异氟醚通过激活InsP3受体对ReNcell CX人神经干细胞损伤和存活的双向调节作用

异氟醚通过激活InsP3受体对ReNcell CX人神经干细胞损伤和存活的双向调节作用【摘要】目的：研究insp3受体在吸入性麻醉剂异氟醚对rencell cx人神经干细胞损伤和存活的影响中的作用。

方法：将培养的rencell cx人神经干细胞应用2.6%异氟醚分别处理1 h、4 h、8 h 和12 h后，测量ldh和mtt，研究异氟醚对rencell cx人神经干细胞存活的时间效应；在异氟醚处理前加入insp3受体特异性阻滞剂100 nm xc，再测量ldh和mtt，研究阻断insp3受体能否消除异氟醚对rencell cx人神经干细胞存活的影响。

结果：2.6%异氟醚处理1 h，ldh低于对照组，mtt高于对照组；2.6%异氟醚处理12 h，ldh高于对照组，mtt低于对照组；加入insp3受体阻滞剂xc后，再用2.6%异氟醚处理1 h及12 h，ldh和mtt与对照组差异无统计学意义。

结论：异氟醚对rencell cx人神经干细胞损伤和存活具有双向作用，这种作用通过内质网膜上insp3受体介导。

【关键词】钙离子； insp3受体；神经保护；神经毒性dual effects of isoflurane on damage and survival in human neural stem cells via activation of insp3 receptor/zhaoxu-li， liu yan-hua， luo jian-gang， et al.//medical innovation of china，2012，9(12)：001-002【abstract】 objective： to investigate the influences of isoflurane on cell damage and survival of rencell cx human neural stem cells， in turn to assess the relationship betweeninsp3 receptor， rencell cx human neural stem cell damage，and survival. methods： the rencell cx human neural stem cells cultured in vitro were exposed to different duration of isoflurane (1 h， 4 h， 8 h， and 12 h respectively) with or without xc， a specific insp3 receptor antagonist. then， ldh and mtt were analyzed to assess the effects of isoflurane and xc on rencell cx human neural stem cell damage and survival. results： isoflurane induced rencell cx human neural stem cells damage and inhibition on rencell cx human neural stem cell survival in a time dependent manner. short time exposure to 2.6% isoflurane(1 h) promoted rencell cx human neural stem cell survival and inhibited rencell cx human neural stem cells damage. while prolonged 2.6% isoflurane exposure inhibited rencell cx human neural stem cell survival and induced rencell cx human neural stem cells damage. this dual effects of isoflurane on rencell cx human neural stem cells could be antagonized by insp3 antagonist xc. conclusion： isoflurane mediated dual effects on rencell cx human neural stem cell damage and survival via activation of insp3 receptors. 【key words】 calcium; insp3 receptor; neuroprotection; neurotoxicityfirst-author’s address： first affiliated hospital ofxinjiang medical university， urumqi 830054， chinadoi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.12.001异氟醚可以阻断nmda受体，兴奋gabaa受体，导致新生动物的凋亡性神经退变。

在大脑发育的关键时期，特别是在胎儿或者发育中的脑，吸入性麻醉剂暴露可以导致异常的神经退变，这可能会导致以后的学习记忆以及认知功能障碍。

鉴于每天有成千上万的人经历全身麻醉下手术治疗，考虑到这些患者围术期的安全性，有必要对全身麻醉药对神经系统的影响进行深入的研究，以最大程度地降低全身麻醉后对神经系统的长期不良影响。

本研究应用rencell cx 人神经干细胞，研究异氟醚对神经干细胞存活的影响。

1 材料与方法1.1 细胞培养 rencell cx人神经干细胞购自美国密理博公司。

细胞接种在20 μg/ml层粘连蛋白涂层的的t75培养瓶内，培养基内加入20 ng/ml的纤维母细胞生长因子和表皮生长因子。

细胞培养在95%空气、5%二氧化碳湿化的37 ℃的培养箱内。

每48 小时更换一次培养基，为了试验的一致性，所有的细胞均是第4~6代。

细胞在t75培养瓶内培养致80%密度时，以30 000细胞/cm2的密度接种在经20 μg/ml层粘连蛋白预裱衬的96孔板或者24孔板内。

1.2 ldh测量应用ldh分析试剂盒分析，具体方法为：每孔取50 μl上清液置于新的96孔板，新孔板内按1∶1加入底物，在室温下避光反应30 min后，加入50 μl停止液后，在490 nm下读其分光光度值代表上清液中释放的ldh的量；向原96孔板内加入10 μl/孔溶解酶，37 ℃下孵育1 h后，每孔取50 μl上清液置于新的96孔板，新孔板内按1∶1加入底物，在室温下避光反应30 min后，加入50 μl停止液后，在490 nm下读其分光光度值代表总的ldh的量；应用上清液中ldh的分光光度值除去总的ldh的分光光度值进行统计分析。

1.3 mtt测量方法依据线粒体脱氢酶的活性还原mtt，用定量闭塞测定细胞死亡数，向培养基内按照1∶10的比例加入mtt试剂(125 μg/ml)，放置在95%空气、5% co2和37 ℃湿化空气的培养箱中孵育1 h后，吸净上清液；每孔内加入dmso 50 μl溶解mtt 还原产物甲瓒；室温避光30 min后，在570 nm下读其分光光度值。

再将结果与对照组的百分比进行统计分析。

1.4 统计学处理应用生物数理统计数据分析作图软件4进行统计分析，单组数据应用单因素方差分析方法，多组数据应用双因素方法分析方法，所有数据以(x±s)表示，p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果2.1 异氟醚呈时间依赖性的引起rencell cx人神经干细胞ldh释放增加，mtt减少。

与对照组相比，2.6%异氟醚处理1小时组的ldh降低、mtt升高，处理12小时组的ldh升高、mtt降低(p<0.05)。

2.6%异氟醚短时间暴露可以减少rencell cx人神经干细胞损伤，促进rencell cx人神经干细胞存活；长期暴露可以促进rencell cx 人神经干细胞损伤，抑制rencell cx人神经干细胞存活。

见图1。

图1 异氟醚诱导的rencell cx人神经干细胞ldh释放量的变化(a)和mtt的变化(b)*p<0.05，**p<0.01，与对照组相比图2 insp3受体阻滞剂xc能消除2.6%异氟醚暴露1小时对rencell cx人神经干细胞损伤和存活的保护作用(图a、图c)；insp3受体阻滞剂xc能拮抗2.6%异氟醚暴露12小时对诱导的rencell cx 人神经干细胞损伤和存活抑制(图b、图d)*p<0.05，**p<0.01，***p<0.01，与对照组比较2.2 insp3受体特异性阻断剂xc能消除异氟醚对rencell cx人神经干细胞损伤和存活的影响。

与对照组和“(xc+异氟醚)1小时组”相比，异氟醚1小时组ldh释放减少，mtt增多(见图a和图c)。

与对照组和“(xc+异氟醚)12小时组”相比，异氟醚12小时组ldh 释放增多，mtt减少(见图b和图d)。

说明异氟醚对rencell cx人神经干细胞损伤和存活的双向作用是通过激活insp3受体实现的。

见图2。

3 讨论细胞内钙离子稳态对细胞本身的功能维持至关重要。

钙离子作为重要的第二信使之一，对细胞生长、分化、膜的兴奋性、细胞外分泌、突触活性、凋亡和自噬都有重要的调控作用[1]。

细胞内钙离子浓度适度增高，可能激活细胞内钙离子介导的信号传导通路，发挥保护作用，细胞内持续异常钙离子增高则可能导致细胞凋亡[2]。

细胞内钙离子的浓度是决定毒性和保护作用的重要的因素之一[3]。

内质网是细胞内主要的钙离子库，insp3受体激活可以引起的细胞内钙离子水平增高，引起细胞内钙离子浓度显著升高[4]。

本研究发现，异氟醚对rencell cx人神经干细胞损伤和存活抑制具有双向作用。

短时间异氟醚暴露可以促进rencell cx人神经干细胞存活，减少损伤；长时间异氟醚暴露抑制rencell cx人神经干细胞存活，增加损伤。

异氟醚的这种双向作用可以被insp3受体拮抗剂xc拮抗，说明异氟醚通过激活内质网insp3受体，引起内质网内钙离子释放，导致细胞内钙离子稳态发生改变对rencell cx人神经干细胞损伤和存活发挥双向作用。

异氟醚的神经毒性和神经保护作用可能是通过不同程度的激活insp3受体实现，短时间异氟醚暴露可以导致内质网适度激活，导致内质网内钙离子浓度适度释放，细胞内钙离子浓度适度增高，激活钙离子介导的存活信号转导通路，发挥神经保护作用；异氟醚长期暴露，导致内质网过度激活，内质网内钙离子过度释放，导致细胞内钙离子过度增高，诱导钙离子介导的凋亡信号转导通路。