而ＡｔＴｒｘｍ２的过表达减少了ＮａＣｌ处理中Ｈ２Ｏ２的积累［１３］㊂因此，植物ＶＤＡＣｓ在调节植物生长及应对压力方面发挥关键作用［１４］㊂通过水稻全基因组扫描鉴定出了８个ＯｓＶＤＡＣ基因［１５］，并利用生物信息学网站分析了ＯｓＶＤＡＣ１－８基因精细结构［１６］㊂ＯｓＶＤＡＣ３在生殖生长期的茎㊁花序出现前后幼穗及雄蕊成熟花粉中表达水平最高，ＯｓＶＤＡＣ３的表达可能与雄性的育性相关［１７］㊂ＯｓＶＤＡＣ５在水稻各个部位不同时期均有高表达［１８］，ＯｓＶＤＡＣ６可能与水稻耐盐和耐旱有关［１９］；ｏｓｖｄａｃ４纯合突变体幼苗对ＡＢＡ胁迫具有更好的抗性［２０］㊂ＯｓＶＤＡＣ家族中ＯｓＶＤＡＣ８鲜见报道㊂笔者通过生物信息学方法分析其表达谱㊁预测其顺式作用元件，并以３个水稻品种（日本晴㊁红莲型不育系粤泰Ａ和保持系粤泰Ｂ）不同发育时期幼穗以及四叶期幼苗根㊁鞘和叶为材料，对ＯｓＶＤＡＣ８基因表达模式进行分析，旨在为研究ＯｓＶＤＡＣ８的功能提供参考㊂１㊀材料与方法１．１㊀材料㊀水稻品种日本晴（ＮＩＰ）㊁红莲型不育系粤泰Ａ（ＹＴＡ）及保持系粤泰Ｂ（ＹＴＢ）种子，ＨＢＴ－ＧＦＰ质粒㊁ＤＨ５α菌株均来源于中南民族大学生物技术国家民委重点实验室㊂１．２㊀生物信息学分析１．２．１㊀ＯｓＶＤＡＣ８蛋白的理化性质㊂使用线上工具ＥｘＰＡＳｙ－Ｐｒｏｔｐａｒａｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）进行理化性质分析，Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ线上软件（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／）进行亲水性㊁疏水性分析，ＣＤＤ软件（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．ｃｇｉ）进行蛋白保守功能区分析，ＳＯＰＭＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｎｐｓａ⁃ｐｒａｂｉ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ⁃ｂｉｎ／ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ．ｈｔｍｌ）进行蛋白二级结构分析，Ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ）进行蛋白三级结构预测，Ｃｅｌｌ－ＰＬｏｃ２．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓｂｉｏ．ｓｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｂｉｏｉｎｆ／Ｃｅｌｌ－ＰＬｏｃ－２／）行蛋白亚细胞定位分析㊂１．２．２㊀顺式作用元件预测㊂在ＮＣＢＩ数据库下载ＯｓＶＤＡＣ８（Ｃｈｒ３ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ２０７５０）起始ＡＴＧ前５０００ｂｐ的ＤＮＡ序列，利用ＰｌａｎｔＣＡＲＥ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｐｓｂ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｗｅｂｔｏｏｌｓ／ｐｌａｎｔｃａｒｅ／ｈｔｍｌ／）在线分析预测顺式作用元件㊂１．２．３㊀表达模式分析预测㊂从水稻４－４４Ｋ基因表达芯片ＲＡＰＤＢ中提取ＮＩＰＯｓＶＤＡＣ８（Ｃｈｒ３ＬＯＣ＿Ｏｓ０３ｇ２０７５０）在不同生长发育阶段不同组织中的表达谱（ＲｉｃｅＸＰｒｏ，ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅｘｐｒｏ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／）［２１］，通过Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌｃｌｕｓｔｅｒ分析［２２］使用ＭｅＶ（ＭｕｌｔｉＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＶｉｅｗｅｒ）表示基因的表达模式㊂在ＭＳＵＲｉｃｅＧｅｎｏｍｅＡｎｎｏｔａｔｉｏｎＰｒｏｊｅｃｔ水稻基因表达数据库中（ｈｔｔｐ：／／ｒｉｃｅ．ｐｌａｎｔｂｉｏｌｏｇｙ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ｓｈｔｍｌ）下载基因的表达数据，用ｏｍｅｇａ作图软件绘图分析基因的表达模式㊂１．３㊀不同水稻品种表达模式分析１．３．１㊀ＲＮＡ提取与反转录㊂水稻种子按常规方法萌发及种植㊂分别取ＮＩＰ㊁ＹＴＡ和ＹＴＢ四叶期根㊁叶鞘和叶，５个不同发育时期的幼穗［２３］（穗生长期Ｉ：小穗长度小于０．４ｃｍ；穗生长期Ⅱ：小穗长度０．５ １．０ｃｍ；穗生长期Ⅲ：小穗长度１．５ ４．０ｃｍ；穗生长期ＩＶ：小穗长度５．０ ＜１０．０ｃｍ；穗生长期Ｖ：小穗长度大于１０．０ｃｍ），加液氮磨碎成粉末状，用ＴｒｉＺＯＬ法提取总ＲＮＡ并反转㊂利用ＣｏｒＹｅａｂｉｏ公司反转试剂盒反转得到ｃＤＮＡ（体系：Ａｌｌ－ｉｎ－ＯｎｅＦｉｒｓｔ－ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＭａｓｔｅｒ⁃Ｍｉｘ４μＬ，ｄｓＤＮａｓｅ１μＬ，ＴｏｔａｌＲＮＡ３μｇ，加Ｎｕｃｌｅａｓｅ－ＦｒｅｅＷａｔｅｒｕｐｔｏ２０μＬ），将反应体系放置于ＰＣＲ仪，５０ħ，１５ｍｉｎ；８５ħ，５ｓ；处理完后立即置于冰上㊂将ｃＤＮＡ原液稀释５倍，混匀，吸取１μＬ作为模板，用ａｃｔｉｎ引物检测ｃＤＮＡ质量（１５μＬ体系：ｄｄＨ２Ｏ５．７μＬ，ＦａｓｔＭｉｘ１．５μＬ，引物各０．４μＬ，ｃＤＮＡ１．３μＬ），ＰＣＲ反应程序：９６ħ预变性４ｍｉｎ，９６ħ变性３０ｓ，５９ħ退火３０ｓ，７２ħ延伸３０ｓ，３４个循环，７２ħ延伸６ｍｉｎ㊂反应结束后，取６μＬ产物进行电泳检测㊂引物序列见表１㊂表１㊀试验涉及的引物及序列Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ序号Ｎｏ．引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５ᶄ ３ᶄ）１Ｏｓａｃｔｉｎ－ＦＣＴＣＡＡＣＣＣＣＡＡＧＧＣＴＡＡＣＡＧ２Ｏｓａｃｔｉｎ－ＲＡＣＣＴＣＡＧＧＧＣＡＴＣＧＧＡＡＣ３ＲＴａｃｔｉｎ－ＦＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＡＧＧ４ＲＴａｃｔｉｎ－ＲＴＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＣＣＡＧＡ５ＲＴＶＤＡＣ８－ＦＧＣＣＡＣＡＧＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＧＧＴＴＣＣ６ＲＴＶＤＡＣ８－ＲＣＡＣＡＣＧＡＧＣＡＴＴＣＡＧＴＣＴＴＣ７ＨＢＴ－ＶＤＡＣ８－ＦＣＴＣＣＣＣＴＴＧＣＴＣＣＧＴＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧＧＴＴＣＧＧＣＣＧＣＣＴ８ＨＢＴ－ＶＤＡＣ８－ＲＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＴＣＴＣＣＴＡＣＧＧＴＣＡＴＴＣＣ１．３．２㊀荧光定量ＰＣＲ㊂用水稻ａｃｔｉｎ为内参基因，每个样品３个重复，１５μＬ反应体系：水４．７μＬ，２ˑｑＰＣＲＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ７．５μＬ，引物各０．４μＬ，ｃＤＮＡ２．０μＬ㊂反应程序：９５ħ３０ｓ，９５ħ１０ｓ，６０ħ３０ｓ，４０个循环；９５ħ１５ｓ，６０ħ６０ｓ，９５ħ１５ｓ；０ħ保存㊂根据仪器生成的数据计算该基因在３种水稻材料不同组织中的表达量㊂１．４㊀ＯｓＶＤＡＣ８的亚细胞定位１．４．１㊀ＨＢＴ－ＧＦＰ－ＯｓＶＤＡＣ８载体构建㊂以ＮＩＰｃＤＮＡ为模板，用设计好的ＨＢＴ－ＶＤＡＣ８－Ｆ和ＨＢＴ－ＶＤＡＣ８－Ｒ进行扩增，ＰＣＲ体系同ｃＤＮＡ检测，反应程序：９７ħ预变性５ｍｉｎ，９７ħ变性３０ｓ，６８ħ退火３０ｓ，７２ħ延伸１ｍｉｎ，３５个循环，７２ħ延伸８ｍｉｎ㊂用Ａｘｙｇｅｎ切胶回收试剂盒回收后得到目２８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２４年的片段，用ＢａｍＨＩ酶切ＨＢＴ－ＧＦＰ载体和目的片段，将酶切产物进行回收，用ＣｏｒＹｅａｂｉｏ公司同源重组试剂盒重组后再转化至ＤＨ５α感受态细胞中，涂布含有氨苄青霉素（１００μｇ／ｍＬ）的ＬＢ固体培养基，并挑取饱满的单克隆，扩大培养后提取质粒ＤＮＡ进行ＰＣＲ及酶切鉴定，将阳性克隆测序㊂１．４．２㊀水稻原生质体的转化和亚细胞定位分析㊂通过聚乙二醇介导法将质粒导入水稻原生质体㊂使用暗培养１０ １３ｄＮＩＰ的黄化苗浸泡于０．６ｍｏｌ／ＬＭａｎｎｉｔｏｌ溶液中，在培养皿中用新刀片将黄化苗快速切割成２ｍｍ左右的小片段，静置８ｍｉｎ后过滤，加入酶解液（１０ｍＬ酶解液含７．５ｍＬ０．８ｍｏｌ／ＬＭａｎｎｉｔｏｌ，１．０ｍＬ０．１ｍｏｌ／ＬＭＥＳ，０．１５０ｇＣｅｌｌｕｌｏｓｅ和０．０７５ｇＭａｃｅｒｏｚｙｍｅ），置于２８ħ摇床５０ｒ／ｍｉｎ振荡酶解６ｈ，加入１０ｍＬＷ５（５０ｍＬＷ５溶液含５．００ｍＬ１．５４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，６．２５ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２，１．２５ｍＬ０．２ｍｏｌ／ＬＫＣｌ和１．００ｍＬ０．１ｍｏｌ／ＬＭＥＳ，加入ｄｄＨ２Ｏ定容至５０ｍＬ）后放置１０ｍｉｎ，用Ｗ５溶液将裁剪好的６层纱布润湿，通过纱布将酶解液过滤到新的洁净离心管中，１０００ｒ／ｍｉｎ加减速度均为１，室温离心５ｍｉｎ，弃上清㊂加入１ｍＬＷ５溶液轻摇重悬原生质体，冰上静置３０ｍｉｎ，取２０μＬ悬液镜检观察原生质体质量㊂１０００ｒ／ｍｉｎ加减速度均为１，离心５ｍｉｎ，弃上清，加入预冷的４００μＬＭＭＧ溶液（１０．０ｍＬＭＭＧ溶液含７．５ｍＬ０．８ｍｏｌ／ＬＭａｎｎｉｔｏｌ，０．３ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２和０．４ｍＬ０．１ｍｏｌ／ＬＭＥＳ，加ｄｄＨ２Ｏ至１０ｍＬ），重悬原生质体后置于冰上㊂将质粒加入２ｍＬＥＰ管底，吸取２００μＬ原生质体悬液加入离心管中，将质粒和原生质体混匀，加入等体积的ＰＥＧ－ＣａＣｌ２溶液（１ｍＬＰＥＧ－ＣａＣｌ２含０．５５ｍＬ０．８ｍｏｌ／ＬＭａｎｎｉｔｏｌ，０．４ｇＰＥＧ４０００，置于５５ħ孵育３ｈ，加入１００μＬＣａＣｌ２和５０μＬｄｄＨ２Ｏ），混匀后避光静置２０ｍｉｎ进行转化㊂加入４倍体积Ｗ５溶液，轻摇混匀以停止转化，１０００ｒ／ｍｉｎ加减速度均为１，离心５ｍｉｎ㊂弃上清，加入３倍体积的Ｗ５溶液清洗原生质体去除残留的ＰＥＧ－ＣａＣｌ２，１０００ｒ／ｍｉｎ加减速度均为１，室温离心５ｍｉｎ㊂重复该步骤１次㊂弃上清，加入５００μＬＷ１溶液重悬原生质体，２５ħ避光过夜培养，制片及染色处理后置于ＣＬＳＭ下观察荧光情况㊂２㊀结果与分析２．１㊀ＯｓＶＤＡＣ８蛋白生物信息学分析㊀ＥｘＰＡＳｙ－Ｐｒｏｔｐａｒａｍ线上软件的分析结果表明，ＯｓＶＤＡＣ８是１个由３３７ａａ构成，分子式为Ｃ１６１７Ｈ２５７７Ｎ４４３Ｏ４９７Ｓ１６，相对分子量为３７３３７．４７，理论等电点为６．４６的蛋白质（图１）㊂该蛋白的不稳定指数为３６．４０，表现出稳定性，其脂肪系数为７２．６４，总平均亲水系数为－０．３１６㊂用Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ线上网站对ＯｓＶＤＡＣ８蛋白的亲水性进行预测，结果显示，信号图中峰值散布于负值的信号明显大于正值部分（图１ａ），ＯｓＶＤＡＣ８蛋白是一个稳定的具有亲水性的蛋白㊂ＳＯＰＭＡ结果表明，ＯｓＶＤＡＣ８蛋白的空间构象可能主要由无规则卷曲结构构成（图１ｂ）㊂Ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ结果显示，ＯｓＶＤＡＣ８蛋白含有１个Ｐｏｒｉｎ３＿Ｔｏｍ４０结构域，１１次跨膜（图１ｃ），且折叠形成特异的桶状结构（图１ｄ和图１ｅ）㊂ＣＤＤ结果表明，该蛋白属于Ｐｏｒｉｎ３超家族（图１ｆ）㊂Ｃｅｌｌ－ＰＬｏｃ２．０结果显示其定位于线粒体㊂注：ａ．ＯｓＶＤＡＣ８的亲／疏水性分析；ｂ．ＯｓＶＤＡＣ８蛋白的二级结构；ｃ．ＯｓＶＤＡＣ８跨膜结构预测；ｄ．ＯｓＶＤＡＣ８的三维结构顶视图［结构用以下颜色显示：β－链（黄色），α－螺旋（红色），转角（蓝色）和环（白色）］；ｅ．ＯｓＶＤＡＣ８的三维结构侧视图；ｆ．ＯｓＶＤＡＣ８蛋白的保守结构域分析㊂Ｎｏｔｅ：ａ．Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ／ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆＯｓＶＤＡＣ８；ｂ．ＳｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＯｓＶＤＡＣ８ｐｒｏｔｅｉｎ；ｃ．ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｆｏｒＯｓＶ⁃ＤＡＣ８；ｄ．Ａｔｏｐｖｉｅｗｏｆｔｈｅ３ＤｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＯｓＶＤＡＣ８［Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｓｄｉｓｐｌａｙｅｄｗｉｔｈｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｃｏｌｏｒｓ：β⁃ｓｔｒａｎｄｓ（ｙｅｌｌｏｗ），α⁃ｈｅｌｉｘ（ｒｅｄ），ｔｕｒｎｓ（ｂｌｕｅ），ａｎｄｌｏｏｐｓ（ｗｈｉｔｅ）］；ｅ．Ａｓｉｄｅｖｉｅｗｏｆｔｈｅ３ＤｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＯｓＶＤＡＣ８；ｆ．ＣｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＯｓＶＤＡＣ８ｐｒｏｔｅｉｎ．图１㊀ＯｓＶＤＡＣ８生物信息学分析Ｆｉｇ．１㊀ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆＯｓＶＤＡＣ８３８５２卷４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀蒋晓涵等㊀不同水稻品种ＯｓＶＤＡＣ８的表达模式比较与亚细胞定位分析２．２㊀顺式作用元件预测㊀用ＰｌａｎｔＣＡＲＥ（ｈｔｔｐ：ʊｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ⁃ｉｃｓ．ｐｓｂ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｗｅｂｔｏｏｌｓ／ｐｌａｎｔｃａｒｅ／ｈｔｍｌ／）对ＯｓＶＤＡＣ８起始ＡＴＧ前５０００ｂｐ的序列进行生物信息学分析，发现了１３种可信度较高的顺式作用元件（表２）㊂该启动子含有多种与植物发育相关顺式作用元件，推测这个基因在水稻的生长发育过程中可能具有重要作用㊂基因含有与发育相关的顺式作用元件为ＡＢＲＥ㊁ＡＲＥ㊁ＣＡＴ－ｂｏｘ㊁ＣＧＴＣＡ－ｍｏｔｉｆ㊁Ｐ－ｂｏｘ㊁ＬＴＲ㊁ＭＢＳ㊁ＴＣ－ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｓ㊁ＧＡＴＡ－ｍｏｔｉｆ㊁ＴＣＡ－ｅｌｅｍｅｎｔ㊁ＴＧＡ－ｅｌｅｍｅｎｔ等㊂表２㊀ＯｓＶＤＡＣ８顺式作用元件预测Ｔａｂｌｅ２㊀Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆｃｉｓ⁃ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔｆｏｒＯｓＶＤＡＣ８序号Ｎｏ．顺式作用元件Ｃｉｓａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ生物学功能Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ１ＡＢＲＥ参与脱落酸反应２ＡＥ－ｂｏｘ，ＢｏｘＩＩ，ＧＡ－ｍｏｔｉｆ，Ｉ－ｂｏｘ，Ｓｐ１，Ｇ－Ｂｏｘ参与光反应的顺式作用元件３ＡＲＥ厌氧诱导所必需的顺式调节元件４ＣＡＴ－ｂｏｘ与分生组织表达相关的顺式调节元件５ＣＧＴＣＡ－ｍｏｔｉｆ，ＴＧＡＣＧ－ｍｏｔｉｆ参与ＭｅＪＡ反应的顺式调节元件６ＧＡＲＥ－ｍｏｔｉｆ，Ｐ－ｂｏｘ赤霉素反应元件７ＬＴＲ参与低温反应的顺式作用元件８ＭＢＳ与干旱诱导有关的ＭＹＢ结合位点９Ｏ２－ｓｉｔｅ参与玉米醇溶蛋白代谢调节的顺式调节元件１０ＴＣ－ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｓ参与防御和压力的顺式作用元件１１ＴＣＡ－ｅｌｅｍｅｎｔ与水杨酸反应有关的顺式作用元件１２ＴＧＡ－ｅｌｅｍｅｎｔ生长素反应元件１３Ｃｉｒｃａｄｉａｎ涉及昼夜节律控制的作用调节元件２．３㊀表达谱的生物信息学分析㊀利用ＲｉｃｅＸｐｒｏ（ｈｔｔｐ：ʊｒｉｃｅｘｐｒｏ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＧＧＥＰ／ｓａｍｐｌｅ⁃ｌｉｓｔ．ｐｈｐ）分析了ＯｓＶ⁃ＤＡＣ８在水稻品种ＮＩＰ中４８个发育阶段的表达谱㊂该基因平均信号值对数的层次聚类结果（图２）表明，其在不同生长发育阶段表达差异显著，ＯｓＶＤＡＣ８在所有组织和时期都表达，在胚乳中表达水平最低，ＯｓＶＤＡＣ８在花序出现前后及子房中表达量较高㊂㊀注：颜色条表示标准化的ｌｏｇ２表达值：蓝色为最低表达，白色为中度表达，红色为高度表达㊂㊀Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｃｏｌｏｒｂａｒｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｌｏｇ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖａｌｕｅ：ｂｌｕｅｉｓｔｈｅｌｏｗｅｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｗｈｉｔｅｉｓｍｏｄｅｒａｔｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄｒｅｄｉｓｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓ⁃ｓｉｏｎ．图２㊀ＮＩＰ不同组织中ＯｓＶＤＡＣ８表达模式Ｆｉｇ．２㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆＯｓＶＤＡＣ８ｉｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆＮＩＰ２．４㊀ＯｓＶＤＡＣ８在３个水稻品种中表达模式比较㊀分别取ＮＩＰ㊁不育系ＹＴＡ和保持系ＹＴＢ四叶期根㊁叶鞘和叶片，５个不同发育时期幼穗，用ＴｒｉＺＯＬ法提取总ＲＮＡ，反转后的ｃＤＮＡ用ａｃｔｉｎ引物检测，结果显示，ｃＤＮＡ不含基因组ＤＮＡ，且能扩增出特异条带（图３）㊂图４显示，ＯｓＶＤＡＣ８在这３个水稻品种的表达模式差异显著，不育系ＹＴＡ中ＯｓＶＤＡＣ８在四叶期叶㊁叶鞘和幼穗发育的前期表达水平都较高，根及幼穗发育花粉内容物充实期表达水平最低；保持系ＹＴＢ中在四叶期叶鞘表达水平非常高，根㊁叶及幼穗发育过程中都是低水平表达；ＮＩＰ的四叶期叶鞘和枝梗原基分化期中都有非常高的表达，其他时期的表达差异不大，幼穗发育的整个时期表达量都比较稳定㊂２．５㊀ＯｓＶＤＡＣ８的亚细胞定位分析㊀用ＢａｍＨＩ酶切ＨＢＴ－ＧＦＰ质粒ＤＮＡ并回收，通过同源重组技术将ＯｓＶＤＡＣ８全长ＣＤＳ整合到ＨＢＴ－ＧＦＰ线性化载体上转化大肠杆菌，涂布含有氨苄青霉素（１００μｇ／ｍＬ）的ＬＢ固体培养基，挑取单克隆扩大培养后提取质粒ＤＮＡ，进行ＰＣＲ及酶切鉴定，将阳性克隆测序（图５），结果显示，ＨＢＴ－ＯｓＶＤＡＣ８－ＧＦＰ载体构建成功㊂ＨＢＴ－ＯｓＶＤＡＣ８－ＧＦＰ转化水稻黄化幼苗原生质体，培养１０ｈ后用线粒体染料染色１５ｍｉｎ，制片后在激光共聚焦显微４８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２４年镜下观察荧光分布，结果显示，ＯｓＶＤＡＣ８定位于线粒体（图６）㊂注：Ｍ．ＤＬ２０００；１ ８．ＹＴＡ；９ １６．ＹＴＢ；１７ ２４．ＮＩＰ；１㊁９㊁１７．根；２㊁１０㊁１８．茎；３㊁１１㊁１９．叶；４㊁１２㊁２０．＜０．４ｃｍ幼穗；５㊁１３㊁２１．０．５ １．０ｃｍ幼穗；６㊁１４㊁２２．１．５ ４．０ｃｍ幼穗；７㊁１５㊁２３．５ １０ｃｍ幼穗；８㊁１６㊁２４．＞１０ｃｍ幼穗㊂Ｎｏｔｅ：Ｍ．ＤＬ２０００；１－８．ＹＴＡ；９－１６．ＹＴＢ；１７－２４．ＮＩＰ；１，９，１７．Ｒｏｏｔ；２，１０，１８．Ｓｔｅｍ；３，１１，１９．Ｌｅａｆ；４，１２，２０．＜０．４ｃｍｐａｎｉｃｌｅ；５，１３，２１．０．５－１．０ｃｍｐａｎｉ⁃ｃｌｅ；６，１４，２２．１．５－４．０ｃｍｐａｎｉｃｌｅ；７，１５，２３．５－１０ｃｍｐａｎｉｃｌｅ；８，１６，２４．＞１０ｃｍｐａｎｉｃｌｅ．图３㊀ｃＤＮＡ的质量检测Ｆｉｇ．３㊀ＱｕａｌｉｔｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡ图４㊀３个水稻品种ＯｓＶＤＡＣ８表达模式Ｆｉｇ．４㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｓｏｆＯｓＶＤＡＣ８ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆｔｈｒｅｅｒｉｃｅｖａｒｉｅｔｉｅｓ３㊀讨论与结论拟南芥中有４个ＶＤＡＣ基因，ＡｔＶＤＡＣ１㊁ＡｔＶＤＡＣ２和ＡｔＶ⁃ＤＡＣ４在植物生长㊁叶片和花粉发育及维持线粒体膜电位的稳定状态方面发挥了重要作用㊂多项证据表明，线粒体深度参与雄性配子体发育，许多线粒体基因突变影响雄性配子体发育，甚至导致细胞质雄性不育㊂ＡｔＶＤＡＣ１突变影响雌配子发育㊂ＡｔＶＤＡＣ１普遍存在于拟南芥的根㊁茎㊁叶㊁花序㊁角果㊁幼苗和种子中，且表达水平都很高［２４］㊂笔者前期研究了Ｏｓ⁃ＶＤＡＣ４和ＯｓＶＤＡＣ６的表达谱，发现ＯｓＶＤＡＣ６在幼穗早期发育时期，Ｎｉｐ与ＹＴＢ中ＯｓＶＤＡＣ６维持较低的表达，而ＹＴＡ中ＯｓＶＤＡＣ６表达水平出现高峰，ＯｓＶＤＡＣ４在Ｎｉｐ㊁ＹＴＢ和ＹＴＡ中均在花粉粒充实成熟期时ＯｓＶＤＡＣ４表达量达到最高，推测其可能参与调控水稻花粉粒的成熟过程㊂ＯｓＶＤＡＣｓ在调控水稻育性中的作用尚不清楚，有待深入研究其作用机理㊂㊀㊀为了研究ＯｓＶＤＡＣ８的功能，首先对其进行了生物信息注：Ａ．ＨＢＴ－ＯｓＶＤＡＣ８－ＧＦＰ质粒ＰＣＲ检测；Ｂ．ＨＢＴ－ＯｓＶＤＡＣ８－ＧＦＰ酶切鉴定；Ｍ１．ＤＬ２０００；Ｍ．ＤＬ１５０００；１ ２．不同质粒㊂Ｎｏｔｅ：Ａ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨＢＴ⁃ＯｓＶＤＡＣ８⁃ＧＦＰｂｙＰＣＲ；Ｂ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨＢＴ⁃ＯｓＶＤＡＣ８⁃ＧＦＰｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＢａｍＨⅠ；Ｍ１．ＤＬ２０００；Ｍ．ＤＬ１５０００．１－２．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｌａｓｍｉｄｓ．图５㊀ＨＢＴ－ＯｓＶＤＡＣ８－ＧＦＰ重组质粒鉴定Ｆｉｇ．５㊀ＴｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓＨＢＴ⁃ＯｓＶ⁃ＤＡＣ８⁃ＧＦＰ学分析，ＯｓＶＤＡＣ８是一个稳定的亲水蛋白，二级结构主要由无规则卷曲构成，可能定位在线粒体上；预测的启动子序列含有与植物生长发育㊁繁殖及胁迫应答等密切相关的元件，推测其在水稻生长发育的不同时期及组织的表达模式可能有差异㊂ＲｉｃｅＸｐｒｏ结果表明，ＯｓＶＤＡＣ８在ＮＩＰ不同生长发育阶段表达差异显著，在生殖生长期的叶鞘㊁花序出现前后幼穗中表达水平最高，在胚乳和根中的表达量较低㊂分析了ＯｓＶＤＡＣ８在３个不同品种ＮＩＰ㊁ＹＴＡ和ＹＴＢ幼穗发育的不同时期和组织中的表达，结果表明，在３个水稻品种中表达模式不同㊂在ＮＩＰ中ＯｓＶＤＡＣ８在根中的表达量最低，在叶鞘到枝梗分化期的表达量较高，在雌雄蕊开始分５８５２卷４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀蒋晓涵等㊀不同水稻品种ＯｓＶＤＡＣ８的表达模式比较与亚细胞定位分析化到花粉充实完熟期的表达量差别不大；ＯｓＶＤＡＣ８在ＹＴＢ与ＮＩＰ的幼穗发育时期的表达模式大同小异，而在ＹＴＡ中随着雌雄蕊的形成和颖花的发育ＯｓＶＤＡＣ８的表达量逐渐降低，ＹＴＢ和ＮＩＰ都是雄性可育品种，而ＹＴＡ是细胞质雄性不育品种，这些结果可能说明ＯｓＶＤＡＣ８的表达可能与水稻的育性有关联㊂亚细胞定位结果显示，ＯｓＶＤＡＣ８定位于线粒体，与预测结果一致㊂该研究初步分析了ＯｓＶＤＡＣ８的特性，为深入研究ＯｓＶＤＡＣ８基因的功能提供基础㊂注：Ｂｒｉｇｈｔ．明场；ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ．线粒体染色；ＧＦＰ．绿色荧光；Ｍｅｒｇｅｄ．荧光整合；Ｂａｒｓ．５μｍ㊂Ｎｏｔｅ：Ｂｒｉｇｈｔ．Ｏｐｅｎｆｉｅｌｄｃｈａｎｎｅｌ；ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｓｔａｉｎｉｎｇ；ＧＦＰ．Ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；Ｍｅｒｇｅｄ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ；Ｂａｒ．５μｍ．图６㊀ＯｓＶＤＡＣ８的亚细胞定位Ｆｉｇ．６㊀ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＯｓＶＤＡＣ８参考文献［１］ＬＩＺＹ，ＸＵＺＳ，ＨＥＧＹ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｖｏｌｔａｇｅ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｉｏｎｃｈａｎｎｅｌ１（ＡｔＶＤＡＣ１）ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｓｐｌａｎｔｃｏｌｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｄｕｒｉｎｇｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｓｅｅｄｌｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓａｎｄｉｎｔｅｒａｃｔｓｗｉｔｈｃａｌｃｉｕｍｓｅｎｓｏｒＣＢＬ１［Ｊ］．ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ，２０１３，１４（１）：７０１－７１３．［２］ＺＩＮＧＨＩＲＩＮＯＦ，ＰＡＰＰＡＬＡＲＤＯＸＧ，ＭＥＳＳＩＮＡＡ，ｅｔａｌ．ＶＤＡＣｇｅｎｅｓｅｘ⁃ｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｍａｍｍａｌｓ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２０２１，１２：１－１４．［３］ＮＡＪＢＡＵＥＲＥＥ，ＢＥＣＫＥＲＳ，ＧＩＬＬＥＲＫ，ｅｔａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｇａｔｉｎｇａｎｄｉｎｔｅｒ⁃ａｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｖｏｌｔａｇｅ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｉｏｎｃｈａｎｎｅｌ［Ｊ］．ＥｕｒＢｉｏｐｈｙｓＪ，２０２１，５０（２）：１５９－１７２．［４］ＡＳＨＲＡＦＭ，ＭＡＯＱＬ，ＨＯＮＧＪ，ｅｔａｌ．ＨＳＰ７０⁃１６ａｎｄＶＤＡＣ３ｊｏｉｎｔｌｙｉｎ⁃ｈｉｂｉｔｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｕｎｄｅｒｃｏｌｄｓｔｒｅｓｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＥｎｖｉ⁃ｒｏｎ，２０２１，４４（１１）：３６１６－３６２７．［５］ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡＳＲ，ＭＡＨＡＬＡＫＳＨＭＩＲ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆａ１９－ｓｔｒａｎｄｅｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌβ⁃ｂａｒｒｅｌｓｃａｆｆｏｌｄｂｅａｒｓｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２０２０，２９５（４３）：１４６５３－１４６６５．［６］ＴＡＫＡＨＡＳＨＩＹ，ＴＡＴＥＤＡＣ．Ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｖｏｌｔａｇｅ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｓｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２０１３，１８（８）：９１７－９２４．［７］ＲＡＶＩＢ，ＫＡＮＷＡＲＰ，ＳＡＮＹＡＬＳＫ，ｅｔａｌ．ＶＤＡＣｓ：Ａｎｏｕｔｌｏｏｋｏｎｂｉｏ⁃ｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎａｎｉｍａｌａｎｄｐｌａｎｔｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２０２１，１２：１－１５．［８］ＫＡＲＡＣＨＩＴＯＳＡ，ＧＲＡＢＩＮᶄＳＫＩＷ，ＢＡＲＡＮＥＫＭ，ｅｔａｌ．Ｒｅｄｏｘ⁃ｓｅｎｓｉｔｉｖｅＶＤＡＣ：Ａｐｏｓｓｉｂｌｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｓａｎｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｔｒｅｓｓｓｅｎｓｏｒｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔＰｈｙｓｉｏｌ，２０２１，１２：１－１０．［９］ＨＥＭＯＮＯＭ，ＵＢＲＩＧÉ，ＡＺＥＲＥＤＯＫ，ｅｔａｌ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｖｏｌｔａｇｅ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｓ（ＶＤＡＣｓ）：Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｍｉｔｏｃｈｏｎ⁃ｄｒｉａ［Ｊ］．Ｃｅｌｌｓ，２０２０，９（４）：１－１４．［１０］ＫＷＯＮＴ．ＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｐｏｒｉｎｉｓｏｆｏｒｍＡｔＶＤＡＣ１ｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｔｏＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＭｏｌＣｅｌｌｓ，２０１６，３９（９）：７０５－７１３．［１１］ＬＩＵＺ，ＬＵＯＱＨ，ＷＥＮＧＱ，ｅｔａｌ．ＶＤＡＣ２ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｔｈｅｓｔｒｅｓｓｒｅ⁃ｓｐｏｎｓｅｐａｔｈｗａｙｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．ＧｅｎｅｔＭｏｌＲｅｓ，２０１５，１４（４）：１５５１１－１５５１９．［１２］ＹＵＭ，ＹＵＹ，ＳＯＮＧＴＱ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｖｏｌｔａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｎｉｏｎｃｈａｎｎｅｌ（ＶＤＡＣ）ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｗｈｅａｔ（ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ．）ａｎｄｉｔｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｓａｌｉｎｉｔｙｓｔｒｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，２０２２，８０９：１－１１．［１３］ＫＡＮＷＡＲＰ，ＳＡＭＴＡＮＩＨ，ＳＡＮＹＡＬＳＫ，ｅｔａｌ．ＶＤＡＣａｎｄｉｔｓｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐａｒｔｎｅｒｓｉｎｐｌａｎｔａｎｄａｎｉｍａｌｓｙｓｔｅｍｓ：Ａｎｏｖｅｒｖｉｅｗ［Ｊ］．ＣｒｉｔＲｅｖＢｉｏｔｅｃｈｎ⁃ｏｌ，２０２０，４０（５）：７１５－７３２．［１４］ＫＡＮＷＡＲＰ，ＳＡＮＹＡＬＳＫ，ＭＡＨＩＷＡＬＳ，ｅｔａｌ．ＣＩＰＫ９ｔａｒｇｅｔｓＶＤＡＣ３ａｎｄｍｏｄｕｌａｔｅｓｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＪ，２０２２，１０９（１）：２４１－２６０．［１５］夏春皎，刘学群，王春台．水稻线粒体渗透性转换孔相关基因家族的系统发育研究［Ｃ］／／湖北省植物生理学会第十五次学术研讨会论文集．黄冈：湖北省植物生理学会，黄冈师范学院，２００７：６０．［１６］罗凤燕．水稻ｖｄａｃ㊁ａｎｔ及ＨＬ－ＳＰ１基因的表达研究［Ｄ］．武汉：中南民族大学，２０１０．［１７］王亚楠．水稻ＯｓＶＤＡＣ３及其互作蛋白亚细胞定位和功能初步分析［Ｄ］．武汉：中南民族大学，２０１９．［１８］ＸＵＸ，ＴＡＮＹＰ，ＣＨＥＮＧＧ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓｕｒｖｅｙａｎｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａ⁃ｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＶＤＡＣｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｒｉｃｅ［Ｊ］．ＧｅｎｅｔＭｏｌＲｅｓ，２０１５，１４（４）：１５６８３－１５６９６．［１９］龚秋涵．水稻ＯｓＶＤＡＣ６功能及调控机制的初步研究［Ｄ］．武汉：中南民族大学，２０２０．［２０］马明月．水稻ＯｓＶＤＡＣ４与其互作蛋白功能的初步研究［Ｄ］．武汉：中南民族大学，２０２２．［２１］ＳＡＴＯＹ，ＴＡＫＥＨＩＳＡＨ，ＫＡＭＡＴＳＵＫＩＫ，ｅｔａｌ．ＲｉｃｅＸＰｒｏｖｅｒｓｉｏｎ３．０：Ｅｘ⁃ｐａｎｄｉｎｇｔｈｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｒｅｓｏｕｒｃｅｆｏｒｒｉｃｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，２０１３，４１：Ｄ１２０６－Ｄ１２１３．［２２］ＥＩＳＥＮＭＢ，ＳＰＥＬＬＭＡＮＰＴ，ＢＲＯＷＮＰＯ，ｅｔａｌ．Ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｄｉｓｐｌａｙｏｆｇｅｎｏｍｅ⁃ｗｉｄｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９８，９５（２５）：４８６３－１４８６８．［２３］广东省德庆县永丰中学农科组．利用倒五叶观察水稻幼穗分化［Ｊ］．农业科技通讯，１９７７（７）：６．［２４］潘晓迪．拟南芥电压依赖性阴离子通道基因ＡｔＶＤＡＣｓ功能分析［Ｄ］．北京：中国农业大学，２０１４．６８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２４年。
细胞生物学-4高尔基体
三、蛋白质的加工改造
RER上合成的蛋白质有些是无生物活性的前体物， 称为蛋白原，蛋白原必须经过加工改造才能具有 生物活性。
加工方式分为三种类型： ①直接酶解切除氨基酸序列—具有活性的蛋白质， 如胰岛素和血清蛋白等； ②将多个氨基酸序列相同的区段，加工成多个相 同的活性多肽链，如神经肽等； ③根据不同的信号序列，加工成不同的活性多肽 链，如一些信息分子等。
二、蛋白质和脂类的糖基化
到达GC的糖蛋白具有相同的寡糖 GC中有多种糖基转移酶，不同部位含有 不同的糖基转移酶种类 ER上合成的糖蛋白寡糖链末端区的寡糖 基被切去，同时添加新的糖基
O-连接寡糖：与丝氨酸、苏氨酸和羟
赖氨酸的羟基基团相连 糖基化作用：分选信号；蛋白质正确 折叠、增加蛋白质的稳定性、抵御酶 降解和参与细胞识别等方面 高尔基扁囊中加上的糖基比较复杂， 最末端一个常是唾液酸，使糖蛋白的 末端呈负电性
两面的顶面部位：小管和扁囊连接成网，即高尔基 网，顺面为cis网，反面为trans网
高尔基复合体的形态结构
形成面通常与粗面内质网的特定区域紧密联系
高尔基复合体在中心体附近的分布与微管有关：
如果用秋水仙素处理细胞，高尔基复合体就会出现 弥散性分布，且会失去其原有的典型性结构； 当去除秋水仙素后，很快又能恢复其原有的典型性结构
四、细胞内的膜泡运输
在胞内运输、分泌小泡的外排和内吞小泡的运输过程
中均具有重要作用。
GC中有G蛋白(GTP binding regulatory protein，G protein)
对高尔基复合体膜泡运输具有调控作用。
1.从内质网向高尔基复合体的膜泡运输
以有被小泡的方式 内质网上进入膜泡的蛋白质 必须是已正确折叠和正确组装的 折叠错误的蛋白质： 需要进行纠正修饰， 由ER的结合蛋白(binding protiens，BiP) （分子伴侣）（与hsp70蛋白相关）来完成 BiP蛋白：识别折叠错误蛋白质 将蛋白质重新折叠成正确的构象 在BiP的帮助下仍不能折叠成正确构象的蛋白， 在内质网腔中被降解掉
第十二章高尔基体
小肠粘液细胞蛋白质运输
2、对蛋白质和脂类的修饰加工
N-连接糖基化 (粗面内质网)：寡糖与
天冬酰胺残基的氨基 （-NH2）共价结合
O-连接糖基化 (高尔基复合体)：寡糖
与蛋白质酪氨酸、丝 氨酸或苏氨酸残基的 羟基（-OH）共价结 合
在内质网形成的糖蛋白具有相似的糖链，由Cis 面进入高尔基体后，在各膜囊之间转运发生一系 列有序的加工和修饰，原来糖链中的大部分甘露 糖被切除，但又被多种糖基转移酶依次加上不同 类型的糖分子，形成结构各异的寡糖链。糖蛋白 的空间结构决定了它可以和那一种糖基转移酶结 合，发生特定的糖基化修饰。
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1、参与细胞分泌活动
3分钟 RER 17分 高尔基体 117分 分泌泡
用3H—亮氨酸标记天竺鼠胰腺外分泌细胞，应用放射自显 影电镜技术跟踪放射性标记氨基酸在胰腺细胞内的分布
SER上合成蛋白质→进入 ER腔→以出芽形成囊泡→ 进入CGN→在medial Golgi中加工→在TGN形成 囊泡→囊泡与质膜融合、 排出。
1. 脂类 介于内质网和质膜之间 粗面内质网 高尔基复合体 质膜 神经鞘磷脂、胆固醇 磷脂酰胆碱 2. 蛋白质 含有丰富的酶类，不同区室酶的分布不同 糖基转移酶是高尔基复合体的特征性酶 3. 多糖 形成面 成熟面 梯度上升
第三节 高尔基复合体的功能
主要功能将内质网合成的 蛋白质进行加工、分类、 与包装，然后分门别类地 送到细胞特定的部位或分 泌到细胞外。
思考题
名词解释： 顺面高尔基网 反面高尔基网 O-连接的糖
基化 膜流 简述高尔基复合体的结构与功能？
第十二章 高尔基复合体 (Golgi complex)
水稻Ossp1基因的亚细胞定位及其干旱条件下的表达
水稻Ossp1基因的亚细胞定位及其干旱条件下的表达作者：腾海艳来源：《江苏农业学报》2020年第03期摘要：sp1基因是葉绿体蛋白质输入调控的关键基因，本研究通过生物信息学分析、Real time PCR分析、瞬时表达分析等方法，对sp1在水稻中的同源基因Ossp1进行了结构和功能预测、组织表达和干旱响应性分析以及亚细胞定位分析。
生物信息学分析结果显示，水稻Ossp1基因位于7号染色体，基因登录号为Os07g0647800，序列全长1 032 bp，SP1蛋白由343个氨基酸残基组成，信号肽序列位于氮端，蛋白质分子中有2个跨膜区域。
Real time PCR分析结果显示，Ossp1在水稻叶片中表达量最高，其次为叶鞘，根中最低，此外，Ossp1在叶片中的表达具有明显的干旱响应性，受到干旱胁迫诱导后，表达量显著提高。
采用瞬时表达进行亚细胞定位结果显示，SP1蛋白定位于水稻叶绿体。
上述结果显示了Ossp1基因与水稻叶绿体及干旱胁迫响应的关系，为Ossp1基因功能的深入研究提供了基础。
关键词：水稻;Ossp1基因;亚细胞定位;干旱胁迫;基因表达中图分类号：Q786文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）03-0529-06Subcellular localization and expression under drought conditions of rice Ossp1 geneTENG Hai-yan（School of Chemistry and Bioengineering， Yichun University， Yichun 336000， China）Abstract：The sp1 is a key gene for the regulation of chloroplast protein import， and Ossp1 is the homologous gene of sp1 in rice. In this study， the structure and function prediction， tissue expression， drought-responsiveness analysis and subcellular localization analysis of Ossp1 were carried out by bioinformatics analysis， realtime PCR analysis and transient expression analysis. The results of bioinformatics analysis showed that Ossp1 was located on chromosome 7（gene accession number： Os07g0647800）， and the sequence was 1 032 bp in length. The SP1 protein was composed of 343 amino acid residues， the signal peptide was located at the N-terminus， and there were two transmembrane regions. The results of real time PCR analysis showed that the expression level of Ossp1 was highest in rice leaves， followed by leaf sheaths， and lowest in roots. In addition， the expression of Ossp1 could be significantly induced by drought stress， showed obvious drought responsiveness. Subcellular localization analysis of SP1 protein was performed by transient expression assay， and the results indicated that the SP1 protein was localized in rice chloroplasts. The above results show the relationship between gene Ossp 1 and rice chloroplast and drought responsiveness， and provide the basis for further research on the function of gene Ossp 1.Key words：rice;Ossp1;subcellular localization; drought stress;gene expression植物叶绿体含有大约3 000种蛋白质，其中绝大部分由核基因编码，少数由叶绿体自身基因组编码。
植物蛋白质的亚细胞定位研究进展
质特异的抗体检测目标蛋白质在细胞中的位置的方
法。一般是将抗体进行标记后识别植物细胞切片中
的目标蛋白质, 然后借助光学显微镜或电子显微镜 观察其所在位置, 根据抗原抗体的结合部位确定目 标蛋白的位置。这种亚细胞定位方法是把免疫反应 的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来, 可以 在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质, 如多肽、酶、
关键词: 蛋白质; 亚细胞定位; 细胞分区; 蛋白质组学; 高通量 中图分类号: Q- 1 文献标识码: A 文章编号: 1000- 7091( 2006) 增刊- 0001- 06
Advancement of Protein Subcellular Localization in Plants
XING Hao_ran, LIU Li_juan, LIU Guo_zhen
GFP 能自我催化形成发色结构并在蓝光激发下 发出绿色荧光, 所以可以与目标蛋白融合, 作为荧光
标记 分 子, 特 异 性地 进 行 蛋白 质 的 亚细 胞 定 位。 GFP 能在蛋白质的 N 端或 C 端融合而 保持其天然 蛋白的特性, 而且灵敏度高、对活细胞无毒害作用, 所以广泛应用[ 4, 5] ; 此外, GFP 可以人工改造成具有 更高的荧光 强度和 灵敏性 的突 变体, 例如 增强 型 GFP( EGFP) 是将 Ser65 用 Thr 替代, Phe64 用 Leu 替 代, 其荧光强度提高了 35 倍[ 6] ; 另外, GFP 还改建成 了能发射其它颜色荧光的突变体, 例如, 红色荧光蛋 白( RFP ) 、黄 色荧 光 蛋 白 ( YFP ) 和 蓝色 荧 光 蛋 白 ( BFP) 以及它们的增强型 ERFP、EYFP、EBFP 等[ 7, 8] , 这些改造使荧光蛋白的应用更为广泛。
细胞生物学中的亚细胞结构
细胞生物学中的亚细胞结构细胞是构成生命物质的基本单位，而亚细胞结构则是细胞内部组成的重要部分。
亚细胞结构包括核、细胞质、线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体、泡体、原生质体等。
这些亚细胞结构在细胞内扮演着不同的角色，调节细胞代谢、细胞增殖、细胞分化、转运物质等各种重要功能。
一、核核是一个细胞内部最重要的结构，它是细胞内所有DNA的主要所在地。
细胞的核外层由核膜包裹，核膜的间隙称之为核孔。
原生质通过核孔与核内部相互交流，如RNA在细胞质中合成后，通过核孔进入核内完成细胞内的转录过程。
二、细胞质细胞质是细胞核外的一切区域，它包括基质和各种细胞器，是完成细胞代谢和合成必需物质的重要场所。
三、线粒体线粒体是细胞内的能量中心，是ATP合成的重要场所。
它的外层由两层脂质组成，两层膜之间的间隙称作线粒体中腔。
线粒体内部由基质和内质网组成，内质网形成了许多嵌入基质中的褶皱，这些褶皱称为线粒体内膜。
四、内质网内质网是一种细胞内重要的膜结构，其内部组成许多相互连接的膜通道和复合体，完成细胞的物质合成和转运等过程。
内质网结构由许多少管、扁平的囊状结构构成，可以分为粗面内质网和平滑内质网。
五、高尔基体高尔基体可以看作是内质网和溶酶体之间的“转运站”，它有很多腔室，可以将内质网合成的分子包裹起来，在高尔基体内转运并修饰，交运给溶酶体等其他结构。
六、溶酶体溶酶体是细胞内的泡体结构，其主要功能是消化被摄取或分泌物质中的废或有害物质，维持细胞的稳态。
七、泡体泡体是一种与细胞分化相关的结构，主要是细胞与环境之间的联系。
根据泡体的分布位置和形状不同，可以分为内、外泡体等多种类型。
八、原生质体原生质体是细胞内的生命质，由水、无机盐、有机酸、酶、抗体以及其他生物物质组成。
它在细胞内占据极大比例，在细胞的代谢过程中，供应细胞所需的氧、营养物质、酶以及其他必要物质，维持细胞的正常生理活动。
细胞生物学中的亚细胞结构，是细胞内部最基本的构建单位，它们相互配合协作，完成细胞功能的正常运行。
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水稻原生质体高尔基体亚细胞定位
水稻原生质体高尔基体是位于原生质体中的亚细胞结构，主要负责合成和修饰细胞膜和细胞壁上的糖蛋白和糖类结构。
在水稻的生长和发育过程中，高尔基体的功能起着至关重要的作用。
高尔基体是一种复杂的亚细胞结构，由多个不同结构和功能的囊泡和管道组成。
在水稻细胞中，高尔基体可以分为两种类型：未成熟的高尔基体和成熟的高尔基体。
未成熟的高尔基体主要负责分拣和转运膜蛋白和质膜蛋白，并将它们向外分泌。
而成熟的高尔基体则负责合成和修饰细胞膜和细胞壁上的糖蛋白和糖类结构。
这些糖类结构在细胞壁和膜的稳定性和功能方面起着非常重要的作用。
近年来，随着基因工程和分子生物学技术的不断发展，人们对高尔基体在水稻生长和发育中的作用以及其在抵抗病原体感染和应对逆境的能力等方面的研究逐渐深入。
研究表明，水稻中高尔基体的功能与细胞凋亡、细胞分裂以及信号转导等生物学过程息息相关。
总之，水稻原生质体高尔基体是一个非常重要的亚细胞结构，其功能在水稻的生长和发育以及应对逆境等方面起着重要的作用。
未来，我
们需要进一步深入研究高尔基体在水稻生命过程中的功能和调控机制，以期将其应用于水稻产量和品质的提高和农业可持续发展等方面。