厌氧性细菌及检验

厌氧性细菌及检验● 考点概念及分类厌氧菌标本的采集与送检厌氧菌的别离与鉴定〔内容讲解〕一、厌氧菌概述概念：一大群专性厌氧，必须在无氧环境中才能生长的细菌。

生物学分类：主要厌氧菌的分类如以下列图：厌氧菌在正常人体的分布正常人的肠道、口腔、阴道等处均有大量的厌氧菌寄居。

厌氧菌与需氧菌和兼性厌氧菌共同组成人体的正常菌群，其中绝大多数为无芽胞厌氧菌，最多的是类杆菌。

二、厌氧菌标本的采集与送检注意：标本绝对不能被正常菌群所污染；应尽量预防接触空气。

1.采集〔不同部位采纳不同采集方法〕标本来源搜集方法封闭性脓肿针管抽取妇女生殖道后穹窿穿刺抽取下呼吸道分泌物肺穿刺术胸腔胸腔穿刺术窦道、子宫腔、深部创伤用静脉注射的塑料导管穿入感染部位抽吸组织无菌外科切开尿道膀胱穿刺术标本送到实验室，应在20～30分钟内处理完毕，不超过2h。

如不能及时接种，可将标本置室温保存。

〔1〕针筒运送；〔2〕无菌小瓶运送；〔3〕棉拭子运送；〔4〕厌氧罐或厌氧袋运送。

三、厌氧菌的别离与鉴定〔一〕直接镜检依据形态和染色性，结合标本性状与气味，初步对标本中可能有的细菌作出估量。

菌名革兰染色形态及其他特征脆弱类杆菌G-b 两端钝圆，着色深，中间色浅且不均匀，且有气泡，长短不一产黑素普雷沃菌G-b多形性，长短不一，有浓染和空泡，无鞭毛和芽胞。

标本有恶臭，琥珀味，紫外线照耀发红色荧光具核梭杆菌G-b 菌体细长，两头尖，紫色颗粒菌体长轴成双排列，标本有丁酸味坏死梭杆菌G-b 高度多形性，长短不一，菌体中部膨胀呈圆球形韦荣球菌G-c 极小的革兰阴性球菌消化链球菌G+c 革兰阳性呈链状的小球菌乳酸杆菌G+b 细长，有时多形性，呈单、双、短链或栅状排列痤疮丙酸杆菌G+b排列特别呈X、Y、V或栅状，标本有丙酸气味双歧杆菌G+b 多形性，有分支呈Y、V形成棒状，标本有醋酸气味放线菌G+b 分支呈棒状、X、Y、V或栅状，脓汁中得黄色颗粒，有琥珀酸味破伤风杆菌G+b 细长、梭形或鼓槌形，有芽胞，有周鞭毛产气荚膜梭菌G+b 粗大杆菌，呈单或双排列，有芽胞，有荚膜困难梭菌G+b 粗长杆菌，有芽胞，有鞭毛，近来觉察有荚膜〔二〕别离培养主要分初代培养和次代培养两个阶段，初代培养的一般原则是：〔1〕先将标本涂片染色直接镜检，指导培养基的选择；〔2〕尽量选用在厌氧菌中覆盖面宽的非选择性培养基；〔3〕最好多项选择1～2种覆盖面不同的选择性培养基；〔4〕尽量保证培养基新奇；〔5〕要考虑到微需氧菌存在的可能。

1.选用适当的培养基接种培养基的使用，应注意以下各点：尽量使用新奇培养基，2～4h内用完；应使用预复原培养基，预复原24～48h更好；可采纳预复原灭菌法制作的培养基；液体培养基应煮沸10min，以驱除溶化氧，并迅速冷却，马上接种；培养厌氧菌的培养基均应营养丰富，并加有复原剂与生长刺激因子。

培养基的选择：初次培养一般都使用选择培养基和非选择培养基。

非选择培养基：本培养基使别离的厌氧菌不被抑制，几乎能培养出全部的厌氧菌。

ü 常使用心脑浸液琼脂〔BHI〕、布氏琼脂〔BR〕、胰豆胨肝粉琼脂〔GAM〕、胰胨酵母琼脂〔EG〕、CDC厌氧血琼脂等。

选择培养基：为有目的选择常见厌氧菌株，以便尽快确定厌氧的种类。

选择培养基培养基细菌KVLB血平板产黑素类杆菌早期产生黑色素七叶苷胆汁平板〔BBE〕脆弱类杆菌FS培养基〔梭杆菌选择培养基〕梭杆菌ES培养基〔优杆菌选择培养基〕优杆菌BS培养基〔双歧杆菌选择培养基〕双歧杆菌卵黄〔EYA〕及兔血平板〔RBA〕产气荚膜梭菌CCFA培养基〔困难梭菌选择培养基〕困难梭菌VS培养基韦荣球菌2.每份标本至少接种3个血平板，分别置于有氧，无氧及5%～10%CO2环境中培养。

3.厌氧培养法厌氧罐培养法；气袋法；气体喷射法；厌氧手套箱培养法〔迄今厌氧菌培养的最正确仪器之一〕；平板焦性没食子酸法；生物耗氧法；高层琼脂培养法。

4.厌氧状态的指示：美蓝和刃天青。

无氧时均呈白色，有氧时美蓝呈蓝色，刃天青呈粉红色。

5.别离培养厌氧菌失败的原因：①培养前未直接涂片和染色镜检；②标本在空气中放置太久或接种的操作时间过长；③未用新奇配制的培养基；④未用选择培养基；⑤培养基未加必要的补充物质；⑥初代培养应用了硫乙醇酸钠作为唯—厌氧菌培养基；⑦无适宜的厌氧罐或厌氧装置漏气；⑧催化剂失活；⑨培养时间缺少；⑩厌氧菌的鉴定材料有问题。

〔三〕鉴定试验〔1〕形态与染色：可为厌氧菌的鉴定提供参考依据。

〔2〕菌落性状：不同的厌氧菌其菌落形态和性质不同。

〔3〕抗生素敏感性鉴定试验：卡那霉素可用于梭杆菌属与类杆菌属的区分，甲硝唑用于厌氧菌与非厌氧菌的区分。

〔4〕生化特性：主要包含多种糖发酵试验、吲哚试验、硝酸盐复原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂肪酸酶试验、蛋白溶化试验、明胶液化试验、胆汁肉汤生长试验以及硫化氢试验等。

〔5〕气液相色谱：可以利用该技术来分析厌氧菌的终末代谢产物，已成为鉴定厌氧菌及其分类的比较可靠的方法。

厌氧球菌1.消化球菌属黑色消化球菌是消化球菌属中唯—的菌种，是人体正常菌群的成员之一G+球菌，无芽胞，无荚膜专性厌氧菌，生长缓慢不发酵糖，触酶阳性，靛基质试验、尿素酶试验、硝酸盐复原试验均阴性青霉素、红霉素、氯霉素、林可霉素、四环素及甲硝唑敏感2.消化链球菌属在临床中以厌氧消化链球菌最常见，可引起人体各部位组织和器官的感染，以混合感染多见。

G+，易变为阴性。

无鞭毛，无芽胞，无荚膜。

专性厌氧，在35～37℃、pH7～7.5时生长最正确，培养物常有恶臭气味。

在含硫培养基如硫乙醇酸钠培养基中，生化反响较为明显，触酶阴性，发酵葡萄糖，不发酵乳糖，不水解胆汁七叶苷，吲哚、尿素酶、硝酸盐复原酶试验均为阴性，对SPS特别敏感。

3.韦荣球菌属口腔、咽部、胃肠道和女性生殖道的正常菌群，为条件致病菌，可产生内毒素，有抗原性，多见于混合感染。

G-球菌，无鞭毛、无芽胞、专性厌氧。

生化反响不生动，不分解糖类，复原硝酸盐，触酶反响－/＋韦荣球菌的鉴别主要依靠触酶试验。

革兰阴性无芽胞厌氧杆菌1.类杆菌属临床标本中以脆弱类杆菌最常见。

常寄生人的口腔、肠道和女性生殖道，主要引起内源性感染G-，无鞭毛、无芽胞，多数有荚膜。

专性厌氧，多数菌株不溶血。

培养基中参加氯化血红素、维生素K和20%胆汁可促进本菌生长。

触酶试验阳性。

对青霉素G、卡那霉素和新霉素耐药，但对氯霉素、氨苄西林、哌拉西林、亚胺培南、甲硝唑敏感。

采集临床标本，革兰染色镜检，假设觉察革兰阴性杆菌，染色不均，具有多形性，疑为本菌。

BBE平板和厌氧血平板接种标本，厌氧培养24～48h观察菌落特征。

气、液相色谱检测其终末代谢产物，有助于快速诊断。

2.普雷沃菌属临床上较常见的条件致病菌，可引起各部位的内源性感染。

混合感染更常见。

G-球杆菌，无鞭毛、芽胞和荚膜。

专性厌氧菌，在20%胆汁培养基中不生长，触酶阴性，大多数脂酶阴性，脲酶阴性。

3.紫单胞菌属代表菌种是不解糖紫单胞菌。

主要引起人类牙周炎、牙髓炎和根尖周炎等。

未出现黑色素之前，用波长366nm的紫外线灯照耀，可出现红色荧光，这是因为该菌能合成原卟啉。

均产生色素，不分解糖或弱分解糖，触酶试验大多阴性，胆汁七叶苷和脂酶试验阴性，吲哚大多阳性。

能液化明胶。

代谢产物为乙酸、丙酸和异戊酸等。

4.梭杆菌属寄生人体的正常菌群，在口腔牙垢中最为多见代表菌种是具核梭杆菌，在临床感染中最常见；坏死梭杆菌是毒力很强的梭杆菌，可引起严峻感。

G-，有时菌体中有G+颗粒存在。

无鞭毛，为严格的专性厌氧菌。

生化反响不生动，在20%胆汁中不生长。

主要代谢产物是丁酸。

革兰阳性无芽胞厌氧杆菌1.丙酸杆菌属主要寄生在人体的皮肤和乳制品及青储饲料中。

无芽胞、无鞭毛、无荚膜，染色不均。

厌氧或兼性厌氧。

菌落为圆形凸起、白色透明、外表光滑。

大多能液化明胶，触酶试验阳性，发酵葡萄糖产生丙酸。

2.优杆菌属临床上最常见的是迟钝优杆菌和黏液优杆菌。

人和动物口腔与肠道正常菌群的成员，对机体有营养、生物拮抗和维持肠道微生态平衡等功能。

具有多形态性。

多数菌种生化反响生动，如黏液优杆菌就能发酵葡萄糖和阿拉伯糖，凝固牛乳，水解七叶苷。

少数菌株生化反响不生动，如迟钝优杆菌。

3.双歧杆菌属代表菌株为两歧双歧杆菌。

人和动物肠道内重要的生理菌群。

有高度多形性。

专性厌氧，菌落圆形、较小、不透明、外表光滑不溶血。

发酵葡萄糖产生乙酸和乳酸，还产生少量甲酸及琥珀酸，不产生丁酸和丙酸，大多数细菌触酶阴性，不产生吲哚，不复原硝酸盐。

4.乳杆菌属代表菌种是德氏乳杆菌。

脊椎动物消化道、阴道的正常共生菌，对致病菌的繁殖有抑制作用。

无芽胞的细长杆菌，无荚膜及鞭毛。

专性厌氧、兼性厌氧或微需氧。

营养要求复杂，最适温度30～40℃，嗜酸，最适PH5.5～6.2，能发酵多种糖类，主要产生乳酸。

梭状芽胞杆菌1.破伤风梭菌广泛存在于自然界，在土壤和人、动物的肠道中都有存在。

当机体受创伤时，破伤风梭菌可侵入伤口生长繁殖，产生外毒素，引起机体强直性痉挛、抽搐，称为破伤风。

致病物质主要是外毒素，又称痉挛毒素。

本菌细长，有周鞭毛，能运动，无荚膜。

芽胞正圆形，比菌体大，位于菌体顶端，使细菌呈鼓槌状，此为本菌的特征。

专性厌氧；培养基有腐败性恶臭。

菌体〔O〕抗原和鞭毛〔H〕抗原。

芽胞抵抗力甚强。

依据破伤风的典型临床表现即可作出诊断，故一般不做细菌学检查。

假设必需要求时，可做:直接涂片、厌氧培养、毒力试验和鉴定。

2.产气荚膜梭菌临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌。

致病物质:产生外毒素及多种侵袭性酶类，外毒素中最重要的是α毒素，为卵磷脂酶，能分解人和动物细胞膜上的磷脂和蛋白质的复合物。

致病条件主要是大面积创伤、供血缺少。

所致疾病主要是气性坏疽。

G+粗短大杆菌，芽胞椭圆形，位于菌体中央或次极端，可产生明显的荚膜。

无鞭毛，不能运动。

厌氧，但要求不严格。

多数菌株有双层溶血环，内环完全溶血，外环不完全溶血。

在牛乳培养基中，使酪蛋白凝固，同时产生大量气体，称为汹涌发酵，是此菌的特征。

依据外毒素将产气荚膜梭菌分成A、B、C、D、E5个毒素型。

直接涂片可见到革兰阳性粗大杆菌，并伴有其他杂菌，同时镜下白细胞较少形态不规则，是气性坏疽临床标本直接涂片的特点。

厌氧培养，依据形态、培养特性〔如汹涌发酵〕。

Nagler试验、动物实验及挥发性代谢产物可鉴定。

3.肉毒梭菌寄生菌，能产生极强的外毒素。

广泛存在于自然界，土壤中尚可检出，间或存在于动物粪便中。

在厌氧条件下可产生极其强烈的外毒素--肉毒素。

G+粗短杆菌，20～25℃时在菌体次极端形成椭圆形芽胞，芽胞大于菌体。

周身鞭毛，无荚膜。

严格厌氧，能产生脂肪酶，在血平板上有β溶血。

生化特性随毒素型不同而有所差异。

一般不产生卵磷脂酶。

肉毒毒素是目前已知毒物中毒性最强者，本菌芽胞抵抗力很强。