甲状腺癌原位细胞凋亡检测与细胞核因子-kB的表达及意义
-细胞凋亡的检测方法-
细胞凋亡的检测方法细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。
细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。
一、细胞凋亡的形态学检测二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中（图3）。
Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。
将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
方法1 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室温避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反应5min 后，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1h），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
2 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。
3 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。
结果（图4、图5）注意事项1. 整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
2. 操作时注意避光，反应完毕后尽快在一小时内检测。
ATF4基因与肿瘤
ATF4基因与肿瘤王慧;刘勤江【摘要】转录激活子4(ATF4)属于ATF/CREB家族,在缺氧、氨基酸缺失、氧化应激和内质网应激等应激反应中发挥重要作用.在多数肿瘤中ATF4表达上调,并能增强肿瘤的缺氧耐受和促进肿瘤的生长及血管生成因子的表达,进而参与调节肿瘤发生发展的相关过程.因此,ATF4可能成为肿瘤治疗领域中的潜在新靶点.本文通过复习相关文献对ATF4基因在肿瘤研究中的相关进展进行综述.【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2018(015)018【总页数】4页(P36-39)【关键词】肿瘤;转录激活子4;内质网应激【作者】王慧;刘勤江【作者单位】兰州大学生命科学学院,甘肃兰州730000;甘肃省肿瘤医院头颈外科,甘肃兰州730050【正文语种】中文【中图分类】R730转录激活子 4（activatingtranscriptionfactor4，ATF4）是一种普遍的胁迫反应响应基因，被称为环腺苷酸（cAMP）连接效应元件 2（CREB2），同时也是综合应激反应途径中的重要响应器，属于激活转录因子/循环AMP反应元素结合蛋白（ATF/CREB）家族，在由缺氧、氨基酸缺失、氧化应激和内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）等应激信号诱导的反应中发挥重要作用。
近年来，许多研究发现，ATF4表达在多种肿瘤中上调，并参与调节肿瘤进展的相关过程，这提示ATF4有可能成为肿瘤治疗的潜在新靶点。
1 ATF4基因ATF4基因定位于22号染色体的q13.1，大小约2122 bp，含有3个外显子，编码蛋白包含351个氨基酸，属于ATF/CREB家族[1]。
ATF家族是一群含有碱性亮氨酸拉链区域（bZIP）的转录因子，而此区域与蛋白之间的相互作用有关，该家族成员除了ATF4外还包括 ATF1、CREB/CREM、CREB314、CREB-H、ATF2、ATF3、ATF6、ATF7、B-ATF 和 ATFX（也称为 ATF5），根据每个激活子与cAMP的结合位点不同可以区分各个成员[1]。
CK-19和Ki-67在甲状腺癌的表达和鉴别诊断意义
CK-19和Ki-67在甲状腺癌的表达和鉴别诊断意义发表时间：2013-07-23T16:43:33.873Z 来源：《医药前沿》2013年第14期供稿作者：史琳张安文罗宇赵时梅任传伟杨燕初[导读] 甲状腺癌的发病率约占全身恶性肿瘤的1%-2%，其类型多样，预后差异大，因此增强诊断的时效性和准确性显得尤为重要。
史琳张安文罗宇赵时梅任传伟杨燕初(通讯作者)（广西科技大学医学院病理教研室广西柳州 545005）【摘要】目的探讨甲状腺癌组织中CK-19和Ki-67的表达及鉴别诊断意义。
方法应用免疫组化法对180例甲状腺癌、60例甲状腺良性病变及40例甲状腺正常组织进行CK-19与 Ki-67检测。
结果 1.甲状腺乳头状癌组CK-19阳性表达率显著高于滤泡癌组、良性病变组、正常组(P<0.05)；2.Ki-67在正常组无表达，余各组均阳性表达，但差异无统计学意义(P>0.05); 3.滤泡癌组Ki-67 LI显著高于乳头状癌组、良性病变组、正常组(P<0.05)；4.CK-19、Ki-67阳性表达率与性别、年龄无关，与肿瘤大小、进展分期正相关(P<0.05)。
结论 CK-19、Ki-67的表达分别在乳头状癌、滤泡癌上调，随肿瘤进展而增高，可作为甲状腺癌鉴别诊断及预后评估的良好指标。
【关键词】甲状腺癌良性病变 CK-19 Ki-67【中图分类号】R730.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）14-0029-02 甲状腺癌的发病率约占全身恶性肿瘤的1%-2%，其类型多样，预后差异大，因此增强诊断的时效性和准确性显得尤为重要。
CK-19是一种低分子角蛋白，研究发现其在甲状腺癌等上皮性肿瘤组织中表达增高[1]；另有研究对小样本髓样癌患者长期随访发现，Ki-67高表达是独立于其他预后因素的敏感指标[2]。
本研究采用免疫组织化学法联合检测大样本甲状腺病变组织中CK-19和Ki-67蛋白的表达，探讨两者与甲状腺癌的诊断及恶性分层的关系。
NF-κB、IκB、IKK在非小细胞肺癌中的表达及意义
NF-κB、IκB、IKK在非小细胞肺癌中的表达及意义赵统;吕坤聚;蒋捍东【摘要】Objective To investigate the expression of NF-kappaB P65,p-IκBα and p-IKKβ in non-small cell lung cancer (NSCLC) in order to investigate their relationship with the clinical pathologic features of patients with NSCLC. Methods The immunohistochemical staining method was used to detecte the expression of NF-κB P65,p-IκBα(phosphorylated IκBα)and p-IKKβ(phosphorylated IKKβ) in NSCLC (n=56)and 20 normal lung tissues. Results The positive rates of NF-KB P65, p-IκBα and p-IKKβ expression were 83. 9%(47/56),55. 7%(31/56) and 69. 6%(39/56) in NSCLC tissues but 20% (4/20),25% (5/20) and 30% (6/20) in normal tissues. Their expression level was related to tumor stages, cell differentiation, lymphnode involvement and smoking of patients (P<0, 05) > but not related to age, gender and pathological types (P>0. 05). Conclusion Higher expression levels of NF-κB P65、p-IκBα and p- IKKβ are closely associated with the carcinogenesis and progress of NSCLC.%目的检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中NF-κB P65、p-IκBα(IκBα磷酸化)、p-IKKβ口(IKKβ磷酸化)的表达情况及其与NSCLC临床特征的关系.方法采用免疫组化Elivision法检测NF-κB P65、p-IκBα、p-KKβ在56例NSCLC中表达情况,以20例癌旁组织作为对照.结果在NSCLC中NF-κB P65、p-IκBα、p-IKKβ的表达阳性率分别为83.9％(47/56)、55.7％(31/56)、69.6％(39/56),癌旁组织三者分别为20％(4/20)、25％ (5/20)、30％(6/20),NFκB P65、p-IκBα、p-IKKβ的表达与吸烟史、TNM分期、淋巴结转移相关,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 NF-κB P65、p-IκBα、p-IKK3高表达与NSCLC的发生、发展起着重要作用.【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》【年(卷),期】2012(021)002【总页数】4页(P138-141)【关键词】肺肿瘤;NF-κB P65;IκBα;IKKβ;免疫组织化学【作者】赵统;吕坤聚;蒋捍东【作者单位】中国人民解放军第401医院呼吸内科;中国人民解放军第401医院呼吸内科;青岛大学医学院附属医院呼吸内科,山东266000【正文语种】中文【中图分类】R329肺癌在上世纪50年代还被视为罕见的恶性肿瘤，现今估计每年210多万人确诊肺癌，110万人死于肺癌［1］。
NF-kB 炎症相关肿瘤的启动因子
NF-kB 是炎症相关肿瘤的启动因子NF-kB 是炎症相关肿瘤的启动因子，目前关于致癌物质的研究比较多，但关于慢性炎症所致肿瘤形成的分子机理尚不十分清楚。
PIKARSKY应用the Mdr2-knockout mouse（自发性胆汁郁积致肝癌模型），发现肝内皮细胞和炎细胞通过上调肿瘤坏死因子引发NF-kB，NF-kB与肿瘤形成密切相关，提示NF-kB 是在慢性炎症相关肿瘤形成过程中不可缺少的因子，可能为慢性炎症所致肿瘤的预防提供可能的靶点。
我们还不清楚人类癌症的起因，但是，可以估计到，致癌物质的检测和慢性炎症是肿瘤发展的两个潜在条件，慢性炎症能够解释约20%的人类癌症1。
因此，致癌物质的检测和癌症之间的因果关系已被广泛研究2。
关于慢性炎症所致肿瘤发生的分子细胞机理仍不十分清楚。
我们知道，在肿瘤中检常能测到核因子kB (NF-kB)（一种炎症反应的标志因子）的活性4,5，它可能是一种炎症和肿瘤的过度环节。
为了验证这一假设，我们研究了敲除Mdr2基因的小鼠品系，能够通过肝细胞癌自发发生胆小管性肝炎6，它是一种炎症与癌症相关的典型例子7。
我们观察了敲除Mdr2基因小鼠的肝炎和癌演进，结果显示，在邻近的内皮和炎症细胞中，随着肿瘤坏死因子的上升，炎症过程能够触发肝细胞中的NF-kB因子。
在七个月鼠龄的小鼠中，通过使用一种特殊肝细胞可诱导的超级转基因抑制物IkB，来阻断NF-kB，这种抑制物对肝炎和早期肝细胞转化都无影响。
作为对照，通过抗肿瘤坏死因子的治疗或在肿瘤发展的后期阶段，使用具有IkB的超级抑制物进行诱导，来抑制NF - kB的作用，导致转化的肝细胞发生细胞凋亡，破坏肝细胞癌的进展。
因此，我们的研究表明，NF –kB能促进炎症相关的癌症，因此，是一种为慢性炎症所致癌症的预防提供潜在靶点。
肝癌是引起全世界癌症死亡率的第三大原因，通常是在慢性炎症的基础上发生8。
根据在敲除Mdr2基因小鼠中的肿瘤发展，我们已经证实了前期已开展实验的结果6，9，这和人类的肝癌非常相似，包括以下几个不同时期：炎症，异型增生，不典型增生结节（腺瘤样），癌转移（附图1a，b）。
细胞凋亡机制及其在疾病中的作用
细胞凋亡机制及其在疾病中的作用细胞凋亡是机体内常见的一种细胞死亡方式，它相对于坏死而言是一种有序、规范化死亡的现象。
细胞在接受到一些不良刺激或遭受损伤的情况下，会启动基因编程性的自我死亡机制，最终导致细胞的死亡。
而细胞凋亡机制则是决定了细胞凋亡所需的分子、信号途径和效应等一系列生物学过程。
本文将从细胞凋亡的机制和在疾病中作用两个方面来介绍细胞凋亡。
一、细胞凋亡的机制细胞凋亡可通过两种不同的通路发生：内源性通路和外源性通路。
1. 内源性通路内源性通路是由一些正常生理性刺激，例如生长后期、细胞成熟和缺血等，所激活的内部细胞死亡通路。
这些生理性刺激会导致细胞内出现一些不必要的组分，如受损蛋白质、过度摄取的脂质，以及自身产生的代谢产物等，这些组分被识别和清除后，细胞会启动内源性通路进行细胞凋亡。
该通路主要是由线粒体的细胞死亡信号途径和细胞核因子-kB (NF-kB)信号途径所控制。
其中线粒体的细胞死亡信号途径是由外环蛋白14-3-3介导的。
14-3-3在正常情况下与Bcnl1相互作用，抑制Bcnl1活性和线粒体膜的通透性。
当有死亡刺激物时，14-3-3分离出来，导致Bcnl1活性的增加，最终导致线粒体膜上的外部死亡信号分子被释放，从而启动细胞死亡通路。
与此同时，NF-kB信号途径则保持在保护细胞的状态下。
2. 外源性通路外源性通路是由于细胞受到一些病理性刺激，例如DNA损伤、病毒感染、药物毒性等所引起的细胞凋亡。
这些刺激物能够诱导出有利于细胞凋亡的蛋白质，如P53和Bax等，在细胞内激活协同作用，引起细胞死亡信号的形成，最终导致细胞凋亡。
该通路主要是由膜上受体死亡信号途径和肝细胞核和细胞因子激活途径所控制。
其中膜上受体死亡信号途径是通过包括TNF-R1、FasR和TRAIL-R1/2等死亡受体在内的一组膜上受体来激活细胞死亡信号途径的。
当受体与其相应的配体结合时，会激活Caspaese-8，最终导致细胞凋亡。
【疾病名】甲状腺癌【英文名】thyroidcarcinoma
【疾病名】甲状腺癌【英文名】thyroid carcinoma【缩写】【别名】struma maligna；thyroid cancer；恶性甲状腺肿【ICD号】C73【概述】甲状腺癌 (thyroid carcinoma)是最常见的甲状腺恶性肿瘤，是来源于甲状腺上皮细胞的恶性肿瘤。
约占全身恶性肿瘤的1.3%～1.5%，且近年有增长趋势。
除髓样癌外，绝大部分甲状腺癌起源于滤泡上皮细胞，按病理类型可分为乳头状癌(60%)、滤泡状腺癌(20%)、未分化癌(15%)、髓样癌(7%)。
其中乳头状癌较早出现颈淋巴结转移，但预后较好；滤泡状腺癌肿瘤生长较快，属中度恶性，易经血运转移；未分化癌预后很差，平均存活时间3～6个月。
而临床上甲状腺癌与甲状腺腺瘤或结节性甲状腺肿有时不易鉴别，处理亦感到困难，故需加以重视。
此外，还可有淋巴系统恶性肿瘤或转移癌，也有少见的甲状腺原发性鳞状细胞癌、甲状腺肉瘤及恶性畸胎瘤等。
甲状腺癌中以乳头状癌在临床上较为多见。
【流行病学】甲状腺癌在国内外均为散发性。
1.发病率 甲状腺结节的发病率因受到被调查人群的影响而存在一定的差异，但通常认为，甲状腺良性结节是常见疾病。
目前，我国没有甲状腺结节发病率的确切统计资料，美国的资料表明，4%～7%的成年人在体检时可发现甲状腺结节，而通过超声波检查甲状腺，或尸检发现的甲状腺结节更多，可高达30%～50%。
但甲状腺结节中恶性结节的发生率仅为1%～5%，在甲状腺外科手术中可占甲状腺肿瘤的14%左右。
也有报告甲状腺癌约占全身恶性肿瘤的1.3%，女性占73%，男性占27%，并与外源性射线有关。
(1)地域分布：甲状腺癌的年发病率因地域、肿瘤登记系统的不同而有较大的差异，一般而言，男性甲状腺癌的年发病率为1.2/10万～2.6/10万，女性为2.0/10万～3.8/10万。
冰岛和夏威夷是高甲状腺癌发病率的地区，几乎是北欧和北美，如美国和加拿大的两倍。
我国甲状腺癌的发病率较低，据天津市1993～1997年肿瘤发病登记资料，甲状腺癌的年发病率为0.35/10万，占全部恶性肿瘤的0.78%。
NF-κBp65蛋白在甲状腺癌中的表达及其与细胞周期的关系
ＮＦ－κＢｐ６５蛋白在甲状腺癌中的表达及其与细胞周期的关系【摘要】目的探讨NF-κB p65在甲状腺癌中的表达及其与细胞周期的关系。
方法应用免疫组化方法检测62例甲状腺癌、7例对照组织标本中p65蛋白的表达。
用流式细胞仪分析甲状腺癌细胞周期分布。
结果P65蛋白在正常甲状腺组织中未见表达，在甲状腺癌标本中的阳性率为62.9%(39/62)，两者比较有显著性差异（P＜0.05）；乳头状癌、未分化癌、滤泡状癌和髓样癌p65阳性率分别为45.8%(11/24)、88.9%(8/9)、75.0%(12/16)和61.5%(8/13)，各组之间比较有显著性差异（P＜0.05）；I期、II期、III期和IV期p65阳性率分别为41.2%(7/17)，53.3%(8/15)，77.3%(17/22)和87.5%(7/8)，各组之间比较有显著学差异（P＜0.05）。
随着p65蛋白表达级别的增加，G0/G1细胞比例逐渐降低，而S期细胞比例及细胞增值指数PI均呈逐渐增高的趋势。
结论NF-κB p65在甲状腺肿瘤组织中有异常高表达，其表达与甲状腺癌病理类型、临床分期及有无淋巴转移有关。
P65蛋白表达强度与甲状腺癌细胞增殖活性相关。
【关键词】甲状腺癌；核转录因子κB；细胞周期；免疫组织化学；流式细胞仪甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，具有侵袭性强、易转移的特点［1］。
甲状腺癌的侵犯及转移是导致治疗失败的重要因素，其中涉及多种肿瘤相关因子的参与和调控。
NF-κB的主要形式是由p50和p65组成的异源二聚体，其中p65是其主要活性成份。
在人类的多种肿瘤中已检测到NF-κB的异常表达，并证实其与多种肿瘤细胞的异常增殖、抗凋亡及耐药性的产生、血管生成及浸润性生长等多种重要生物特性有关。
本实验采用免疫组化方法检测62例甲状腺癌标本中p65的表达，并用流式细胞仪分析甲状腺癌细胞周期分布特点，分析p65蛋白表达与临床病理因素及细胞周期的关系。
Galectin-3、Midkine和CK18诊断女性甲状腺癌价值
Galectin-3、Midkine和CK18诊断女性甲状腺癌价值游庆华;徐冬香;高晓芳;叶慧英【摘要】目的:探讨半乳糖凝集素(Gal-3)、中期因子(MK)和人细胞角蛋白(CK-18)诊断女性甲状腺癌价值.方法:选择100例女性甲状腺结节患者,免疫组化检测结节组织中Gal-3、MK、CK-18表达,根据术后病理结果分为良性组(64例)和恶性组(36例),比较不同性质甲状腺结节组Gal-3、MK、CK-18表达差异,以病理结果为准,Gal-3、MK、CK-18检测诊断甲状腺癌价值.结果:甲状腺结节中Gal-3、MK、CK-18阳性表达率恶性组(100.0％、94.4％、91.7％)高于良性组(21.9％、18.8％、15.6％)(P＜0.05).Gal-3、MK、CK-18鉴别良恶性甲状腺结节的灵敏度分别为100.0％、94.4％、91.8％,特异度分别为78.2％、81.3％、84.4％.结论:女性甲状腺癌患者Gal-3、MK、CK-18阳性表达均增高,提示该3项指标对良恶性甲状腺结节的鉴别有较高的诊断价值.【期刊名称】《中国计划生育学杂志》【年(卷),期】2019(027)006【总页数】4页(P725-728)【关键词】女性甲状腺癌;半乳糖凝集素;中期因子;人细胞角蛋白【作者】游庆华;徐冬香;高晓芳;叶慧英【作者单位】复旦大学附属浦东医院上海,201300;复旦大学附属浦东医院上海,201300;复旦大学附属浦东医院上海,201300;复旦大学附属浦东医院上海,201300【正文语种】中文甲状腺癌是近年来发病率增长最快的恶性肿瘤，是内分泌系统最常见恶性肿瘤[1]，甲状腺癌多见于女性[2]。
与其它恶性肿瘤相比病死率较低，绝对死亡人数保持稳定[3]，但随着甲状腺癌发病率快速增加，给社会和家庭带来沉重的家庭负担，成为全球亟待解决的公共卫生问题。
因此早期诊断和医学干预依然是改善患者生存质量，提高远期生存率的关键。
2和MMP-9的表达及意义
2和MMP-9的表达及意义第31卷第1期2O1O年3月扬州大学(农业与生命科学版)JournalofYangzhouUniversity(AgriculturalandLifeScienceEdition)V oI.31NO.1Mar.2O1O胎膜早破孕妇胎膜组织中NF—KB,COX-2和MMP一9的表达及意义孔祥,卢丹,汪萍,周甜甜.(1.扬州大学临床医学院,江苏扬州225001;2.连云港市第一人民医院,江苏连云港222002)摘要:将病例分为绒毛膜羊膜炎组和非绒毛膜羊膜炎组,采用免疫组化SP法检测32例胎膜早破(PROM)和2O例正常孕妇胎膜组织中核转录因子B(NF-~B),环氧合酶一2(COX～2)及基质金属蛋白酶一9(MMP一9)的表达.结果表明:所有PROM胎膜标本,诊断为绒毛膜羊膜炎者占46.88,正常组中胎膜感染占1O.0O;PROM组胎膜组织中NF一B,COX一2,MMP一9表达明显高于对照组孕妇(P<0.05);绒毛膜羊膜炎组胎膜NF-~B,COX一2,MMP一9表达明显高于非绒毛膜羊膜炎组(P<O.05);胎膜早破组患者胎膜组织中COX2,MMP-9阳性表达与NF-~B采用线性相关分析呈明显正相关关系(P<o.o1).NF—KB,COX一2及MMP一9均参与了PROM的发病.C02,MMP一9基因的表达受多功能N卜KB的调控.NF—KB活化可能是PROM发生的关键因素.关键词:胎儿;胎膜早破;核转录因子B;环氧合酶一2;基质金属蛋白酶一9;免疫组化中图分类号:R714.433文献标志码:A文章编号:1671～4652(2010)01—0016—04 ChangesofnuclearfactorkappaB,cyclooxygenase2andmatrixmetalloproteinase一9inprematureruptureofmembraneKONGXiang,LUDan,W ANGPing,ZHOUTian-tian(1.CollofClinMed,Y angzhouUniv,Y angzhou225001,China;2.TheFirstHospital,Lianyu ngang222002,China)ABSTRACT:Apieceofmembranewasimmediatelycollectedafterlabor,HEstain.Afterdia gnosingchorioamnionitis,allcasesweredividedintotwogroups:chorioamnionitisgroupandnon—chorioamnionitisgroup.Weusedimmunohisto—chemicalmethodtOassesstheexpressionofnuclearfactorkappa(NFKB),cyelooxygenase-2(CoX一2)andmatrixmetal—loproteinase-9(MMP一9)inthespecimensof32PROMpatientsand20norma1puerperas.Theresultswereasfollows :afterHEstain,theinfectionrateinthePR0Mgroupwas46.88%(15/32),whileinthenormalgr oup,itwas10.00(2/20);PositiveNF—KB,COX_2andMMP一9immunoreactivityinfeta1membranesinthePR0Mgroupwassignificantly higherthanthatjnthenorma1group(P<0.05);TheexpressionofNF-B,COX一2andMMP-9inthechorioamnionitis groupwashigherthanthatinthenonchorioamnionitisgroup(P<O.05);Therewassignific antlypositivecorrelationamongNF—KB,COX一2andMMP一9(P<O.O1).hwasconcludedthatthehighexpressionofNF-KB,COX一2andMMP一9 mayplayanimportantroleinthepathogenesisofprematureruptureofmembrane.Theexpres sionofCoX一2andMMP一9wasregulatedbyNF—KB.TheactivationofNF—KBmaybeakeypointintheetiologicalfactorofPR0M.KEYWORDS:fetus;prematureruptureofrrtembrane;nuclearfactorkappaB;cyclooxygenase-2;matrixmetalloprotein～ase一9;immunohistochemistry胎膜早破(PROM)是指胎膜在临产以前发生破裂,是产科的一种常见并发症Ⅲ,易导致感染,早产,脐带脱垂,羊水栓塞,胎儿窘迫,新生儿肺炎,新生儿败血症等并发症,大大增加了围生期母婴的发病率和病死率.探究PROM的病因及发病机制已成为当代产科的重要研究课题.核转录因子一B(NF一B)是近年来发现的一种多效性核转录因子,通常情况下以二聚体形式存在收稿日期:2009一O927基金项目:江苏省社会发展项目(BS2006536);扬州市社会发展项目(YZS2007003) 作者简介:孔祥(1962一),男,江苏泰州人,扬州大学副教授,硕士,主要从事围产医学研究.E-mail:*************第1期孔祥等:胎膜早破孕妇胎膜组织中NF-xB,COX一2和MMP一9的表达及意义17细胞质中.当受到细胞因子,病毒及紫外线等因素刺激后,NF—xB活化进人细胞核,促进多种相关基因的表达,参与启动并调节机体免疫和炎症反应,凋亡及细胞的增殖分化.国外研究报道,人类妊娠及产程进展与妊娠组织中NF—xB活性密切相关l2.].PROM与早产关系密切,研究表明与妊娠维持,分娩发动相关的主要是COX一24].MMP9能够降解基底膜的主要成分IV型胶原,导致胎膜结构薄弱,易于破裂.有研究表明NF—B参与了COX一2,MMP一9表达的调控_6],但在胎膜早破组织中的表达研究尚未见报道.本文研究胎膜早破胎膜组织中NF—B,COX一2和MMP一9的表达,以探讨其临床意义.1材料与方法1.1研究对象选择2006年l1月至2007年5月在扬州大学附属苏北人民医院妇产科住院的初产胎膜早破孕妇32例作为受试对象,分为2组,I组2O例,为足月PROM(tPROM),平均年龄(28.20±3.38)岁,平均孕期为(39.14±0.83)周;II组12例,为未足月PROM(pPROM),平均年龄(28.33±2.57)岁,平均孕期为(33.99±3.69)周.选取同期住院正常足月妊娠初产妇女20例为对照组,平均年龄(27.30±1.56)岁,平均孕期为(39.99±1.06)周.受试组与对照组孕妇均自然分娩,年龄和孕期间进行比较,无显着差异.所有病例均无临床感染征象,无母体疾病及其他产科并发症,单胎头位.2组孕妇均在产后取胎膜破口处2cm×2cm大小胎膜组织,用消毒棉签去掉蜕膜组织,再用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次,去掉黏着的血液.10中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,用于病理学和免疫组织化学检测.1.2诊断标准1)胎膜早破判定标准:参考第6版《妇产科学》,经下述检查确诊为胎膜早破.①阴道宫颈消毒后,在窥器直视下手触宫底见有羊水流出;②pH试验呈碱性;③阴道后穹窿液涂片检查见胎脂,胎毛或胎儿上皮细胞.2)胎盘绒毛膜羊膜炎的病理诊断标准:胎膜标本病理切片常规HE染色,显微镜下观察,在绒毛膜及羊膜组织中,每个高倍视野中性粒细胞浸润≥3～4个称为绒毛膜羊膜炎组(感染组),无绒毛膜羊膜炎组(无感染组)即每个高倍视野中性粒细胞浸润小于3个或无浸润.1.3方法1)主要试剂:NF—B/p65亚单位鼠抗多克隆抗体(工作浓度1:100),COX一2羊抗多克隆抗(12作浓度1:150),MMP一9兔抗多克隆抗体(工作浓度1:100)试剂盒,DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司.2)常规HE染色法检测绒毛膜羊膜炎.3)免疫组化SP法检测胎膜组织中NF—B,COX一2和MMP一9的表达:具体操作严格按试剂盒说明书进行,切片常规二甲苯脱蜡,梯度乙醇脱水;微波修复抗原,一抗置4IC冰箱中过夜,滴加生物素标记的二抗,37℃温箱孵育30rain,DAB显色,苏木素复染.用已知乳腺癌NF—xB/p65阳性片作对照.采用PBS代替一抗作阴性对照.结果判断:NF一~B/p65细胞核内出现明显棕黄色颗粒为阳性细胞,COX一2,MMP一9阳性信号定位于胞质.在高倍镜下(×4OO)对每个标本随机选10个视野进行阳性细胞计数,根据染色强度及范围分别用"+,++,卅"表示阳性细胞数分别为小于259/6,25～50及大于50.细胞数范围小于5定义为"一".1.4统计学方法所有数据用SPSS10.0及EXCEI2003软件统计分析.采用t检验,行×列表.检验及直线相关分析.2结果与分析2.1HE染色行绒毛膜羊膜炎检查所有胎膜早破胎膜标本,感染者占46.88,其中pPROM患者中胎膜感染占66.67,tPROM患者中胎膜感染占35.O0,对照组胎膜感染占1O.()(].l8扬州大学(农业与生命科学版)第31卷2.2胎膜组织中NF一~B/p65,COX一2和MMP一9的表达情况pPROM组胎膜组织中NF一~B/p65,COX一2,MMP一9表达明显高于对照组孕妇(P值分别为0.028,0.023,0.012,均小于0.05);tPROM组胎膜组织中NF一~B/p65,COX一2,MMP一9表达明显高于对照组孕妇(P值分别为0.022,0.041,0.043,均小于0.05);pPROM组与tPROM组问比较差异不显着(表1).表1胎膜组织中NF-~B/p6S,COX-2及MMP-9的表达Tab.1TheexpressionofNF-~B/tm5,COX-2andMMP-9infetalmembranesfrom2.3感染与未感染胎膜组织中NF.KB/p65,COX一2及MMP一9的表达由表2可知,绒毛膜羊膜炎组即感染组胎膜NF一~B/p65,COX一2,MMP一9表达明显高于非绒毛膜羊膜炎组即无感染组(P值分别为0.016,0.040,0.025,均小于0.05)(见表2).表2感染与未感染胎膜组织中NF-~B/p65,COX-2及MMP一9的表达Tab.2TheexpressionofNF-~B/p65,COX-2andMMP-9infetalmembranesfrom chorioamnionitisgroupandnonchorioamnionitisgroup2.4NF-KB/p65,COX一2,MMP一9在胎膜早破pPROM组,tPROM组患者胎膜组织中表达的相关性比较胎膜早破pPROM组,tPROM组患者胎膜组织中COX一2,MMP一9阳性表达与NF一~B/p65阳性表达的关系,采用线性相关分析,NF—IcB与COX一2,NF—IcB与MMP一9,COX一2与MMP一9,结果呈明显正相关关系(r分别为0.738,0.532,0.383,P%0.O1).3讨论胎膜是胎儿的附属物之一,由绒毛膜和羊膜组成.胎膜的外层为绒毛膜,来源于细胞滋养细胞的内层,厚0.O2～0.2mm,主要部分由粗细不等的纤维组成复杂的网状结构,对绒毛膜的强度起决定作用.胎膜的内层为羊膜,亦由细胞滋养细胞层衍化而来,与羊膜腔内羊水和胎儿接触,厚度为0.02～0.05mm.位于基膜以下的致密层由不溶性的胶原纤维和分泌胶原纤维的纤维母细胞构成,特别是以Ⅳ胶原为主,因此胶原纤维的正常结构与功能对保持羊膜的抗张性起着至关重要的作用.完整的胎膜能够使羊膜腔内保持一定的羊水量以保护胎儿及母体的安全,并且能够阻挡阴道病原微生物的上行性侵入.胎膜早破是指胎膜在临产以前发生破裂,是产科常见的并发症.PROM好发因素很多,但病因机制至今尚不清楚.一般认为与以下因素有关,如创伤,宫颈内口松弛,妊娠后期性交引起机械性刺激或引起胎膜炎,羊膜腔内压力升高,胎儿先露部与骨盆入口未能很好地衔接,下生殖道感染及胎膜结构异常或发育不良等.也有人认为孕妇缺少微量元素锌,铜也可引起PROM.很多流行病学,临床,组织学,微生物学和分子生物学资料提示感染或炎症起到了主要的作用.感染是PROM 的重要发病因素之一_1.据报道,与PROM发生关系密切的病原体有溶血性链球菌,淋球菌,沙眼衣原体解脲支原体,生殖支原体,弓形虫,淋球菌和某些厌氧菌.病原体经宫颈口感染胎膜,也可经血行播散至子宫,胎盘,发生羊膜炎,绒毛膜羊膜炎,使胎膜组织水肿,变脆,强度下降;位于宫颈及阴道穹隆部的微生物能够产生膜蛋白水解酶,水解胎膜的细胞外基质,使其强度下降,胎膜易发生破裂.NF_B是近年来发现的一种多效性核转录因子,通常情况下以二聚体形式及其抑制蛋白(I.cB)组成复合物被阻隔在细胞质中.当受细胞因子,病毒,免疫刺激剂,脂多糖及紫外线等多种刺激后,I.cB磷酸化而被降解,NF_JcB活化进入核内,促进细胞因子,趋化因子,粘附分子,生长因子,环氧化酶一2(COX-2),基质第1期孔祥等:胎膜早破孕妇胎膜组织中NF-~B,COX2和MMP一9的表达及意义19金属蛋白酶(MMPs),凋亡相关因子等表达,参与启动并调节机体免疫和炎症反应,凋亡及细胞的增殖分化.作者研究发现,PROM组胎膜组织中NF_KB表达明显高于对照组孕妇,患有绒毛膜羊膜炎组胎膜NF-~B表达明显高于非绒毛膜羊膜炎组.正常胎膜组织中NF_B主要在胞质中表达,PROM胎膜组织中NF-KB的表达增强,主要定位于细胞核表达,细胞核染色呈深棕色.说明PROM胎膜中NF_JcB活化明显,NF_B参与了PROM发病u.环氧合酶(COX)即前列腺素合成酶,是花生四烯酸从膜膦酸酯转化为炎性因子前列腺素类物质的关键限速酶.现认为至少存在以下2种亚型:COX-1和CoX 一2.COXr1是一种结构型酶,在多种组织中微量恒定表达,对外界刺激不敏感,在维持正常生理过程中起重要作用.COX-2为诱导型异构酶,正常生理状态下多数组织不表达,当细胞受各种刺激因素包括生长因子,细胞因子,炎性递质和激素等作用时,其表达迅速上调.研究表明,与妊娠维持,分娩发动相关的主要是COX_2l_4].本研究发现PROM组胎膜组织中CoX_2表达明显高于对照组,绒毛膜羊膜炎组胎膜组织中COX_2表达明显高于非绒毛膜羊膜炎组.这可能是随着妊娠的进展,羊膜中的COX_2表达增加,产生的前列腺素通过自分泌和旁分泌诱导子宫收缩,宫颈成熟,胎膜破裂,可能为分娩发动的原因之一.在对胎膜早破发病机制的研究中,学者们发现胎膜细胞外基质(ECM)的降解失衡是导致胎膜结构薄弱,易于破裂的重要原因,而基质金属蛋白酶(MMPs)在ECM的降解中起着最为重要的作用.基质金属蛋白酶是能有效降解细胞外基质成分的酶类,根据其降解的底物不同,分为4类(间质胶原酶,明胶酶类,基质溶解素和膜型基质金属蛋白酶),其中MMP一9属于明胶酶类.明胶和Ⅳ型胶原的降解在胎膜结构的弱化上起着重要的作用,而MMP-9可特异性地作用于明胶和Ⅳ型胶原,从而诱发胎膜破裂.Romeror等¨1胡发现,自发性胎膜破裂伴分娩孕妇胎膜组织中MMPs的活性明显升高,MMP-9水平的升高更为显着,与本研究结果相符.已经发现在C0X_2基因的5端flanking区域存在两处NF_KB的结合位点,MMP-9基因5端一600位置有一处NF_B的结合位点.本研究表明,NF-B,COX_2,MMP-9在胎膜组织中表达,三者之间具有明显的正相关性.初步认为在胎膜早破发病中,NIcB可能通过直接的转录调控或其他间接的作用对cOX_2,MMP-9的表达起重要的调控作用.参考文献:[1]乐杰.妇产科学[M].6版.北京:人民卫生出版社,2004:145—146.E2]ChapmanNR,Europe—FinnerGN,RobsonSC.Expressionanddeoxyribonucleicacidbindingactivityofthenucle arfactorkappaBfamilyinthehumanmyometriumduringpregnancyandlabor[J].ClinEndoc 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的关系 。方法
采用原位细胞 凋亡检测 （ＵＮ Ｌ 试 剂盒及免疫组化方法分别检测原发性 甲状腺癌 （５例） Ｔ Ｅ ） ７ 和
正 常 甲状 腺 组 织 （０例 ） Ａ 及 Ｎ Ｂ表 达 情 况 。 果 甲状 腺 癌 组 织 Ａ 值 明显 高 于 正 常 甲状 腺 组 织 （ １ 的 Ｉ ＦＫ 结 Ｉ Ｐ＜ ００ ） 不 同 病 理 分 型 的 甲状 腺 癌 组 织 Ａ 值 阳 性 情 况 表达 差异 无统 计 学 意 义 Ｃ ．５ ， Ｉ Ｐ＞ ０ ５ ； ． ） 甲状 腺 癌 组 织 中 Ｎ — ０ Ｆ Ｋ Ｂ的表 达 明显 高 于 正 常 甲状 腺 组 织 ＜ ０ ５ ， 同病 理 分 型 的 甲状 腺 癌 组 织 Ｎ —Ｂ表 达 差 异 无 统 计 学 意 义 ． ）不 ０ ＦＫ （ ＞ ００ ） 尸 ． 。甲状 腺 癌 组 织 ＡＩ 阳 性 情 况 表 达 与 ＮＦＫ 的表 达 呈 正 相 关 （＝ ． ６Ｐ ＜ ００ ） ５ 值 ．Ｂ ｒ ０５ ， － ０ ．１ 。结 论 腺 癌 中 Ｎ － ３的 高表 达 影 响 了 甲状 腺 癌 组 织 中 的 细胞 凋亡 。 Ｆｒ ｄ
ｔｙ ｏ ｄｃ ｒｉ ｏ ． ｅ ｈ ｄ ７ ａ ｅ ｔ ｗｉ ｙ ｏ ｄｃ ｃｎ ｍａａ ｄ １ ｏ ｍａ ｙ ｏ ｄ ｗｅ ｅｓｕ ｉｄ ｆ ｒ ｅ ｅ ｔ ｎｏ ｈ ｒ ｉ ａ ｃｎ ｍａ Ｍ ｔ ｏ ｓ ５ｐ ｔ ｎ ｓ ｔ ｔ ｒ ｉ ａ ｉ ｏ ｎ ０ｎ ｒ ｌ ｈ ｒ ｉ ｒ ｔｄ ｅ ｏ ｔ ｃ ｏ ｆ ｉ ｈｈ ｒ ｔ ｄ ｉ ａ ｏ ｔｔ ｄ ｘ ｂ ＵＮＥＬ ｍｅ ｏ ， ｎ ｅｅ ｐ ｅ ｓｏ ｆ Ｆ－ ３ｂ ｐ ｐｏｉ ｉ ｅ ｙＴ ｃｎ ｔ ｄ ａ ｄｔ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｏ ｒ ｙｉ ｈ ｈ Ｎ Ｊ ｍｍｕ ｏ ｉｔ ｃ ｅ ｓｒ ．Ｒｅ ｕ ｔ Ｔｈ ａ 叩 一 ｎ ｈ ｓ ｈ ｍｉｔ ｏ ｙ ｓｌ ｓ ｅｍｅ ｎ
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【 键 词 】 甲状 腺癌 ； 疫 组 化 ； 亡 指 数 ； 关 免 凋 细胞 核 因 子 Ｂ Ｋ
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见 代实用 医学
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甲状腺癌原位细胞凋亡检测与细胞核 因子一Ｂ的 ｎ 表 达 及 意 义
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