离心技术在高中生物学实验中的应用

离心技术在高中生物学实验中的应用陶杨娟（浙江省绍兴县柯桥中学312030）

离心技术是现代生物学技术中常用的一种方法，用于细胞、血清、蛋白质、核酸及细胞亚显微结构的分离、提纯或浓缩等，尤其是超速冷冻离心法已经成为各大分子生物学实验室研究人员最常用的技术方法。根据离心原理的不同，常见离心法为差速离心法、密度梯度区带离心法。

1离心技术简介

1．1差速离心法差速离心法常用于分离细胞匀浆中的各种细胞器。其工作原理是利用不同物质沉降速率的差异，在不同离心速度产生的不同离心力下，选择合适的离心时间分离和收集不同颗粒。一般先将细胞（组织）打碎，然后在低温下离心，随着离心速度的增加，越来越小的颗粒就会沉淀下来。如在800r/min （转/min）离心10min，得到的沉淀中主要含有细胞核和细胞碎片；在20000r/min下离心15min，得到的是质膜和细胞内膜；在150000r/min离心3h，得到的是核糖体，此时留在上面的上清液则是细胞溶胶。细胞溶胶中含有丰富的蛋白质，包括许多种酶。通过差速离心法，可以制备大量的各种细胞器，以满足研究所需。1．2密度梯度区带离心法密度梯度区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中的某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。实验离心前，离心管内先装入梯度介质（如蔗糖、甘油、氯化铯溶液等），形成连续的或不连续的密度梯度介质，然后加入样品进行离心。密度梯度在离心管内的分布是管底密度最大，向上逐渐减小。当样品中的颗粒分子在具有密度梯度的介质中离心时，到达与自身密度相等的介质梯度时，即停止不前，最后各种组分在离心管（常用塑料的）中被分离成各自独立的区带。可以在离心管底刺一小孔逐滴将分成区带的各组分收集，并对各个组分进行小样分析以确定区带位置。

根据被分离颗粒的性质，密度梯度区带离心法分为2种，差速区带离心法和等密度区带离心法。前者的原理是待分离的颗粒存在沉降速度差，在一定离心力作用下，不同颗粒在密度梯度介质的不同区域会形成区带，常用的梯度介质一般为蔗糖、甘油、聚蔗糖等，该法可用于分离蛋白质、病毒粒子等；后者的原理是待分离的颗粒存在一定的浮力密度差（浮力密度差即为物质的质量减去在一定介质中所受的浮力），离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的介质区域中停留并形成区带，常用的梯度介质为氯化铯，可用于分离核酸、病毒粒子等。

2离心技术在高中生物学教材中的应用

离心技术主要用于细胞、大分子或高分子有机物等的分离，也可作定性检测，如离心技术与其他分离技术（如电泳技术）结合，可用于蛋白质的定性或定量分析。高中生物学教材中有几处涉及离心技术，如分离细胞匀浆中的各种细胞成分；艾弗里的离体细菌的转化实验中，将S型菌的DNA、蛋白质和荚膜分离开，需要用离心的方法；噬菌体侵染细菌的实验和研究DNA 的半保留复制机制实验都将同位素示踪法与离心技术相结合进行研究，等等。

例1（从细胞匀浆中分离细胞器，研究其生理功能）有研究者将下列4种等量的细胞分别磨碎，然后放到4支离心试管内高速旋转离心，结果磨碎的液体分为4层，其中第三层存在的结构是有氧呼吸的主要场所。在下列各种材料中，

第三层最厚的是

图1

A．衰老的皮肤细胞B．口腔上皮细胞

C．心肌细胞D．脂肪细胞

解析经离心后第三层的结构是有氧呼吸的主要场所，可知该层中的结构为线粒体，而选项C中的心肌细胞需要的能量较多，具有的线粒体也多，故最厚。答案选C。

例2（从细胞中分离酶，研究其催化机理）科学家发现C

4

植物合成淀粉的部位是维管束鞘细胞，叶肉细胞中不能合成淀粉的原因是缺少暗反应所需要的三羧

酸酶系。根据C

4

植物不完整的实验图解分析回答：（1）①处理的方法是；分别用吸管等量从A、B中分别吸取少量的溶液加入标号为1、2的两支试管中，再分别滴入一滴碘液，两支试管中的现象是，不能在A、B中直接加入碘液，每次取少量溶液多次进行实验的做法遵循了实验设计原则中的。

图2

（2）为证明上述科学家的结论：叶肉细胞中因缺少酶系而不能合成淀粉，请根据材料设计实验：A液、B 液、酶系稀释液、清水、碘液一瓶、试管两支、吸管一支、移液管两支（1mL）。①；②；③。结果：试管3中不变蓝，试管4变蓝解析（1）由于植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，故去除细胞壁得到原生质体的方法是加入纤维素酶或果胶酶，使原生质体破碎得到细胞匀浆，通过离心分离得到叶绿体，再将叶绿体破碎，离心分离得到叶绿体基质，根据题意，叶肉细胞的叶绿体基质中缺少暗反应所需要的三羧酸酶系，故在其他条件都满足的情况下，不能进行暗反应合成淀粉，试管1的溶液中加碘液后不变蓝，而试管2中有淀粉合成，遇碘变蓝色；（2）本实验要验证叶肉细胞中因缺少酶系而不能合成淀粉，实验的自变量为是否有酶系，因变量为是否有淀粉生成，观测指标看试管是否变蓝色。明确这几个变量，再结合题意，实验步骤和结果不难得出。答案（1）加入纤维素酶等溶解试管1中不变蓝，试管2中变蓝平行重复原则（2）①分别用同一支移液管取等量的A溶液放入标号为3、4的两支试管中②用另一支移液管分别取等量的清水、酶系稀释液放入标号3、4的两支试管中，然后再加入ATP、NADPH并放置在含有高浓度二氧化碳的环境中③一段时间后，用吸管吸取碘液，向标号为3、4的两支试管中各滴入两滴并观察现象

例3（与同位素标记相结合，证明生物学原理）科学家用分别被32P或35S标记的T

2

噬菌体去感染未被标记的细菌，经保温、搅拌、离心后，发现用35S标记的一组实验，主要在上清液中检测到了放射性同位素，而用32P标记的一组实验，却主要在沉淀物中检测到了放射性同位素。这一实验结果表明

A．DNA是主要遗传物质

B．蛋白质是遗传物质

C．DNA是遗传物质，蛋白质不是遗传物质

D．进入细菌的主要是噬菌体的DNA，噬菌体的蛋白质主要在细菌的外面

解析噬菌体侵染细胞的实验中，经侵染、保温、搅拌、离心后，得到的上清中主要含有噬菌体蛋白质外壳，沉淀中含有被感染但未裂解的宿主菌，理论上讲，如用35S标记亲代噬菌体的蛋白质外壳，则上清中含有放射性，沉淀中无放射性；如用32P标记亲代噬菌体的DNA，则沉淀中含有放射性，上清中没有放射性。由于这个实验中蛋白质并没有进入细菌内，故不能证明蛋白质是否为遗传物质。

答案D。

例4（2010年北京理综）科学家以大肠杆菌为实验对象，运用同位素示踪技术及密度梯度离心方法进行了DNA复制方式的探索实验，实验内容及结果见下表。请分析并回答：

组别1组2组3组4组

培养液中唯一氮源14NH

4

Cl15NH

4

Cl14NH

4

Cl14NH

4

Cl

繁殖代数多代多代一代两代

培养产物A B B的子Ⅰ代B的子Ⅱ代操作提取DNA并离心

离心结果仅为轻带

（14N/14N）

仅为重带

（15N/15N）

仅为中带

（15N/14N）

1/2轻带

（14N/14N）

1/2中带

（15N/14N）

（1）要得到DNA中的N全部被放射性标记的大肠杆菌B，必须经过代培养，且培养液中的是唯一氮源。

（2）综合分析本实验的DNA离心结果，第

组结果对得到结论起到了关键作用，但需把它与第

组和第组的结果进行比较，才能说明DNA分子的复制方式是。

（3）分析讨论：①若子Ⅰ代DNA的离心结果为“轻”和“重”两条密度带，则“重带”DNA来自于

代，据此可判断DNA分子的复制方式不是复