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溶菌酶的研究进展
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间 的 差 异 与 联 系 ， 了 解 生 物 间 的 遗 传 与 进 化 。 菌 酶 也 有 抑 来 溶 制 恶 性 组 织 生 长 的作 用 。 此 ， 菌 酶 对 机 体 免 疫 系统 作 用 及 因 溶
破 坏 。 和 动 物 细 胞 无 细 胞 壁 结 构 亦 无 肽 聚 糖 ， 溶 菌 酶 对 人 人 故
１ 溶 菌 酶 的分 型 及 理 化 特 性
１１ ． 溶 茵 酶 的 分 型
体 细 胞 无 毒 性 作 用 。 菌 酶 存 在 于 自 然 界 动 物 、 物 和 微 生 物 溶 植
溶 菌 酶 是 由 弗 莱 明 在 １２ ９ ２年 发 现 的『 它 是 一 种 有 效 的 ｌ １ 。 抗 菌 剂 ， 称 为 １ …３ Ｎ 溶 菌 酶 ， 称 粘 肽 Ｎ 乙 酰 基 胞 壁 酰 全 ， １ ４ 又 一 水 解 酶 。 它 能 切 断 肽 聚 糖 中 Ｎ一 酰 葡 萄 糖 胺 和 Ｎ 乙 酰 胞 壁 乙 一
在 的 使 用 价 值 。 由 于 来 源 有 限 ， 用 基 因 工 程 技 术 从 细 菌 或 酵 母 中 生 产 人 溶 菌 酶 实 现 产 业 化 ， 解 决 其 供 需 矛 盾 的 有 利 是
效 途径 。有 关溶 菌酶抗 菌功 能 以外 的其 它未知 生物 学作用 ， 是 当前研 究的 热点 。 也
ｍａ ｒ ｐ ａ ｅ ｃ ｌ ｎ ｏ ｐ ｃ ｌ ｒ ｔ ａ ｅ ｅ ｄ ｔ ｅ ｍｅ ｈ ｎ ｓ ｃ ｏ ｈ ｇ ｅｌ ａ ｄ ｎ ｎ－ ｅ ｕ ｉ ａ ｈ ｔ ｄ ｆ ｎ ｓ ｈ ｃ ａ ｉ ｍ． Ｈｕ ｎ ｌ ｓ ｚ ｍｅ ａ ｐ ｔ ｎ ｉ ｕ ｅ ａ ｕ ｏ ｃ ｉ ｉ ． ｍａ ｙ ｏ ｙ ｈ ｓ ｏ ｅ ｔ ｌ ａ ｓ ｖ ｅ ｎ ｌ ｃ ｌ ｎ Ｂｅ ａ ｓ ｓ ｕ ｃ ｌ ｔ ｄ ｃ ｕ ｅ ｏ ｒ ｅ ｉ ｅ ， ｕ ｉ ｚ ｅ ｅ ｎ ｉ ｅ ｒ ｇ ｐ ｏ ｕ ｅ ｆｏ ｍｉ ｔ ｉｅ ｇ ｎ ｅ ｇｎ ｅ ｎ ｒ ｄ ｃ ｒ ｍ ｂ ｃ ｅ ｕ ｌ ｉ ａ ｔ ｒ ｍ ｏ ｙ ａ ｔ ｆ ｒ ｅ ｉｅ ｎ ｕ ｔ ａｉ ａｉ ｎ ｉ ｒ ｅ ｓ ｏ ｒ ａ ｚ ｉ ｄ ｓｒｌ ｚ ｔ ， ｌ ｉ ｏ Ｉ ｓ ｔ ｉ
溶菌酶
溶菌酶溶菌酶溶菌酶( Lysozyme，E．C．3.2.17)，全称为1，4-p -N -溶菌酶，又称为细胞壁溶解酶，是自然界普遍存在的一种酶，因其能溶解细菌细胞壁具有溶菌作用而得名。
（一）溶菌酶的结构及物理化学性质溶菌酶易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚，是一种白色、无臭的结晶粉末。
相对分子质量为14.7ku，由129个氨基酸残基组成，碱性氨基酸残基及芳香族氨基酸如色氨酸残基的比例很高，含有4个二硫键，如图2 -24所示，其等电点为10~11。
在37℃条件下溶菌酶的生物学活性可保持6h，当温度较低时保持时间更长，利于溶菌酶在体内发挥作用。
禽蛋蛋清是溶菌酶的重要来源，蛋清溶菌酶的物理化学性质如表17 -1所示。
溶菌酶由两个区域组成，由一个长的α螺旋所联接，其二级结构大多是α螺旋。
N末端的区域( f40~80)由一些螺旋线组成，大多数是反平行的β折叠。
第二个区域由fl~39和f89~129氨基酸残基组成。
分子中的这两个区域被一个螺旋体（f87天冬氨酸- 114精氨酸）所分离，分子组成了内部疏水外部亲水的基本结构，对溶菌酶发挥抗菌功能起着巨大的作用。
表17 -1 蛋清溶菌酶的物理化学特性特性数值相对分子质量14 400亚基数 1氨基酸129等电点10.7二硫键数 4碳水化合物所占比例0E1%280nm 26.493℃时的D热值（每分钟破坏90%的活性）110酶活力的实验通过浑浊溶壁微球菌的细胞溶解（二）溶菌酶的来源溶菌酶在自然界中普遍存在，在人和许多哺乳动物的组织和分泌液中，均发现有溶菌酶存在，其物化性质基本相似，溶菌酶的来源如表17 -2所示。
溶菌酶主要分布于禽蛋和鸟类蛋清中，尤其是浓厚蛋白的系带膜状层中。
禽蛋中异常丰富，占整个蛋清中的 3.5%，鸡蛋蛋清是溶菌酶的主要商业来源。
表17 -2溶菌酶的来源溶菌酶的来源溶菌酶的含量鸡蛋清 2 500 ~ 3 500μg/mL鸭蛋清 1 000 ~ 1 300μg/mL鹅蛋清500 ~ 700μg/mL眼泪 3 000 ~5 000μg/mL人乳55~ 75 μg/mL牛奶10~ 15μg/mL脾脏50 ~ 160μg/kg胸腺60~ 80μg/kg胰腺20~ 35μg/kg花椰菜汁25~ 28μg/mL木瓜汁8~ 9μg/mL卷心菜汁7~8μg/mL（三）溶菌酶的溶菌机制溶菌酶是一种糖苷水解酶，专门作用于微生物细胞壁，可以破坏组成微生物细胞壁的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4-糖苷键，其作用机理见图17 -1。
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医学检验·各论：溶菌酶 >>>
简介：
溶菌酶为正常机体免疫防御机制的组 成部分,具有溶解细菌细胞壁的作用。在 人体内，它存在于中性粒细胞、单核细胞 和巨噬细胞内；也存在于黏膜分泌液中， 成为体表防御因素之一。正常人尿中无溶 菌酶。某些疾病患者血清或体液内的溶菌 酶活性值有显著差别，故测定溶菌酶活性 日益受到临床重视。常用的方法有琼脂平 板法、比浊法。
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临床意义：
发生。 细菌性脑膜炎患者脑脊液(CSF)溶 菌酶含量远较病毒性脑膜炎患者的含量高。 因此，用溶菌酶测定对二者的鉴别有重要 意义。此外。CSF溶菌酶测定对中枢神经 系统的原发性或继发性肿瘤有一定辅助诊 断价值。 慢性支气管炎患者痰液中溶菌 酶含量降低;重症肺结核、泌尿系统感染 患者血清或尿液中溶
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临床意义：
菌酶活性均可显著升高。此外，溶菌酶含 量测定亦可作为判断局限性肠炎活评价。
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正常值：
血清：5～30mg/L(琼脂平板 法);9.6～14mg/L(比浊测定法)。脑脊液： 0mg/L(琼脂平板法)。唾液：30～ 70mg/L(比浊测定法)。尿液：0mg/L(琼脂 平板法);1～3mg/L(比浊测定法)。 由于 方法与实验条件不同，测定结果有所差别， 故各实验室应建立自己的正常值标准。
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临床意义：
血清溶菌酶测定对鉴别各型急性白血 病有一定意义，急粒与急单血清溶菌酶升 高;而急淋、急性红白血病降低或正常;经 化疗奏效病情缓解后，溶菌酶水平可恢复。 血清溶菌酶测定可作为判断局限性肠炎活 动性的一个有用的指标，并且有助于判断 临床过程的严重程度和对治疗的反应。 尿液溶菌酶含量增高的原因
溶菌酶
内容1：溶菌酶简介1.1 溶菌酶溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，EC3.2.1.17）又称为胞壁质酶，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。
溶菌酶是由129个氨基酸构成的单纯碱性球蛋白，化学性质非常稳定。
溶菌酶存在在自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类、家禽的蛋清和哺乳动物的眼泪、唾液、血液、鼻涕、尿液、乳汁和组织细胞中(如肝、肾、淋巴组织、肠道等)。
从木瓜、芜青、大麦、无花果和卷心菜、萝卜等植物中也能分离出溶菌酶，其中以蛋清含量最高。
溶菌酶生理作用在生物体内溶菌酶具有抗菌消炎，抗病毒，增强机体免疫力的生理功能，还可激活血小板，改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，具有止血、消肿等作用。
它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用2：溶菌酶的种类溶菌酶的研究最早是从尼科尔(Nicoile)1907年发表枯草杆菌溶解因子的报告开始的。
两年后，Laschtschenko指出：鸡卵白强烈抑菌作用是酶作用的结果。
1922年英国细菌学家弗莱明(Fleming)发现人的唾液、眼泪中存在这种能溶解细菌细胞壁的酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。
1937年由Abraham与Robinson从卵蛋白中最先分离出晶体溶菌酶，此后人们在人和动物的多种组织、分泌液及某些植物、微生物中也发现了溶菌酶的存在。
根据来源不同，将溶菌酶分为三类（1）动物源溶菌酶⏹动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶。
⏹鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应用最多的，在鸡蛋清中约含有3.5%左右的酶，分子量为14000，其等电点在pH10.8左右，最适效应温度在50℃，化学性质稳定，pH在1.2～11.3之间改变时对酶结构影响很小，pH在4～7范围内100℃处理1min仍有近100%的活力，在210℃条件下加热1.5h仍具有活性。
鸡蛋清溶菌酶在碱性环境条件下稳定性较差，分解G+细菌，但对G-细菌不起作用。
研究表明其它鸟类蛋清溶菌酶也是由129个氨基酸残基组成，但其排列顺序和鸡蛋清溶菌酶不同，并且活性部位也不相同。
我国溶菌酶的研究与应用进展
我国溶菌酶的研究与应用进展一、本文概述溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的水解酶，具有溶解细菌细胞壁的能力，因此在生物防御和医药领域具有重要的应用价值。
我国作为世界上人口最多的国家，对于溶菌酶的研究与应用具有深远的实际意义。
本文旨在综述我国溶菌酶的研究现状、应用领域以及未来的发展趋势，以期为推动溶菌酶在我国生物医药、食品工业、农业等领域的应用提供理论支持和指导。
在过去的几十年里，我国溶菌酶的研究取得了显著进展。
从最初的基础研究，到如今的产业化应用，溶菌酶在我国已经成为一种重要的生物活性物质。
本文将从溶菌酶的来源、性质、制备方法、应用领域等方面进行全面概述，并对我国溶菌酶研究的未来发展进行展望。
本文还将关注溶菌酶在应对抗生素滥用和耐药性问题中的潜力，以期为我国生物医药产业的可持续发展提供新的思路和方法。
二、溶菌酶的结构与性质溶菌酶是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶广泛存在于动物、植物、微生物体内，不同来源的溶菌酶其分子结构具有一定差异，但基本性质相似。
溶菌酶分子量较小，通常约为14-15KD，是一种碱性蛋白质。
其等电点通常在pH值5-0之间，因此，在酸性环境中溶菌酶分子带正电荷，可与带负电荷的微生物细胞壁发生静电吸附。
溶菌酶具有较高的热稳定性，能在50℃左右保持较长时间的活性，但其活性受pH值影响较大，通常在pH值3-4范围内活性最高。
溶菌酶对多种化学试剂表现出较强的稳定性，如氯化钠、氯化钙等盐类以及乙醇、丙酮等有机溶剂对其活性影响较小。
溶菌酶的作用机制主要是通过其催化活性水解细菌细胞壁中的多糖成分，导致细胞壁破裂，从而使细菌失去生存能力。
溶菌酶还具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎等多种生物活性，因此在医药、食品、饲料等领域具有广泛的应用前景。
在医药领域，溶菌酶可作为抗菌药物使用，对多种革兰氏阳性菌和阴性菌具有抑制作用，尤其对耐药性金黄色葡萄球菌和链球菌具有较强的杀菌作用。
溶菌酶
2002 2001 2000
溶菌酶的发现及发展
弗莱明一度认为这种新克隆是来自他鼻腔 粘液中的新球菌，还开玩笑的取名为A.F 1 球菌。而他的同事Allison，则认为更可能是 空气中的细菌污染所致。很快他们就发现， 这所谓的新克隆根本不是一种什么新的细菌 ，而是由于细菌溶化所致。 1921年11月21 日，弗莱明通过进一步研究发现，鼻腔粘 液中含有“抗菌素”。随后他们更发现，几乎 2002 2001 所有体液和分泌物中都含有“抗菌素”，甚至 2000 指甲中，但通常汗水和尿液中没有。
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溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶 菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂。现已广泛应用于水产 品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添 入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存， 同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。 溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性 免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤 的功效，目前医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻 炎等。 溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理G+细 菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细 胞融合操作必不可少的工具酶。
溶菌酶的应用
医学应用
溶菌酶可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗 病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢 性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。 也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。口服和肌注均有效。
溶菌酶的应用
食品应用
可作为防腐剂，它的主要功用是水解细菌细胞壁，在细胞内，则对 吞噬后的病原菌起破坏作用.该酶对革兰氏阳性菌中的枯草杆菌、耐 辐射微球菌有分解作用。对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血性弧菌 等革兰氏阴性菌也有一定程度溶解作用，其最有效浓度为0.05%。与 植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等配合使用，可提高其防腐效果。
溶菌酶
离子交换法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间所生的交换反应来进行分离的，分离的效果较好，广泛用 于微量组分的富集。一般流程为：鲜蛋一预处理一搅拌吸附一上柱洗脱一等电点沉淀一透析一喷雾干燥一成 品。
溶菌酶在等电点以下较广泛的pH值范围内，分子带正电荷，可吸附于弱酸性阳离子交换树脂上，洗脱后盐析， 可得溶菌酶沉淀，再进行精制可得成品。蛋清吸附724树脂，洗涤缓冲液洗脱，硫酸铵溶液盐析透析，用NaOH去 碱性蛋白，冻干溶菌酶，冻干粉沉淀干燥得到溶菌酶。在5—10℃下，将新鲜蛋清540kg加入到已处理好的80kg 724树脂中，搅拌吸附6h，在0—5℃静置过夜。倾出上层蛋清，树脂离心甩干，用蒸馏水反复洗去黏附的卵蛋白， 然后将树脂装入柱内，用0.15mol/L、pH=6.5磷酸缓冲溶液约150L洗涤树脂，再用约600L的10%硫酸铵溶液洗脱， 收集洗脱液。洗脱液中加硫酸铵，使最终含硫酸铵量为40%，有白色沉淀生成，冷处放置过夜。虹吸上层清液， 沉淀吸滤抽干，再用1倍蒸馏水溶解沉淀呈稀糊状，然后装入透析袋，在约5℃的条件下，对蒸馏水透析24h左右， 中间换水2—3次。离心去除沉淀，沉淀再用少量水洗一次，洗液与离心液合并。再往透析清液中慢慢加入1mol/L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH值上升到8.0—9.0，如有白色沉淀，即离心除去。然后用3mol/L盐酸调 pH=5.0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。也可将离心液用3mol/L盐酸调pH=3.5，在搅拌下缓慢加入5%的固体 氯化钠，在约5℃的温度下静置48h，离心，沉淀用0℃丙酮洗涤，干燥，即得溶菌酶。
聚丙烯酸沉淀法为将提取过滤后含酶洗脱液，首先经过吸附步骤，即将过滤后的澄清溶液用20%的NaOH溶液 调pH至6.0，在调pH值的过程中不停的搅拌。有少量的乳白色沉淀析出，然后加入15%聚丙烯酸，立即有白色沉淀 析出，加至pH值为3.0为止，静置17个小时进行静析，得到粘附于底部的乳白色胶状物。第二步解离，将前步得 到的溶菌酶聚丙烯酸凝聚物。加入少量蒸馏水并用0.5 mol/L的碳酸钠，将其溶解，转移后，将pH值调到9.5。加 入5%CaCl2溶液将溶菌酶聚丙烯酸解离，至无沉淀析出，然后过滤，得到澄清溶液。第三步盐析，将所得澄清溶 液加入5%的NaCI溶液搅拌均匀。放入冰箱调温度为0℃。待有晶体析出后，用无水乙醇洗涤数次，置恒温培养箱 中40℃条件下干燥称重。
溶菌酶
1937年从卵蛋白中最先分离出晶体溶
菌酶，此后人们在人和动物的多种组 织、分泌液、某些植物、微生物中发 现了溶菌酶。 根据来源不同，溶菌酶分为三类：
动物源、植物源、微生物源溶菌酶
5.2.2.1 动物源溶菌酶
包括： 鸡蛋清溶菌酶， 人和哺乳动物溶菌酶。
鸡蛋清溶菌酶（研究和应用最多）
鸡蛋清中约含3.5%酶，分子量14000，等电点 在pH10.8，最适溶菌温度50℃。 化学性质稳定： pH 1.2 ～ 11.3 改 变 时 对 酶 结 构 影 响 很 小 ， pH4 ～ 7 内 100℃ 处 理 1min 有 近 100% 活 力 ， 210℃条件下加热1.5h仍有活性 鸡蛋清溶菌酶：在碱性条件下稳定性较差， 分解G+细菌，对G-细菌不起作用
在生物体内溶菌酶具有：抗菌消炎，抗 病毒，增强机体免疫力的生理功能。
激活血小板，改善组织局部血液循环障 碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，具 有止血、消肿等作用。 作为宿主抵抗因子，对组织局部起保护 作用。
5.2溶菌酶来源及种类
5.2.1 溶菌酶的来源
存在于： 鸟类、家禽的蛋清； 哺乳动物的眼泪、唾液、血液、乳汁和组织 细胞中(肝、肾、淋巴组织、肠道)；. 木瓜、大麦、无花果、卷心菜、萝卜中能分 离出溶菌酶。 其中以蛋清含量最高。
在高盐浓度时溶菌酶的活性受到抑制，阳离
子的价态越高则其抑制作用越强。
5.3.1.4 加工过程对溶菌酶活性的影响 在冷冻干燥的模拟体系中溶菌酶有聚合、生
物活性损失和其它化学变化。
溶菌酶和过氧亚油酸的反应生成了二聚合高 聚体；多聚是因为随水活性增加共价键交联
度、蛋白质不溶性和酶活性损失增加引起的。
首先在植物中发现。可对抗侵入植物体的真 菌病原体，后来在链霉菌属、杆菌和大多数 真菌也发现该酶。