Tunel染色实验-检测细胞凋亡
Tunel染色步骤
Tunel染色步骤染色是生物学实验中常用的一种技术手段，它可以标记和可视化细胞或组织中的特定分子或结构。
TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）染色技术是一种常用于检测细胞凋亡的方法。
以下是TUNEL染色的步骤：准备工作：1.去离子水：除去离子，避免离子干扰反应。
2. 去氧核酸酶（DNase）的酶标：新鲜制备，如购买的DNase酶标已开封或保存时间较长，需要用氧化热焓（将无水乙酸用过氧化氢气化后灭菌）处理一晚才可以使用。
步骤一：样本固定1.取细胞或组织样本，放入离子缺失的缓冲液中，使其完全被液体覆盖。
2. 加入4%的 paraformaldehyde（或其他细胞或组织固定液），室温下固定10-15分钟。
3.将样本漂洗3次，每次10分钟，使用冷PBS漂洗。
4.用细胞色素染色法染色检测固定细胞总蛋白质。
步骤二：处理样本1. 将细胞或组织样本渗透处理：将固定的细胞或组织置于PBS中含有0.5% Triton X-100（或0.1-0.2%的Bis-vinylsulfonyl] ethane等亲水试剂）的溶液中，室温下渗透30分钟。
2.将样本漂洗3次，每次10分钟，使用冷PBS漂洗。
3. 用DNase酶标法探测样本中DNA裂解。
步骤三：TUNEL反应1.取TUNEL反应液，根据实验需要，在冷冻时保持在冰上。
2.用比色皿将样本恢复到PBS中，将足量的TUNEL反应液加入标本中，使标本完全浸润，尽量避免气泡。
3.在37℃下孵育1-2小时。
步骤四：反应终止1.将标本移至冷藏，室温下用PBS漂洗3次，每次10分钟。
2.用缓冲液漂洗标本3次，每次10分钟。
步骤五：可视化与分析1.在镜下放置标本。
2.加入螢光抑制剂或DAPI等染料，使用荧光显微镜检测标本。
总结：TUNEL染色技术是一项用于检测细胞凋亡的重要方法。
它通过检测DNA的断裂末端来间接检测细胞凋亡。
整个TUNEL染色过程包括样本固定、样本处理、TUNEL反应、反应终止和可视化与分析等步骤。
TUNEL法检测细胞凋亡
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。
基因组DNA 断裂时，暴露的3'-0H 可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deox yn ucleotidyl Tran sferase,TdT）的催化下加上荧光素（FITC）标记的dUTP（fluorescein-dUTP），从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL 法检测细胞凋亡的原理。
TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂（和细胞凋亡时的断裂方式不同）。
这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
针对问题2（TUNEL法的实验原理是什么？）：基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3 -0H结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP 上的biot in 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biot in 分子），最后用DAB过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。
■1. TUNEL工作原理：简单说就是一一TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是；生物素（biot in ）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT En zyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3' - 0H末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP ）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-0H形成，很少能够被染色。
tunel法检测细胞凋亡实验步骤
tunel法检测细胞凋亡实验步骤细胞凋亡是一种重要的生物学过程，它在多种生理和病理情况下发挥着关键作用。
为了研究细胞凋亡的机制和调控，科学家们发展了多种方法来检测细胞凋亡。
其中一种常用的方法是使用tunel法。
本文将介绍tunel法检测细胞凋亡的实验步骤。
实验步骤如下：1. 细胞培养和处理我们需要选择一种适合的细胞系进行实验。
常用的细胞系有HEK293、HeLa和Jurkat等。
将细胞培养在含有适当培养基和补充物的培养皿中，并在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养至细胞密度适当。
在进行实验之前，需要根据实验设计的需要处理细胞。
例如，可以给予细胞不同的处理，如药物刺激、放射线照射或感染病毒等。
2. 固定细胞将处理后的细胞用适当的缓冲液进行固定。
常用的缓冲液有4%的乙醛或4%的甲醛等。
将缓冲液加入培养皿中，使细胞完全覆盖，并在室温下固定15分钟。
3. 洗涤细胞将固定的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，每次5分钟。
洗涤的目的是去除固定液中的残留物质，以减少后续步骤中的非特异性背景。
4. 使细胞透膜使用蛋白酶K或蛋白酶XXIV等酶将细胞膜上的蛋白质降解，使细胞透膜。
将适量的酶加入细胞中，根据实验的需要，可以调整酶的浓度和作用时间。
一般来说，酶的浓度为20μg/ml，作用时间为30分钟。
5. tunel反应使用tunel试剂盒进行细胞凋亡检测。
tunel试剂盒中含有标记有荧光物质的dUTP，可以与DNA断裂的末端结合。
按照试剂盒说明书的要求，将tunel试剂加入细胞中，与细胞中的DNA断裂末端发生连接反应。
反应时间一般为1-2小时。
6. 洗涤和染色将反应结束后的细胞用PBS洗涤3次，每次5分钟。
然后，可以选择使用荧光染料（如DAPI）染色，以标记细胞核。
将染色液加入细胞中，孵育15分钟后再次用PBS洗涤。
7. 显微镜观察和图像获取将处理后的细胞放置在显微镜载玻片上，并使用合适的显微镜观察细胞。
可以调整显微镜的放大倍数和焦距，以获得清晰的图像。
TUNEL染色检测细胞凋亡
TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。
然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。
DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。
低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。
TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。
一、过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。
在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。
毛地黄植物是地高辛的唯一来源。
细胞tunel染色步骤
细胞tunel染色步骤细胞 Tunnel 染色步骤细胞Tunnel 染色是一种常用的细胞凋亡检测方法，通过染色分析可以定量评估细胞凋亡的程度。
本文将介绍细胞Tunnel 染色的步骤。
1. 固定细胞需要将待检测的细胞固定在载玻片上。
固定可使用4%的无水乙醇或4%的甲醛进行，固定时间一般为10-30分钟。
2. 透化细胞固定后的细胞需要进行透化处理，以便Tunnel 酶能够进入细胞内部。
透化可使用0.1%的Triton X-100进行，透化时间一般为5-10分钟。
3. 准备 TUNEL 反应液TUNEL 反应液是细胞Tunnel 染色的核心。
一般来说，TUNEL 反应液包含 Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 酶和标记有荧光或酶的dUTP。
根据实验需求，可以选择不同的标记物，如荧光染料FITC、Rhodamine 或者酶标记物如辣根过氧化物酶（HRP）。
4. 进行 TUNEL 反应将TUNEL 反应液加到透化后的细胞上，尽量覆盖整个玻片表面。
然后，将玻片置于湿度高的环境中，如湿箱或湿化瓶中，温度为37°C。
反应时间一般为1-2小时。
5. 停止反应反应结束后，需要停止TUNEL 反应，以保证结果的准确性。
停止反应可使用缓冲液，如PBS缓冲液或甘氨酸缓冲液，反应时间一般为10分钟。
6. 染色在停止反应后，需要对细胞进行染色，以便观察和分析。
染色可使用荧光显微镜或透射电子显微镜进行观察。
如果使用荧光显微镜，可以直接观察细胞的荧光信号。
如果使用透射电子显微镜，需要进行金粒子染色，将金粒子标记的抗体与TUNEL 反应产物结合，形成可见的电子密度。
7. 细胞计数和分析对染色后的细胞进行计数和分析。
可以使用图像处理软件对细胞进行定量分析，评估细胞凋亡的程度。
可以通过测量染色阳性细胞的数量，计算细胞凋亡指数（Apoptosis Index）。
细胞Tunnel 染色是一种简单而有效的细胞凋亡检测方法，可以广泛应用于生物医学研究中。
tunel染色 作用
tunel染色作用Tunel染色的作用什么是Tunel染色？Tunel染色是一种常用的细胞和组织样本检测方法，用于检测细胞凋亡的发生与程度。
Tunel是”Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling”的缩写，即末端脱氧核苷酸转移酶-去氧尿嘧啶核苷酸末端标记法。
这种染色技术通过标记DNA断裂末端的dUTP来检测细胞凋亡。
Tunel染色的原理Tunel染色的原理基于细胞凋亡时DNA断裂的现象。
在细胞凋亡发生时，DNA会断裂并形成自由的断裂末端。
Tunel染色利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在这些断裂末端上加入标记的dUTP。
通过连接这些标记的dUTP，我们可以利用荧光或颜色物质的发射来显示细胞凋亡的发生和程度。
Tunel染色的应用Tunel染色在生物医学领域中具有广泛的应用。
以下是一些Tunel 染色的主要应用：•细胞凋亡研究：Tunel染色可以帮助科学家们研究各种生理和病理条件下细胞凋亡的发生机制、调控因子以及凋亡信号通路。
•药物研发：许多抗癌药物通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤生长。
Tunel染色可以评估药物对细胞的作用，并帮助科学家们筛选和优化药物候选物。
•疾病诊断：凋亡在许多疾病的发展中起着重要作用。
Tunel染色可以用于检测和诊断与细胞凋亡相关的疾病，如癌症、神经系统疾病和心血管疾病等。
Tunel染色的优点Tunel染色作为一种检测细胞凋亡的方法，具有以下几点优点：•高灵敏度：Tunel染色能够检测到细胞凋亡的微弱信号，可以提供准确的凋亡检测结果。
•易于操作：相比其他凋亡检测方法，Tunel染色的操作相对简单且迅速，可广泛应用于实验室和临床领域。
•可定量化：Tunel染色结果可以通过计算染色阳性细胞百分比或强度来量化细胞凋亡的程度，提供定量化的数据支持。
•多重应用：Tunel染色可以与其他染色方法相结合，如免疫组化染色、细胞形态学分析等，扩展其应用领域。
TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法tunel完成
<TUNEL>
TUNEL〔TdT-mediated dUTP nick end labeling法 实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法, 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染 色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形 态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、 培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测 定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般 的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋 亡的研究中已被广泛采用.
TUNEL原理
标 本 处 理
实 验 步 骤
实验流程
结果
注意事项
• 极少数细胞凋亡时没有DNA断裂或DNA裂解不完 全,此时不适用TUNEL法检测,进而产生假阴性结 果.
• 在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳 性.在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量 DNA片断,
• 从而引起假阳性结果.在需要严格判断细胞凋亡的 情况下,最好同时检测多个凋亡指标
TUNEL
TUNEL的原理 TUNEL的操作步骤 结果及注意事项
主要试剂
1. 缓冲液<Labeling Buffer>： 用于维持一定的反应条件,含有以下成分：
500mmol/L二甲胂酸钾、 pH7.2 10mmol/L CoCl2 <氯化钴>、 1mmol/L DTT<二硫苏糖醇>. 2.末端脱氧核糖核酸转移酶<TdT> ：
放映结 感谢各位的批评指导！
谢 谢！
让我们共同进步
TUNEL的原理是：用荧光素〔fluorescein标记的脱氧 核糖核苷酸,在TdT 的作用下连接到凋亡细胞中断 裂DNA的3’-OH末端,用荧光显微镜即可观察结果. 在此基础上连接辣根过氧化酶标记的荧光素抗体, 可进一步放大检测信号,并且普通显微镜观察实验 结果.由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色.
TUNEL法检测细胞凋亡
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。
基因组DNA断裂时，暴露的3・OH可以在末端脱氧核昔酸转移酶（Terminal DeoxynucleotidylTra nsfe「sse,TdT）的催化下加上荧光素（FITC）标记的dUTP（fluorescein-dUTP）?从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL法检测细胞凋亡的原理。
TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂（和细胞凋亡时的断裂方式不同）。
这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。
针对问题2 （TUNEL法的实验原理是什么？）:基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dUTP 进入细胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3'-0H结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP±的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙腓聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。
1 .TUNEL工作原理：简单说就是一TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。
其原理是；生物素（biotin）标记的dUTP在脫氧核糖核昔酸末端转移酶（TdT............................................... 最新资料推■»WBB W MBM* «W aMMM ■*■■»«W OMHV a^HBV MMM «■■■* W«MHMM W埜乂sy “=*=〜=”•* ”s=sEnzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3*-0H 末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin. HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-0H形成，很少能够被染色。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Tunel染色
操作流程及步骤：
实验准备：
1、固定溶液：4%的聚甲醛。
2、封闭溶液：3%H2O2的甲醇溶液，共计4ml。
其中30%H2O2 ：甲醇为1:9
即：400ul30%H2O2+3.6ml甲醇。
3、透化溶液：0.1g柠檬酸+100mlddH2O+100ulTriston[1]。
实验步骤：
1、磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次每次5min[2-3]。
2、固定溶液：4%的聚甲醛固定1h[3-5]。
3：PBS洗4次每次7min[3]。
以下步骤全部避光:
4、在15-25℃下与封闭溶液200ul孵育10min[3,6]。
5、PBS洗4次每次7min[3]。
6、透化溶液5min（4℃摇床）。
7、PBS洗4次每次7min[3]。
8、tunel溶液配制瓶1：瓶2=1:9（遮光），每孔加200mltunel混合物孵育
60min[3,7] 。
8、PBS洗4次每次7min[3]。
9、加DAPI 200ml 15min[3,8]
10、PBS洗4次每次7min[3]。
11、荧光显微镜拍片。
待学习…
心得体会及注意事项：
1、因柠檬酸量太少直接配制所需溶液量误差较大所以配制100ml体系。
2、洗去培养液。
3、加完液后放在摇床上。
4、每孔加200ul4%的聚甲醛。
5、为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行
固定。
6、封闭细胞内的氧化酶。
7、染凋亡细胞的DNA。
8、DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，能够与DNA
强力结合的荧光染料，用于荧光显微镜对比观测。
所有细胞DNA均可染色。
目的及原理
目的：检测细胞凋亡
原理：TUNLE染色即原位末端转移酶标记技术。
凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3′-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3′末端，从而进行凋亡细胞的检测。
TUNLE染色是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。