超滤法(ultrafiltration)分离明胶厚壳贻贝血清蛋白溶液
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）2. 透析自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。
在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。
通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。
保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。
透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。
商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。
为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。
可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。
实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。
使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。
凝胶过滤法分离蛋白质实验报告
凝胶过滤法分离蛋白质实验报告
凝胶过滤法是一种分离蛋白质的方法。
本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构，能够根据分子大小的不同进行分离。
大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而小分子物质要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。
从而实现分离的目的。
实验步骤包括凝胶溶胀、装柱、样品处理、上样和过滤、部分收集和凝胶回收。
在收集洗脱液的过程中，开始时为无色透明，但时间过去，试管中收集的红褐色开始变深，到最后，试管的颜色为深褐色，接着溶液的颜色开始变浅，红褐色几乎要消失。
接着又开始出现浅黄色，再到黄色，再黄色开始慢慢变浅，最后又变成无色透明。
这是因为分子的扩散有快有慢，少量的高铁血红蛋白与缓冲液一起滴出，使得溶液慢慢加深。
3.经过过滤后，溶液变成深褐色，这是高铁血红蛋白的本色。
颜色越深，表示过滤后蛋白质越纯。
4.随着洗脱的进行，红褐色开始变浅。
这是因为大部分高铁蛋白已经被洗脱，只剩下一小部分洗脱较慢的高铁蛋白。
5.开始呈现浅黄色，并逐渐变成无色，这是由于高铁氰化钾的扩散速度不同。
一部分高铁氰化钾扩散得很快，接着大部分K3Fe(CN)6被洗脱出来，最后全血几乎被洗脱完毕。
试管中接收的是缓冲液。
6.红褐色先释放出来，然后才是黄色。
这是因为血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白，因为高铁血红蛋白的分子较大，洗脱速度较快。
而小分子的高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，因此红褐色先被洗脱出来，黄色则稍后。
血清蛋白的分离、提纯与鉴定
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定一、实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术二、实验原理：蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。
对于不同的蛋白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。
利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。
A.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。
B.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。
当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。
C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。
D.纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。
由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
三、材料与方法A材料样品：人混合血清试剂：葡聚糖凝胶（G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓2冲溶液、电泳仪、电泳槽B实验步骤盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）具体操作流程示意：（一）盐析+凝胶柱层析除盐：（二）离子交换层析（纯化）：（三）醋酸纤维素薄膜电泳：1、点样（如下图）：-点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳：①薄膜粗面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平电压：110V时间：50min3、染色和漂洗：电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。
血清中蛋白提取方法
血清中蛋白提取方法血清是人体血液中的液体部分，其中含有丰富的蛋白质。
蛋白质是生命活动中不可或缺的重要分子，因此提取血清中的蛋白质对于研究和应用具有重要意义。
本文将介绍几种常用的血清中蛋白提取方法。
一、盐析法盐析法是一种常用的蛋白质提取方法，其原理是利用不同离子强度对蛋白质的溶解度差异进行分离。
首先将血清样品加入含有不同浓度盐溶液的离心管中，然后离心沉淀蛋白质。
通过调节盐浓度，可以选择性地提取特定类型的蛋白质。
二、凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于蛋白质分子大小差异进行分离的方法。
首先将血清样品加入具有特定孔径大小的凝胶柱中，较大分子量的蛋白质无法通过凝胶孔隙而被滞留，较小分子量的蛋白质则可以通过凝胶柱流出。
通过这种方式，可以将不同分子量范围的蛋白质分离提取。
三、电泳法电泳法是一种利用电场作用下蛋白质的电荷和分子量差异进行分离的方法。
在电泳过程中，将血清样品置于凝胶中，通过施加电场使蛋白质在凝胶中移动。
根据蛋白质的电荷和分子量差异，可以将不同类型和不同大小的蛋白质分离开来。
电泳方法具有高分辨率和高灵敏度的优点，广泛应用于蛋白质分离和分析领域。
四、亲和层析法亲和层析法是一种利用蛋白质与特定配体之间的特异性相互作用进行分离的方法。
在亲和层析过程中，将具有特定配体的固相材料填充在柱子中，然后将血清样品溶液通过柱子。
与配体有特异性相互作用的蛋白质将与配体结合，并通过洗脱步骤将蛋白质从柱子中洗脱出来。
亲和层析法可以高效地提取特定类型的蛋白质。
五、质谱法质谱法是一种基于蛋白质质量和电荷差异进行分离和鉴定的方法。
在质谱法中，首先将血清样品进行蛋白质提取和纯化，然后通过质谱仪对蛋白质进行分析。
质谱法具有高分辨率和高灵敏度的优点，可以对蛋白质进行精确的定性和定量分析。
血清中蛋白提取方法主要包括盐析法、凝胶过滤法、电泳法、亲和层析法和质谱法等。
根据需要和实验目的的不同，选择合适的方法可以高效地提取和分离血清中的蛋白质。
这些方法在生命科学研究和临床应用中发挥着重要的作用，为人们深入了解蛋白质的功能和相互作用提供了重要的技术手段。
血清球蛋白的分离纯化与鉴定 (2)
3．染色：薄膜浸入氨基黑B染色液2～5分钟。 4．漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗4～5次，至无蛋白 区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。
预试结果
上
先
凝胶层析脱盐
午
粗
完
后
成 交联葡聚糖吸水浓缩
细
下午 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 完成
实验流程及操作注意事项
1. 初步纯化：盐析
取血清1.0ml于小试管中，加入洗脱液 1.0mL摇匀 ，再逐滴加入1.0mL pH7.2饱和(NH4)2SO4溶液边加 边摇。静置5min后，3000rpm/min 离心10min。倾去 上清液。
• 盐析的原理：蛋白质溶液中，加入高浓 度中性盐，破坏蛋白质溶解的2大因素（ 电荷，水化膜），使其沉淀析出。
• 中性盐：硫酸铵，硫酸钠等
• 蛋白质复溶：加入低盐浓度缓冲液
• 控制盐溶液的浓度可以沉淀出不同的蛋 白
• 影响因素：
温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可 ,少数温度敏感型蛋白质需4℃操作，而血红 蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25℃比0℃时溶 解度低，更易盐析。 pH值：大多数蛋白质在pI时溶解度最低。 pH=pI效果更好。 蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血 清加等量生理盐水稀释，控制蛋白质含量在 2.5-3.0%。
层析法也称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、 分析鉴定技术,是1903年俄国植物学家Michael Tswett发 现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的 柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动 后形成不同的色带而被分开。
用色彩（chroma）和 图谱（graphs）组成
血清白蛋白的分离纯化及鉴定(一)-盐析、G-25脱盐、G-75层析
紫外检测仪记录仪
1、量程一定用10mv。 2、走纸速度：G25，2A，5 cm；G75,1A，1-2 cm。 紫外检测仪使用方法： 1、首先将主机和记录仪二部分电路接妥，然后把主 机的电源插头插入220V电源插座上。 2、出厂前波长设定280nm，若所需其它波长，只需 在仪器右侧转动波长转换旋钮拨到实验所需档。
紫外检测仪的使用
紫外检测仪主要技术指标： 量程范围：0-100%T、0-2A、0-1A、0-0.5A、0-0.2A、0-0.1A、0-0.05A 1、调节光量旋钮，量程旋钮放置100%T档，使LED数字显示为 100，T拨到A档，使LED面板上读数为0左右，若作透光度T测试，就 可在层析柱上加样，对样品进行分离分析。 2、若做光密度A测试，把量程旋钮（即灵敏度）拨到所需光密度 A，调节光量旋钮，使LED面板为0。此时记录仪回到零点附近（注： 零点附近即可，在实验中可自来定）。 3、如绘出图谱峰值过小，把量程旋钮（即敏度）拨到所需位置。 4、在测试过程中，“光量”均不再变动。测试完毕，并用蒸馏水 清洗样品池和管道。
紫外检测仪工作原理
仪器工作原理的依据是光吸收定律。从光源发出的光 经狭缝、滤光片、样品池到光电培增管上，使束由于样品 浓度不同所引起光强的变化转换成光电流的变化，此光电 流经放大器输入到对数转换器，使透光率T转成A输出，即 A=1g — =εCL式中ε为待测样品的克分子消光系统，C为样 品浓度，采用克分子/升单位，L为光程，用厘米作单位。 根据上式就知测出了A，就知样品浓度C。若从放大器直接 输入记录仪，绘出的是样品透光率T变化的图谱，若从对数 转换器输入到记录仪绘出的是样品光密度A变化的图谱。
层析柱，从而达到分离的目的。
凝胶层析
3、当样品通过层析柱时，分子量较大的物质因为不能或 较难通过网孔而进入凝胶颗粒间隙，沿着凝胶颗粒间 的间隙流动，所以流程较短，向前移动的速度较快， 即受阻滞的程度较小，最先流出层析柱；反之，分质
凝胶过滤法分离蛋白质
凝胶过滤法分离蛋白质实验原理ONE:分子筛层析molecular-sieve chromatography凝胶过滤层析gel-filtration chromatography分子排阻层析molecular exclusion chromatography凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。
当混合溶液过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质按不同分子量筛分开。
TWO:凝胶过滤介质不溶于水，在水中有较大膨胀度和较好的分子筛功能，多孔的网状结构。
常用凝胶：葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose），聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P）。
凝胶因交联度不同,孔径不同，交联度越大，孔径越小。
蛋白质分子直径>凝胶孔径时，被排阻在外，小于孔径者则进入凝胶。
THREE:交联葡聚糖凝胶（Sephadex）葡聚糖和3-氯-1，2环氧丙烷以醚键相互交联形成。
按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。
Sephadex G-10，15，25，50，75，100，150，200数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。
Sephadex G-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。
G值越小，交联度越大，网孔越小，吸水膨胀越小，只能分离相对分子量小的物质；G值越大，交联度越小，网孔越大，吸水膨胀越大，可以分离相对分子量大的物质；分离范围Mr（肽和球蛋白）Sephadex G-25 1000-5000Sephadex G–50 1500-30000Sephadex G–75 3000-70000补充说明：凝胶过滤层析特点❃设备简单，操作方便❃分离条件温和，样品回收率高（100%）❃实验重复性好除盐：☊选择孔径小，交联度大的凝胶。
☊Sephadex G-25全排出的最小分子量为5000☊Sephadex G–50全排出的最小分子量为30000（除盐的蛋白质分子量必须大于30000，消除凝胶对蛋白质的滞留作用。
蛋白质溶液的浓缩方法
蛋白质溶液的浓缩方法1.渗透浓缩法：渗透浓缩法是一种常见的浓缩蛋白质溶液的方法。
这种方法基于溶液和溶剂浓度差异的渗透力，利用半透膜将小分子溶质（如盐、小分子蛋白质）透过，同时阻止大分子溶质（如蛋白质）的通过。
常见的膜材料有聚乙烯醇（PVA）、聚丙烯酰胺（PAM）等。
渗透浓缩法的步骤如下：（1）选择合适的膜材料，将膜组装在浓缩装置上。
（2）将蛋白质溶液加入装置中，通过渗透作用，溶液中的小分子溶质会透过膜，而蛋白质则被滞留在浓缩装置中。
（3）持续向装置中加入纯水或缓冲液，以保持浓缩装置内的水分量，促进蛋白质的浓缩。
（4）根据需要，可以多次重复以上步骤，加速蛋白质的浓缩过程。
2.覆膜浓缩法：覆膜浓缩法是通过将蛋白质溶液覆盖在薄膜上，然后通过薄膜的渗透作用，使溶剂透过薄膜，蛋白质被浓缩的方法。
这种方法适用于小规模的浓缩操作，例如实验室规模的研究。
覆膜浓缩法的步骤如下：（1）选择合适的薄膜材料，如高密度聚乙烯（HDPE）膜。
（2）将膜材料放在容器内，然后将蛋白质溶液倒入容器，覆盖在膜上。
（3）通过薄膜的渗透作用，溶剂会透过膜，蛋白质被滞留在薄膜上。
（4）可以将浓缩后的蛋白质从薄膜上刮取或者用缓冲液冲洗。
3.超滤法：超滤法是一种常见且有效的蛋白质溶液浓缩方法。
这种方法利用超滤膜的孔径选择性，将大分子溶质（如蛋白质）从溶液中滤出，从而实现浓缩。
超滤法的步骤如下：（1）选择合适的超滤膜，根据蛋白质的大小选择孔径大小。
（2）将膜组装在超滤设备上，确保完好无损。
（3）将蛋白质溶液加入设备中，通过压力或重力作用，使溶液通过超滤膜。
（4）大分子溶质（如蛋白质）会被滞留在超滤膜上，形成浓缩液，滤出物则为小分子溶质。
总结：以上所述是几种常见的蛋白质溶液浓缩方法。
这些方法各有特点，在具体操作中可以根据蛋白质的性质、浓缩效果和设备条件等因素选取合适的方法。
同时，为了保证蛋白质的活性和稳定性，在浓缩过程中也应注意蛋白质的处理温度、pH值和离子浓度等因素，以避免对其产生不良影响。
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超滤法（ultrafiltration）分离明胶厚壳贻贝血清蛋白溶液
一、实验目的
1.熟悉超滤的基本原理、板式超滤器的结构及基本流程
2.了解超滤过程中的影响因素如温度、压力、流量及物料分子量等因素对超滤通量的影响
3.了解超滤器污染的原因及其对策
二、实验原理
超滤的技术原理近似机械筛分。
当溶液体系由水泵进入超滤器时，在超滤器内的膜表面发生分离，溶剂（水）和其他小分子量溶质透过具有不对称微孔结构的滤膜，大分子溶质和微粒（如蛋白质、病毒、细菌、胶体等）被滤膜截留（图1）。
从而达到分离和纯化的目的。
图1 超滤技术原理示意图
一般来说，以截留分子量来间接地反映超滤膜孔径的大小，具体做法是：通过测定具有相似化学性质的不同分子量的一系列化合物的截留率所得的曲线，根据该曲线求的截留率大于90%的分子量即为截留分子量（图2）。
通常截留分子量在500～106间的膜分离过程称为超滤。
表征超滤膜性能的参数除截留分子量外，还有截留率和膜的纯水通量。
截留率是指对一定分子量的物质来说，膜所能截留的程度，其
定义为
式中C f为料液的浓度，C p为超滤液的浓度。
膜的纯水通量是指料液为纯水时，单位时间透过纯水的体积，一般是在0.13～0.3 MP a压力下测定的
实验装置
图3为本实验的流程，料液先放入料液槽，由泵供给，旁路阀3用以调节进料流量，用出口阀4调节进出口压力，料液泵入系统后，超滤液用一排塑料收集管收集，截留液进入料液槽循环。
三、实验材料：厚壳贻贝血清溶液
四、实验仪器和试剂：NaOH, 去离子水，真空抽率仪，滤纸，低温离心机，0.45μm孔径滤膜，制冰机，
五、实验步骤
1.将贻贝血清于4℃，13000rpm 离心，取上清液，并用0.45μm孔径滤膜过滤。
2. 关闭进口阀1，向料液槽加入一定量的去离子水排出泵内空气后，按说明书将滤膜装于超滤仪上，并拧紧。
3．合上电源，启动泵，打开出口阀4，并半开进口阀1，然后从小到大不断关闭出口阀，使出口压力表的读数由小到大发生变化（注意不能超过压力表的量程范围，推荐值为20psi），4．清洗完毕后，先打开出口阀，再关闭进口阀，停止进料泵。
5．在料液槽内加入适量的血清溶液（100ml－500ml）重复上述1-4步骤，并记下超滤通量，视其有何变化（为什么），实验结束前，分别取料液、超滤液，分析其中蛋白的含量。
超滤时，进口压力约在30psi ，出口压力10psi。
6．实验结束后，组件要进行清洗，洗涤时，进口压力约在20psi，操作过程同1-4步骤，使清洗液在系统内循环，清洗程序为：
(1)用去离子水（500－1000ml）清洗一遍；
(2)用0.1N NaOH（500－1000ml）水溶液清洗一遍；
(3)取下微孔滤膜，并用封口膜封严，4℃保存。
六、注意事项
1.在试验过程中，进料槽内的液体不能降低到使进料泵吸入空气的水平高度，吸入空气会使泵及膜受到损坏。
2.所使用的压力不能超过表的读数范围，应控制在60psi以内。
3.应遵循：开时，先开电源，再开进口阀；关时，先关进口阀，再关电源的原则。
4.料液槽内应为均一的溶液，不能有不溶物，否则泵易受损。