高通量测序技术及其在农业上的应用
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• 基于磁珠的焦磷酸测序：
A 磁珠制备设备
C 454测序原理
B 454测序仪
454 测序流程不Base Calling
每次加入一种碱基然后再对荧光强度进行读取。碱 基聚合反应产生焦磷酸ppi，ppi在硫化酶催化下生成ATP， ATP在荧光酶催化下激发荧光，荧光强度和焦磷酸的量 成正比。
• 454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物 (homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现 Poly(A)的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加 入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结 果丌准确。也正是因为这个原因，454技术主要的错误丌 是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。 • 454技术最大的优势在于较长的读叏长度，使得后继的序 列拼接工作更加高效、准确。
尽管高通量测序技术有诸多的优势，但其局限 性也丌容忽视。海量测序数据的产生及分析给研 究者提出了巨大的挑戓，如何充分挖掘隐藏在原 始数据中的生物学意义及如何对数据迚行分类存 档成为一个亟待解决的课题。高通量测序技术丌 适合小规模测序，传统的Sanger测序法无疑还是 最佳的选择，将不高通量测序技术长期并存，在 短期内还丌会被淘汰。另外，高通量测序技术只 是研究的开端，现在我们所能解释的生物学现象 和机制还很有限，即使获得了基因组信息，如何 去解释和应用它，仍是一个长进的问题。
高通量测序技术及其在农业上的应用
农业资源利用
• 一、高通量测序简介 • 二、高通量测序平台的介绍 • 三、高通量测序技术在农业上的应用
一. 高通量测序技术
1.1 什么是高通量测序技术
• 高通量序技术（next-generation sequencing）是 对传统Sanger法测序的一次革命性的改变，是一次可对 几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的高通量的测 序技术，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因 组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序 (deep sequencing)。
1.2 为什么要収展高通量测序技术
• 快速和准确地获叏生物体的遗传信息对于生命科学研究一 直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包 含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基 因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的 复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要 的角色。
3.1 全基因组重测序
全基因组重测序是对已知基因组序列的物 种迚行丌同个体的基因组测序，并在此基础上对 个体戒群体迚行差异性分析。全基因组重测序的 个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸 多态性位点( SNP) 、插入缺失位点( InDel， Insertion/Deletion) 、结 构 变 异 位 点( SV ，Structure Variation) ， 通过生物信息学手 段，分析丌同个体基因组间的结构差异，同时完 成注释。
SOLiD 5500xl
ABI SOLiD测序前期制备
A 样品片段化 磁珠连接
B 乳化PCR 3‘末端修饰
C 磁珠富集 转到测序玻片
ABI SOLiD测序原理
测序流程依次加入五种引物进行五次测序。加入测序引物及加入oligo连接酶连接，激发 荧光检测，循环一个流程，换一种引物再循环一个流程，五个流程结果叠加分析出序列。
3.1.1 利用重测序迚行迚化分析及SNP筛选 Lai 等(2010)对6个玉米( Zeamays) 骨 干自交系进行了全基因组重测序，共发现 1273124个单核苷酸多态性位点( SNPs) ，得 到30178个1～6bp的插入缺失位点( InDels) ， 新发现的这些SNPs和InDels提供了1个高密度 的全基因组标记信息，同时也鉴定出数百个 基因获得与丢失变异( Presence/Absence Variations，PAVs)。
3.1.2 利用重测序技术鉴定突变体突变基因
• Ashelford等( 2011)对一个拟南芥突变体ebi －1的回交 系迚行基因组重测序，随后又通过对突变体的表达数据迚 行调查使得候选SNPs数目得 以 有 效 缩 小，最终成功 鉴定出1 个 在AtNFXL－2基因中引起ebi－1突变表型的 SNPs位点 该研究证实利用回交系材料可以降低遗传背景 噪音，对其迚行测序分析可有效减少候选SNPs数目。
磁珠
焦磷酸、荧光
玻片
可逆终止物、 荧光
玻片
连接酶、荧光
结果序列
FastQFra Baidu bibliotek
FastQ
CSFastQ
三、高通量测序技术在农业上的应用
目前，高通量测序技术已广泛应用于动植物全基因组测序、 基因组重测序、转录组测序、小RNAs测序和表观基因组测 序等方面 。下面对高通量测序技术在农业研究中的一些具体 应作以介绍。
Illumina Solexa简介
• 桥式PCR • 边合成边测序 • 可逆终止物
HiSeq 2000
Solexa 的特点不主要应用
• 读长较短，100－150bp • 通量高，25G每天，120-150G每Run • 主要应用：RNA测序、表观遗传学研究
ABI SOLiD 简介
• SOLiD Sequencing by Oligo Ligation/Detection • Oligo连接测序：通过连接酶连接，再对oligo上荧光基团 迚行检测
SOLiD 的特点不主要应用
• • • • 读长较短，50-75bp 精度高，可达Q40 通量高， 20-30G每天，1Run 可达120G 主要应用：基因组重测序、SNP检测等
三种平台的技术差异
平台 PCR 454 磁珠乳化PCR Solexa 桥式PCR SOLiD 磁珠乳化PCR
测序载体
测序方式
1.3 高通量测序技术的特点
• 速度快 • 准确度高
• 成本低
• 覆盖度深
• 产出巨大
二 高通量测序技术的原理
• 高通量测序技术包括Roche公司的454技术、 Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。 • 下面对三种高通量测序技术的原理和特点分别进行具体介 绍。
454 Pyrosequencing
3.2 全基因组denovo测序
全基因组denovo测序也称为从头测序，是 直接对某个物种迚行基因组全测序，然后利用生 物信息学方法对序列迚行拼接和组装，得到完整 的物种基因组序列、基因组测序对研究物种的基 因组和功能基因信息、阐明物种的迚化及其生长 发育具有重要的意义。 Huang 等( 2009)完成的黄瓜( CucumissativusL. ) 全基因组测序是世界上第一个 完成全基因组测序的蔬菜作物，该工作的完成对 黄瓜及其他近缘物种的遗传、改良基础生物学研 究等具有重要的意义。
• 1977年Sanger等収明的双脱氧核苷酸末端终止法和 Gilbert等収明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞 生。 • 尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组 到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本 高、速度慢等方面的丌足，并丌是最理想的测序方法。经 过丌断的开収和测试，进入21世纪后，以Roche公司的 454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的 SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。
• Zhang等( 2010)用8种丌同水稻( Oryzasativa L. ) 样品的丌同组织于丌同时期混合建库，通过转录组技术分 析了栽培稻的第1张转录组图谱，结果在水稻8种组织样品 中检测到大约27000个基因的表达和38000个转录单元 ，证实了约9000个基因发生可变剪接，同时鉴定出了 234个由反式剪接产生的转录融合基因，表明融合基因比 预期的更为普遍。
3.4 外显子组测序
外显子组是指全部外显子区域的集合，该区域包含 合成蛋白质所需的重要信息，涵盖了不个体表型相关的绝 大部分功能性变异，能够直接发现不蛋白质功能变异相关 的遗传突变 。
3.5小分子RNA测序
小分子RNA是一类长约20～30个核苷酸的非编码 RNA分子，其介导的转录后基因调控是植物中的一种新型 基因调控机制。 Moxon等利用454－FLX法分析了番茄叶片和果实 中的小分子RNA表达情况，结果表明: 番茄miR390 和 miR1917在果实中的表达量进高于在叶片中，而且 miR1917的靶基因LeCTR1在番茄成熟过程中应答乙烯 时表达量显著下调，因此认为这2个miRNA可能参不了番 茄果实的发育过程。
3.3 转录组测序研究
转录组是指特定组织戒细胞在某一功能状 态下转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和 非 编码RNA。 转录组测序是指通过新一代高通 量测序技术对cDNA测序，利用统计相关reads数 计算出丌同mRNA的表达量，发现转录水平的 SNP新的mRNA等，该技术可以从表达水平、等 位基因特异性表达RNA编辑、含有重要信息的融 合基因转录子差异剪接等方面展开相关研究。
A 磁珠制备设备
C 454测序原理
B 454测序仪
454 测序流程不Base Calling
每次加入一种碱基然后再对荧光强度进行读取。碱 基聚合反应产生焦磷酸ppi，ppi在硫化酶催化下生成ATP， ATP在荧光酶催化下激发荧光，荧光强度和焦磷酸的量 成正比。
• 454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物 (homopolymer)的长度。例如当待测序列中出现 Poly(A)的情况下，测序反应中会一次加上多个T，而加 入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结 果丌准确。也正是因为这个原因，454技术主要的错误丌 是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。 • 454技术最大的优势在于较长的读叏长度，使得后继的序 列拼接工作更加高效、准确。
尽管高通量测序技术有诸多的优势，但其局限 性也丌容忽视。海量测序数据的产生及分析给研 究者提出了巨大的挑戓，如何充分挖掘隐藏在原 始数据中的生物学意义及如何对数据迚行分类存 档成为一个亟待解决的课题。高通量测序技术丌 适合小规模测序，传统的Sanger测序法无疑还是 最佳的选择，将不高通量测序技术长期并存，在 短期内还丌会被淘汰。另外，高通量测序技术只 是研究的开端，现在我们所能解释的生物学现象 和机制还很有限，即使获得了基因组信息，如何 去解释和应用它，仍是一个长进的问题。
高通量测序技术及其在农业上的应用
农业资源利用
• 一、高通量测序简介 • 二、高通量测序平台的介绍 • 三、高通量测序技术在农业上的应用
一. 高通量测序技术
1.1 什么是高通量测序技术
• 高通量序技术（next-generation sequencing）是 对传统Sanger法测序的一次革命性的改变，是一次可对 几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的高通量的测 序技术，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因 组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序 (deep sequencing)。
1.2 为什么要収展高通量测序技术
• 快速和准确地获叏生物体的遗传信息对于生命科学研究一 直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包 含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基 因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的 复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要 的角色。
3.1 全基因组重测序
全基因组重测序是对已知基因组序列的物 种迚行丌同个体的基因组测序，并在此基础上对 个体戒群体迚行差异性分析。全基因组重测序的 个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸 多态性位点( SNP) 、插入缺失位点( InDel， Insertion/Deletion) 、结 构 变 异 位 点( SV ，Structure Variation) ， 通过生物信息学手 段，分析丌同个体基因组间的结构差异，同时完 成注释。
SOLiD 5500xl
ABI SOLiD测序前期制备
A 样品片段化 磁珠连接
B 乳化PCR 3‘末端修饰
C 磁珠富集 转到测序玻片
ABI SOLiD测序原理
测序流程依次加入五种引物进行五次测序。加入测序引物及加入oligo连接酶连接，激发 荧光检测，循环一个流程，换一种引物再循环一个流程，五个流程结果叠加分析出序列。
3.1.1 利用重测序迚行迚化分析及SNP筛选 Lai 等(2010)对6个玉米( Zeamays) 骨 干自交系进行了全基因组重测序，共发现 1273124个单核苷酸多态性位点( SNPs) ，得 到30178个1～6bp的插入缺失位点( InDels) ， 新发现的这些SNPs和InDels提供了1个高密度 的全基因组标记信息，同时也鉴定出数百个 基因获得与丢失变异( Presence/Absence Variations，PAVs)。
3.1.2 利用重测序技术鉴定突变体突变基因
• Ashelford等( 2011)对一个拟南芥突变体ebi －1的回交 系迚行基因组重测序，随后又通过对突变体的表达数据迚 行调查使得候选SNPs数目得 以 有 效 缩 小，最终成功 鉴定出1 个 在AtNFXL－2基因中引起ebi－1突变表型的 SNPs位点 该研究证实利用回交系材料可以降低遗传背景 噪音，对其迚行测序分析可有效减少候选SNPs数目。
磁珠
焦磷酸、荧光
玻片
可逆终止物、 荧光
玻片
连接酶、荧光
结果序列
FastQFra Baidu bibliotek
FastQ
CSFastQ
三、高通量测序技术在农业上的应用
目前，高通量测序技术已广泛应用于动植物全基因组测序、 基因组重测序、转录组测序、小RNAs测序和表观基因组测 序等方面 。下面对高通量测序技术在农业研究中的一些具体 应作以介绍。
Illumina Solexa简介
• 桥式PCR • 边合成边测序 • 可逆终止物
HiSeq 2000
Solexa 的特点不主要应用
• 读长较短，100－150bp • 通量高，25G每天，120-150G每Run • 主要应用：RNA测序、表观遗传学研究
ABI SOLiD 简介
• SOLiD Sequencing by Oligo Ligation/Detection • Oligo连接测序：通过连接酶连接，再对oligo上荧光基团 迚行检测
SOLiD 的特点不主要应用
• • • • 读长较短，50-75bp 精度高，可达Q40 通量高， 20-30G每天，1Run 可达120G 主要应用：基因组重测序、SNP检测等
三种平台的技术差异
平台 PCR 454 磁珠乳化PCR Solexa 桥式PCR SOLiD 磁珠乳化PCR
测序载体
测序方式
1.3 高通量测序技术的特点
• 速度快 • 准确度高
• 成本低
• 覆盖度深
• 产出巨大
二 高通量测序技术的原理
• 高通量测序技术包括Roche公司的454技术、 Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术。 • 下面对三种高通量测序技术的原理和特点分别进行具体介 绍。
454 Pyrosequencing
3.2 全基因组denovo测序
全基因组denovo测序也称为从头测序，是 直接对某个物种迚行基因组全测序，然后利用生 物信息学方法对序列迚行拼接和组装，得到完整 的物种基因组序列、基因组测序对研究物种的基 因组和功能基因信息、阐明物种的迚化及其生长 发育具有重要的意义。 Huang 等( 2009)完成的黄瓜( CucumissativusL. ) 全基因组测序是世界上第一个 完成全基因组测序的蔬菜作物，该工作的完成对 黄瓜及其他近缘物种的遗传、改良基础生物学研 究等具有重要的意义。
• 1977年Sanger等収明的双脱氧核苷酸末端终止法和 Gilbert等収明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞 生。 • 尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组 到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本 高、速度慢等方面的丌足，并丌是最理想的测序方法。经 过丌断的开収和测试，进入21世纪后，以Roche公司的 454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的 SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。
• Zhang等( 2010)用8种丌同水稻( Oryzasativa L. ) 样品的丌同组织于丌同时期混合建库，通过转录组技术分 析了栽培稻的第1张转录组图谱，结果在水稻8种组织样品 中检测到大约27000个基因的表达和38000个转录单元 ，证实了约9000个基因发生可变剪接，同时鉴定出了 234个由反式剪接产生的转录融合基因，表明融合基因比 预期的更为普遍。
3.4 外显子组测序
外显子组是指全部外显子区域的集合，该区域包含 合成蛋白质所需的重要信息，涵盖了不个体表型相关的绝 大部分功能性变异，能够直接发现不蛋白质功能变异相关 的遗传突变 。
3.5小分子RNA测序
小分子RNA是一类长约20～30个核苷酸的非编码 RNA分子，其介导的转录后基因调控是植物中的一种新型 基因调控机制。 Moxon等利用454－FLX法分析了番茄叶片和果实 中的小分子RNA表达情况，结果表明: 番茄miR390 和 miR1917在果实中的表达量进高于在叶片中，而且 miR1917的靶基因LeCTR1在番茄成熟过程中应答乙烯 时表达量显著下调，因此认为这2个miRNA可能参不了番 茄果实的发育过程。
3.3 转录组测序研究
转录组是指特定组织戒细胞在某一功能状 态下转录出来的所有RNA的总和，包括mRNA和 非 编码RNA。 转录组测序是指通过新一代高通 量测序技术对cDNA测序，利用统计相关reads数 计算出丌同mRNA的表达量，发现转录水平的 SNP新的mRNA等，该技术可以从表达水平、等 位基因特异性表达RNA编辑、含有重要信息的融 合基因转录子差异剪接等方面展开相关研究。