本科生六个基本生物学实验

实验一：感受态细胞的制备

1.原理：

当实验室获得了一个新的质粒时，而这个质粒并未转化到宿主菌体内，则需要该技术进行细菌的转化，以大量获得这一质粒。转化细菌的方式有很多种，如电转化法、脂质体转染法、显微注射法、CaCl2处理法制备感受态细胞等。一般的实验室都应用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可在抗菌素培养基上生长形成菌落。这一方法是分子生物学常用实验方法。

2.实验材料

2.1LB液体培养基

2.20.1mol/L CaCl2溶液：称取1.1g无水CaCl2，溶于90ml双蒸去离子水中，

定容至100ml，用0.22μm滤器过滤并装入灭菌试剂瓶中，4℃保存。

2.3 DH5α菌株，冰，牙签，无菌滤纸，50ml离心管，枪头（以上需灭菌）；

移液器，摇床，冷冻离心机，涡旋震荡器，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，普通冰箱，-70℃冰箱

3.操作方法

3.1从37℃培养12—16h的平板上，用无菌牙签挑取一个单菌落，转移到含有3ml LB培养基的试管内，37℃振摇过夜。次日取菌液1ml，接种到含有100ml LB培养基的500 ml烧瓶中，37℃剧烈振摇培养约2—3h（振摇速度为200—300r/min），待OD600值达到0.3—0.4时，将烧瓶取出立即置冰浴10—15min。

3.2自该步骤起皆需无菌操作。在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理过的、冰预冷的50 ml离心管中。

3.34℃离心，4000g×5min回收细胞。

3.4弃去培养液，将离心管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。

3.5加入冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液10ml重悬菌体，置冰浴30min。

3.64℃离心，4000g×5min,弃去上清液，倒置于滤纸1min。

3.7再加4ml用冰预冷的0.1mol CaCl2重悬菌体（重悬时操作要轻）。

3.8置4℃冰箱置12—24h，即可应用于转化。

思考题：

制备感受态细胞时加入CaCl2的作用是什么？

钙离子结合于细胞膜上，使细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，细胞膜的通透性发生变化，使外源DNA进入。

实验二质粒转化

1.原理当宿主菌接受CaCl

处理后，细胞膜通透性改变，感染细菌

2

的质粒很容易地透过细胞膜，在宿主菌酶系统的作用下，质粒大

量繁殖。通过进一步实验，可获得大量的质粒DNA，以供分子生

处理细菌。

物学实验所用。一般的实验室都应用CaCl

2

2. 实验材料

2.1，质粒GFP-SNAT2-pBK-CMVΔ（kan抗性）

2.2，LB固体培养基平板(kan抗性)，LB液体培养基

2.3，感受态细胞

2.4，1.5ml离心管，枪头，三角耙（以上物品需灭菌处理）；移液器，

冰，恒温水浴锅，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，-70℃冰箱

3. 操作方法

3.1无菌状态下取新鲜感受态50μl置于无菌的1.5ml离心管。

3.2每管加质粒50—100ng，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置

30min。

3.342℃热休克90s，不要摇动离心管。

3.4每管加无抗生素的普通LB培养基950μl，37℃(150—180r/min)摇

床，温和摇振45min。

3.5 用无菌弯头玻璃铺菌器（三角耙），将10μl菌液铺于含卡那青霉素

(Kan)的琼脂平板表面，37℃平放20min，然后倒置培养10—14h。

4.结果观察

计数全皿菌落数

5.写实验报告（详细描述转化菌落的生长情况）

6.思考题

请说明每一步骤的原理：冰上30分钟、42度热休克90秒、37度温和震荡45分钟等。

冰上30分钟：转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。

42度热休克90秒：42度短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随即出现许多间隙，促进细胞吸收DNA复合物。

37度温和震荡45分钟：促使在转化过程中获得新的表型得到表达

实验三质粒DNA的抽提和纯化

1.原理：

质粒为多数细菌和某些真核生物染色体的双链环状分子。一般情况下，质粒并不是它的宿主细胞所必需的，如细胞分裂时，分裂的子细胞中不含质粒，但子细胞仍能生长分裂。然而，许多质粒含有在特殊环境下所必需的抗生素抗性。尽管质粒的复制有赖于宿主细胞的酶系统进行，但质粒DNA是独立于宿主基因组以外的环状分子，对于碱的裂解具有较强的耐受性，因此，用碱裂解法可将质粒DNA与宿主的线性DNA分开。

2材料

2.1质粒DNA小抽试剂盒，乙醇

2.2含质粒的菌液（GFP-SNAT2-pBK-CMV⊿）

2.3 离心管，枪头（以上物品需灭菌）；移液器，离心机

3．步骤

见试剂盒说明书

实验四琼脂糖凝胶电泳

1.原理：

带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。各种生物大分子在一定的pH值条件下，可解离成带电荷的离子，在电场中向相反的电极移动。分子生物学领域中，琼脂糖和聚丙烯酰胺作为支持介质的凝胶电泳应用最多，它们是分离、鉴定和纯化DNA及RNA片段的主要方法。该方法操作简便、快速，可以分辨其它方法(如梯密度离心法)所无法分离的片段。直接嵌入荧光染料后，在紫外灯下可直接检出DNA片段所在的位置，如有必要，从凝胶中回收DNA片段，用于各种克隆操作。

琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶均可制成各种不同大小、形状和孔径的凝胶块，在不同的装置上进行电泳。琼脂糖比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率低，但其分离范围广，约200bp~50kb的DNA。琼脂糖凝胶电泳通常在水平装置上进行。聚丙烯酰胺分离小片段(5~500bp)的效果较好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。长度大于10 000kb的DNA片段，可以通过电场方向呈周期性变化，在脉冲电场胶中进行电泳。

2.琼脂糖凝胶的性质：

琼脂糖是从海澡中提取的长链状多聚物，琼脂糖凝胶点为40~45℃。当加热至90℃左右时，即可成清亮、透明的液体，浇在模具上冷却后固化形成凝胶，琼脂糖凝胶可区分相差100bp 的DNA片段。为了满足特殊的要求，可选择低溶点琼脂糖(<70℃,低于双链DNA的变性温度)。

3材料

3.1 琼脂糖，10mg/ml溴化乙锭，1kb DNAmarker

3.2 100ml 50×TAE缓冲液：Tris 2

4.2g,冰乙酸

5.71ml，0.5mol/L EDTA(PH

6.8) 10ml 3.3 6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油

3.4 枪头，移液器，锥形瓶，微波炉，制胶槽，梳子，水平电泳仪，稳压器，凝胶成像系统

4 操作步骤：

4.1 将胶模槽放于水平工作台上。

4.2用电泳缓冲液在微波炉中将琼脂糖颗粒用最短的时间完全溶解。熔化琼脂糖溶液冷却至60度时，加入浓度为0.5μg/ml溴化乙锭10ul，充分混匀。

4.3 在胶模放置好梳子后，将具有一定温度的凝胶倒入胶模中，凝胶的厚度在3-5mm之间。注胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。

4.4 凝胶凝固后通常需要在室温中放置30——45min，小心移去梳子，并将凝胶托盘放入电泳槽。可同时制作几块凝胶，待其固化后用保鲜纸包住以防水分挥发，置4度保存，通常在数日之内可以使用。

4.5加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶表面1—2mm，样品孔内有气泡，用吸管小心吸去，以免影响加样。

4.6 将样品与上样缓冲液混合：上样缓冲液不仅能提高样品的密度，使样品均匀沉到孔底，还可使样品带色，便于上样、估计电泳时间和判断电泳位置。

4.7 用微量移液器将样品依次加在样品孔内。

4.8 盖上电泳槽并通电，5V/cm2,恒压电泳，使DNA向阳极方向移动。

4.9 电泳完成后切断电源，取出凝胶。如果凝胶中加有溴化乙锭，可直接在紫外透射灯下观察，否则就将凝胶浸泡在0.5微克/ml溴化乙锭缓冲液中浸泡

30——45min。

4.10 用凝胶分析系统直接观察并拍照。

5. 注意事项：

5.1 加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，并可对着光线肉眼检查凝胶溶解情况，使附着在壁上的颗粒完全溶解。

5.2 在微波炉上加热时间不要过长，以免引起暴沸。如蒸发过多的溶液，应补充部分缓冲液。

5.3 气温较高或用低熔点、低浓度（小于0.5%）琼脂糖制胶、倒胶和电泳时，最好在4℃进行。

6. 结果观察

6.1仔细观察DNA泳动的方向。

6.2 DNA电泳结束后，记录正常组与marker组电泳条带的相应位置。

7.书写实验报告