阿维菌素的生物合成研究进展与展望_陈芝

第17卷　第3期　2007年3月阿维菌素的生物合成研究进展与展望*陈　芝　宋　渊　文　莹　李季伦**中国农业大学生物学院微生物系,北京100094　2006-07-19收稿,2006-08-18收修改稿　*国家重点基础研究发展计划资助项目(批准号:2003CB114205)　**通信作者,E -mail :lijilu n @摘要 阿维链霉菌(S treptom yces avermitilis )由于可以产生杀虫抗生素———阿维菌素而备受研究者的青睐.多年来该菌得到了全面系统的研究,其基因组序列也已测定.文中综述了阿维链霉菌中阿维菌素生物合成代谢途径方面的研究,并对后续研究进行展望.关键词 阿维链霉菌　阿维菌素　次级代谢　生物合成　基因工程　组合生物合成1　阿维链霉菌及其基因组信息阿维菌素的产生菌———阿维链霉菌(S trepto -myces avermitilis )是1975年日本北里研究所从日本静岗县的一个土壤样品中分离得到的.阿维链霉菌自发现以来,以日本北里大学和北里研究所以及美国Merk 公司为主的研究小组分别对它开展了深入研究,形成了一个重要的抗生素研究领域.与其他链霉菌一样,阿维链霉菌不仅具有复杂的形态分化,也具有合成多种次级代谢产物的能力,由它产生的阿维菌素在医药、农业及畜牧业上有着重要的商业价值.目前对阿维链霉菌的研究主要集中在阿维菌素的生物合成领域[1—5].链霉菌中天蓝色链霉菌(S treptomy ces coelicol -or )A3(2)[6]、阿维链霉菌MA -4680[7]和S trepto -myces div ersa 的基因组序列已被测定,此外还有一些链霉菌(S.noursei ,S.ambo faciens ,S.peucetius 和S.scabies )的基因组正在测定中(http ://w w w.geno mesonline.o rg /search.cgi ).对它们的基因组序列的比较将为这些微生物的研究提供有价值的信息.阿维链霉菌的线状染色体大小为9025608bp ,G +C 含量为70.7%,至少包含7577个开放阅读框(ORF ),编码区占基因组的86.2%.O RF 平均大小为1034bp.阿维链霉菌还含有一个线性质粒SAP1,大小为94287bp ,G +C 含量为69.2%,含有96个O RF ,编码区占质粒的79.0%.在阿维链霉菌的基因组中,大多数必需基因都位于一个高度保守的6.5M b 的内部区域.染色体上靠近端粒的位置有两个保守性低的亚端粒区(subtelome ric re -gio ns ).有趣的是,50%以上的与次级代谢合成有关的基因(包括阿维菌素的生物合成基因)都位于亚端粒区,而在亚端粒区没有发现已知的必需基因.此外,亚端粒区含有基因组中大部分的转座因子[7].这些基因位于亚端粒区可能与阿维链霉菌的遗传不稳定性有关,在对阿维链霉菌培养过程中我们经常得到一些形态分化的突变株(光秃型突变株和白色突变株等),有些突变株同时丧失了合成阿维菌素的能力.在阿维链霉菌的线状染色体上有30个基因簇与次级代谢合成有关,共有271个基因,占基因组的6.6%.它们广泛地分布于染色体上,但有一半位于染色体的末端.在质粒SA P1上没有发现与次级代谢有关的基因簇[7,8].在30个与次级代谢有关的基因簇中,有4个与黑色素的合成有关,其中两个负责酪氨酸酶及其辅酶的合成,另外两个分别与由尿黑酸生成的赭色色素和聚酮结构的黑色素的合成有关;合成类胡萝卜素和铁载体的基因簇分别由7个和5个基因组成;此外,有8个基因簇与非核290糖体肽类化合物的合成有关,还有4个基因簇与萜类化合物的合成有关.在30个次级代谢的基因簇中,有9个基因簇含有Ⅰ型PKS基因(polyketide sy nthase),2个基因簇含有Ⅱ型PKS基因.目前已有3个Ⅰ型PKS合成的化合物被鉴定,它们分别是阿维菌素、寡霉素以及菲律宾菌素(filipin)的衍生物—pentaene[8].阿维链霉菌和其他链霉菌的基因组计划必将极大地推动对链霉菌形态分化和次级代谢的研究,最终揭示链霉菌复杂的调控网络.2　阿维菌素的生物合成基因簇阿维菌素是由阿维链霉菌产生的一组结构相似的十六元环大环内酯类抗生素.阿维菌素的天然发酵产物共有8个组分:A1a,A1b,A2a,A2b,B1a, B1b,B2a和B2b,它们的区别主要在于C-5,C-22, 23和C-26位所连接的基团不同(图1).Cane等通过在阿维菌素合成过程中掺入相应的13C标记的化合物,表明阿维菌素的大环内酯是由7个乙酸盐, 5个丙酸盐和1个带有支链的脂肪酸首尾聚合而成[9].“a”组分的2-甲基丁酰基(C25-C28)和“b”组分的异丁酰基(C25-C27)分别由L-异亮氨酸和L-缬氨酸衍生而成[10].齐墩果糖由葡萄糖直接转化而来[11].阿维菌素中C-5,C-3′和C-3″位上的甲氧基均来自L-甲硫氨酸.图1　阿维菌素及伊维菌素结构图 Ikeda等利用标记底物结合分析突变株累积中间产物的策略,已基本阐明阿维菌素生物合成的全过程[1],并对阿维菌素合成的全基因簇序列进行了功能分析[2].该基因簇全长82kb,共有18个开放阅读框(图2).基因簇内部的60kb片段含有4个大的阅读框(ave A1-aveA2)和(aveA3-av eA4),共同编码多功能的PKS,该聚酮合酶由12个模块组成,共有55个活性位点,负责1个支链脂肪酸、7个乙酸盐和5个丙酸盐的聚合反应.每个合酶单位(S U)都由缩合酶(KS)-酰基转移酶(A T)-酰基载体蛋白(ACP)组成,有些SU还含有酮基还原酶(KR)和脱水酶(DH)活性位点.每个SU负责一步掺入前体如乙酸或丙酸的聚合反应及β-酮基的还原程度,最后所形成的聚酮体在位于PKS末端的硫酯酶(T E)的作用下成环内酯化.aveC和aveE基因位于aveA1-aveA2和aveA3-ave A4基因之间,与聚酮体的修饰291　第17卷　第3期　2007年3月有关[12];在基因簇的右侧邻近av eA 4基因的上游,是一套涉及合成和转移齐墩果二糖的8个基因(av eB I —aveB VI I I );紧邻aveA 1的上游(左方)是编码C5-O -甲基转移酶的aveD 基因,该基因负责将甲基转给阿维菌素B 的C -5位的-OH 从而形成阿维菌素A.aveF 紧邻aveD 的下游,两者转录方向一致,可能属于同一转录单位[1].aveF 编码C5-酮基还原酶,催化C -5位的酮基还原成羟基.aveR 位于aveF 的下游(但转录方向相反),它可能是阿维菌素生物合成全基因簇的正调控基因[2].aveR 突变株不能合成任何阿维菌素,也不能转化阿维菌素糖苷配基,对该基因序列分析表明具有H -T -H 结构,但是aveR 如何调控阿维菌素生物合成有待于进一步研究.图2　阿维菌素生物合成基因簇[2]3　阿维链霉菌的基因工程改造阿维菌素的生物合成途径已基本阐明,相关合成基因已被克隆和测序,阿维链霉菌的基因组序列也已清楚.这为利用基因工程手段改造阿维菌素生物合成基因簇从而对发酵产物进行有效的控制,以及合成新的阿维菌素衍生物及提高阿维菌素的产量提供了可能.目前对阿维链霉菌中代谢途径的改造主要集中在以下几个方面.3.1　菌株高产性能的提高阿维菌素是重要的杀虫抗生素,提高阿维菌素的产量具有重要的意义.在链霉菌中,次级代谢产物的生物合成是一个复杂的过程,受到不同水平的调控[13].抗生素的生物合成除受途径专一调节基因(pa thw ay -specific reg ula to ry gene )控制之外[14],还受多效调控基因(pleio tro pic regulatory genes )的控制,如aba A ,abaB ,af sQ 1和a f sQ2等[15],其次还受到其他调控因子,如ppGpp ,A 因子和磷酸盐等的调控[16—18].Lee 等利用Southe rn 杂交在阿维链霉菌中检测到了与S.lividans 中a f sR2基因的同源基因,将多拷贝的a f sR 2基因分别转入阿维链霉菌野生型菌株和高产菌株中,阿维菌素的生物合成分别提高了2.3倍和1.5倍[19].H w ang 等曾直接将一段包含编码膜蛋白or f X 的克隆片段(8.10kb )转入野生型阿维链霉菌,刺激了阿维菌素的生物合成,可使阿维菌素的合成提高近3.5倍[20].对位于aveR 基因上游的av eR1,aveR 2基因进行全部或部分缺失,可使阿维菌素的产量提高3倍多[21].王晓芳等[22]对阿维链霉菌野生型菌株和高产菌株中aveR1,aveR2基因分别进行基因缺失,野生型菌株阿维菌素的合成提高了3倍多,但高产菌株产量基本没有提高,可能是高产菌株经历了多次的诱变,其调节基因可能发生了改变.这些结果表明虽然常规诱变育种是菌种选育的有效手段,但是利用基因工程手段也有可能进一步提高菌株的生产能力.Xiong 等利用PCR 介导的基因中断技术对bkdF 基因进行阻断,获得的突变株不再合成阿维菌素,只产生寡霉素,而且寡霉素的产量由原来的0.1mg /m L 提高到2.3mg /mL [23].这可能是由于阿维菌素和寡霉素都具有聚酮体结构,拥有共同的底物,阿维菌素合成被阻断导致了代谢流流向了寡霉素的合成.292　第17卷　第3期　2007年3月3.2　菌株发酵性能的提高阿维菌素的发酵是一个好氧的生物过程,一般对氧的需求比较敏感.由于氧在水中的低溶解性,在大规模深层发酵中,溶氧常成限制因素.文莹等通过将透明颤菌血红蛋白(VH b)基因置于硫链丝菌素诱导的启动子PtipA之下,转入阿维链霉菌,经摇瓶实验证实,表达的V H b蛋白在氧限条件下会明显促进阿维链霉菌的生长和阿维菌素的合成,而且在发酵液中溶氧状况越差,V Hb蛋白的效果越显著[24].3.3　无效组分及有毒产物合成的阻断Ikeda小组阐明了阿维菌素的生物合成途径,在明确阿维菌素生物合成途径的基础上,结合传统诱变构建了一系列仅产有效组分的基因工程菌株.经传统诱变获得了仅产4个“B”组分的突变株K2034(aveD)和仅产4个“a”组分的突变株K2021 (X)[10],前者是aveD基因(负责编码将B组分转化为A组分的C5-O-甲基转移酶)发生了突变,使得菌株只能累积B组分[25];后者是X基因发生了突变.目前X基因尚未得到克隆,但不位于阿维菌素生物合成基因簇中,此基因的突变导致突变株只能合成仅产“a”组分的阿维菌素,推测这个基因可能为支链氨基酸脱氢酶.对这两株突变株进行原生质体融合,得到了仅产B1a和B2a两个组分的重组菌株K2038(aveD X)[10].再对重组菌株K2038内的aveC基因进行点突变,得到仅产单一组分B2a 的基因工程菌K2099(aveD X aveC)[1].阿维链霉菌不仅产生阿维菌素,还产生寡霉素.寡霉素是哺乳动物氧化磷酸化的抑制剂,对哺乳动物有很高的毒性.Ikeda等用Tn4560对阿维链霉菌进行转座诱变得到不产寡霉素的突变株,利用转座子上的遗传标记将寡霉素的生物合成基因克隆到温敏质粒上,对上述所构建的有效组分的基因工程菌进行基因取代,得到不产寡霉素仅产阿维菌素有效组分的基因工程菌[1].我们实验室自20世纪90年代以来开展了对阿维菌素合成的研究,初期主要利用常规诱变手段提高阿维菌素产量,近年来也开展了对阿维链霉菌的基因工程改造.通过对aveD基因的插入失活,阻断了C5-O-甲基转移酶的合成,与aveD共转录的aveF的表达也被阻断,因此获得了直接合成C5-O-阿维菌素B的基因工程菌[26].C5-O-阿维菌素B可直接在C-5位进行肟基化合成具有更高杀虫活性的阿维菌素5-肟衍生物.此外,通过对aveD基因进行缺失突变,得到了仅产阿维菌素B组分的基因工程菌[27].在此基础上,张晓琳等通过同源双交换的方法将上述仅产阿维菌素B组分的基因工程菌染色体上长达90kb的寡霉素聚酮合酶基因簇(olm A)进行了缺失,得到不产寡霉素而仅产阿维菌素B组分的基因工程菌[28].3.4　组合生物合成阿维菌素的大环内酯结构属于聚酮体,由阿维菌素PKS(AVES)催化形成.阿维菌素B1和B2的区别在于C-22,23位不同,B1在C-22,23位是CH=CH,而B2在C-22,23位为C H2-CH OH.根据聚酮体合成反应步骤与其PKS基因结构之间的一一对应关系,阿维菌素C-22,23位的还原程度由AV ES1模块2上的还原酶域DH和KR(DH2-K R2)决定.KR2将C-23位的β-酮基还原成羟基后,在DH2的作用下脱水形成双键,最后的产物即为B1组分;如果DH不起作用,则最终形成的产物C-23位保持羟基即为B2组分,因此推测B1组分和B2组分的共存可能是由于DH2的不完全活性所造成.将阿维菌素PKS模块2上的不完全活性的DH用完全活性的DH取代,仍有B2组分的合成.伊维菌素是阿维菌素B1在C-22,23双氢还原物(图1),与阿维菌素B1相比,具有相同的杀虫活性,而毒性更低,因而被广泛应用于畜牧业上. Gaisser等用rapam ycin PKS中模块13上的DH-ER (enoyl reductase烯基还原酶)-K R取代野生型阿维链霉菌中阿维菌素PKS模块2上的DH-K R结构域,获得的重组菌株具有直接合成C-22,23双氢阿维菌素B1(即伊维菌素)和A1的能力,除产生以上组分外,该菌株同时还产生阿维菌素的8个组分[29].张晓琳以阿维链霉菌仅产B组分不产寡霉素的基因工程菌Olm73-12为出发菌株,将其阿维菌素PKS模块2上的DH和KR结构域用来自于pik-rom ycin PKS模块4中一套完整的DH-E R-KR所置换,得到不产寡霉素而产伊维菌素B1a的基因工程菌[30].293　第17卷　第3期　2007年3月3.5　阿维菌素衍生物的产生Doramectin是阿维菌素B1的cyclohexane-car-box ylic acid(CH C)前体异构物,与伊维菌素相比,生物半衰期更长,杀虫效果更好.Cropp等将S.collius中的CH C-CoA合成基因转入阿维链霉菌的阿维菌素的前体合成阻断突变株中,使得突变株获得了合成Doramectin的能力[31].该突变株发酵产生Do ram ectin的同时还产生无效的CH C-B2组分,aveC编码产物控制Do ramectin与C HC-B2的比例.Stutzm an-Engw all等通过定点诱变和易错PCR在aveC基因中引入随机突变,获得了几株C HC-B1比例提高的突变株,其中一株CHC-B1的比例提高了4倍[32].他们又通过DNA重排(DNA shuffling)技术对av eC进行突变,将重排后的aveC 突变文库转化到阿维链霉菌中,得到几个产Dor-amectin比例较高的转化菌株.对这些菌株中的aveC基因进行分析发现,最有效的突变aveC中有10个氨基酸发生了突变,所产C HC-B2∶CH C-B1的比例为0.07∶1,此比例与野生型菌株相比提高了23倍[33].甲胺基阿维菌素(emamectin benzoate,即M K-244)与阿维菌素相比具有更高的杀虫活性,在农业上得到广泛应用.在化学合成上,4″-氧-阿维菌素(4″-o xo-avermectin)是由阿维菌素合成甲胺基阿维菌素的中间体,由于阿维菌素两个羟基的存在,必须在氧化前后对于其进行保护,使得生产成本大大提高.来自杀结核链霉菌(S.tubercidicus)R-922的细胞色素P450单加氧酶Ema1能够选择性地催化阿维菌素形成4″-氧-阿维菌素[34].通过在阿维链霉菌中表达em a1,试图得到一步法合成4″-氧-阿维菌素的菌株.但只有生长初期的菌丝能够合成4″-氧-阿维菌素,处于稳定期的菌株则不能[35].而阿维菌素的合成主要在稳定期合成,这可能是所用启动子在稳定期时不易表达,而换成稳定期表达的启动子效果可能会好些.4　展望阿维链霉菌自发现以来已有30a的时间,对于它的研究主要集中在阿维菌素的生物合成领域.提高阿维菌素的产量、选择性地合成活性组分和产生有生物活性的阿维菌素衍生物及新代谢物一直是研究的热点.随着阿维链霉菌和其他链霉菌序列的测定,研究的重心将进一步拓展到次级代谢物产生的调控和形态分化调控方面,以揭示链霉菌复杂的调控网络.功能基因组研究还可以进一步了解链霉菌染色体复制及其稳定性,在提高工业菌株的遗传稳定性方面意义重大.阿维链霉菌中阿维菌素和寡霉素基因簇中聚酮生物合成编控的分子机理的阐明和阿维链霉菌基因组序列的完成将为利用组合生物合成改造阿维链霉菌,形成一系列非天然的天然性化合物提供可能,在药物创新方面将有可能取得一系列突破.就目前而言,组合生物合成面临的最大障碍就是改造后的PKS合成的新代谢物产量太低.大多数情况下,杂合PKS合成新化合物的产量仅是野生型菌株原来抗生素产量的1%—50%,甚至更低[36].目前也有一些提高产量的途径:如增加PKS拷贝数或使用强启动子可使产量提高;将结构类似的聚酮化合物的PKS单元进行组合,由于它们生物合成的中间体结构相似,来自不同PKS的模块和结构域在功能上可以彼此互补,从而使杂合PKS具有较高的活性;通过替换整个模块或蛋白亚单位而不是单个酶域可以使产量提高100倍以上[37].目前构建的可直接合成伊维菌素的基因工程菌由于产量太低而无法应用于工业生产.如能利用阿维菌素结构类似物M ilbemy-cins或M eling mycins(它们在大环内酯的C22,23位为CH2-CH2)的PKS基因对阿维菌素PKS的模块2进行整个置换有可能提高杂合PKS的活性,进而提高伊维菌素的产量.此外,虽然阿维菌素的生物合成途径已经基本阐明,但是阿维菌素的生物合成调控途径和一些关键步骤还不清楚,基因簇中aveR和aveC的基因功能还不确定.推测aveR基因可能是阿维菌素的调控基因,但是aveR基因如何调控阿维菌素的生物合成还不清楚,有待于进一步研究.阿维菌素合成过程中决定阿维菌素B1∶B2的比例的机制仍然不清楚.阿维菌素B1和B2组分的分化发生在阿维菌素的合成初期,但实验证实阿维菌素PKS模块2上的负责C22-23位脱水的脱水酶并不能决定B2∶B1的比例.目前的实验结果表明av eC可能决定阿维菌素B2∶B1的比例[1,32,33],但其机制仍然不清楚,如AveC是如何催化C22-23的脱水;是与阿维菌素294　第17卷　第3期　2007年3月PKS一起共同完成的,还是在阿维菌素糖苷配体形成之后等.由于阿维菌素B1具有最高的杀虫活性,如能仅发酵生产B1组分,将大大地简化生产和提取工艺,阿维菌素的生产成本也将降低.因此,研究阿维链霉菌中aveC基因的功能,阐明决定阿维菌素B2∶B1比例的机制,将为理性设计实验提高阿维菌素中有用组分B1的含量提供理论基础.参　考　文　献1　Ikeda H,m ura S.Con trol of avermectin biosyn th esis in S trep-tomyces avermitilis for the selective production of a useful com-ponent.J An tibiot,1995,48(7):549—5622　Ikeda H,Non omiy a T,Usami M,et aniz ation of the bio-sy nthetic gene clus ter for the polyk etide an th elmintic m acrolide averm ectin in S trep tomyces aver mitilis.Proc Natl Acad S ci USA,1999,96(17):9509—95143　Ikeda H,Nonomiya T,mura anization of 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