[Northern Blot]合成探针方法
Northern Blot原理及实验方法
Northern Blot原理及实验方法原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的RNA探针进行反应。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
实验方法：[仪器、试剂、材料]（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。
（二）材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜（三）试剂：NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer，dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水,灭菌水等。
[方法与步骤]1.用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。
2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。
3．制胶：1．称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。
60℃空气浴平衡溶液(需加DEPC水补充蒸发的水分)2．在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
注意尽量避免产生气泡。
3．将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。
Northern blotting
⑧转膜结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸。将膜 在6×SSC中浸泡5 min，以去除膜上残留的凝胶。
（三）核酸分子固定
烘烤：将膜夹在两张滤纸之间，80℃真空烘 烤2小时。烤干后的膜用塑料袋密封，4℃保 存备用。 紫外光固定：将膜携带RNA的一面暴露置于UV 交联仪中，UV照射自动交联
（四）核酸分子杂交
2.杂交： 将变性的探针（95-100℃变性5min，冰浴5min）加 入到预杂交液中，42℃杂交16hr。
3.洗膜： ① 倾去杂交液。 ② 2×SSC/0.1%SDS室温洗15min。 ③ 0.2×SSC/0.1%SDS，55℃洗15min×2次。
（五）杂交信号的检测
放射自显影
将膜用dd H2O漂洗片刻，用滤纸吸去膜上水份。用 薄型塑料纸将膜包好，置于暗盒中，在暗室中压上 X光片。暗盒置-70℃放射自显影3～7天左右。
Northern blotting：
优点：传统、经典的方法，更为直接可信；能够反映mRNA丰度 ，还可以检测不同的剪切体；在杂交实验中，DNA-RNA，RNARNA这两种杂交双链的稳定性高于DNA-DNA双链，因此检测 RNA靶要比检测DNA靶在严谨性上要高很多 缺点：操作较为复杂，可能需要用到同位素；实验需要的RNA量 较大，对一些少量和痕量样品较难实现。
利用DNase I在DNA双链上造成单链切口
利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活 性在切口处将旧链从5末端逐步切除 在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的 DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末 端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷 酸掺入到新的DNA链中
定义：来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补 形成异源双螺旋分子。可分为DNA/DNA、RNA/RNA、 DNA/RNA之间的杂交。 探针类型：
northern blot
目录
简介 流程
材料电泳胶 探针
应用 优缺点
展开
编辑本段简介
Northern blot 是一种通过检测 RNA 的表达水平来检测基因表达的方法，通过
northern blot 的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特
定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的 RNA 分子依据
编辑本段优缺点
分析基因的表达可以有很多种不同的方法，除 northern blot 外还有 RT-PC
R、基因芯片、RNA 酶保护实验等。基因芯片常和 northern blot 一起使用，但通
常情况下，northernblot 的灵敏度要好于基因芯片实验，而基因芯片优势在于它可
在一次实验中同时反映出几千个基因表达量的变化。与定量 PCR 的高灵敏度相
比，northern blot 显然要逊色不少，但 northern blot 较高的特异性可以有效的减
少实验结果的假阳性。Northern blot 实验中一个主要的问题是存在 RNA 的降解，
所以 northern blot 中所有的实验用品都需要经过除去 RNA 酶的过程，如高温烘
烤、DEPC 处理等。同时，norther blot 中很多实验用品如甲醛、EB、DEPC、紫
其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是 RNA 分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现 在通指整个实验的过程。Northern blot 在1977年由斯坦福大学 James Alwine，David Kemp 和 George Stark 发明。Northern blotting 实际上依照比它更早发明的一项杂交 技术 Southern blot（依据生物学家 EdwinSouthern 名字来命名）来命名，Southern blot 主要用来对 DNA 进行分析。
NorthernBlot注意事项
NorthernBlot注意事项DIG检测试剂盒疑难问题及解决⽅案⼀、灵敏度低或信号弱的问题及解决⽅案？1.探针标记效率低：2.膜的问题：使⽤阳性尼龙膜3.杂交：增加标记探针的浓度，或减少洗涤时的严谨性4.曝光时间：增加曝光时间；使⽤⾼灵敏度的专⽤化学发光的Lumi-Film胶⽚，其他像Kodak XAR也可。
⼆、⾼背景解决⽅案?1.探针标记：纯化的DNA或RNA在标记前⽤⼄醇沉淀；确认探针对靶序列是特异性并跟其他载体⽆同源性；2.膜：推荐使⽤罗⽒或经过验证的膜(pall)、Ambion膜3.杂交：使⽤CDP-Star发光底物，最好将DIG探针浓度稀释到（RNA 20-50ng/ml）另外在杂交过程中不要让膜⼲燥4.检测过程：将抗DIG-AP的酶的浓度到由原来的1:20,000 减少到1:50,000，也不会减少酶检测的灵敏度。
增加洗脱和封闭的溶液的量和次数；膜上出现斑点可能是由于酶在膜上的凝集，需要将膜短暂离⼼后使⽤。
5.曝光时间：缩短曝光时间，通常为15-60s。
Ambion⽣物素化探针疑难问题解决⽅案⼀、探针类型、设计及标记⽅法（⼀）探针类型如何选择？1.单链DNA探针：对于传统的杂交缓冲液，单链探针的效果要好于双链探针，因为双链探针可与未标记的RNA结合，降低了探针与靶RNA结合的浓度，使杂交信号减少，另外双链探针之间可以退⽕，降低探针的浓度。
1)引物延伸法：质粒克隆或PCR产⽣的模板2)⾮对称扩增PCR:3)末端标记的寡核苷酸；优点:简单、经济，对于同源性较⾼的序列或对靶基因序列了解较少情况下适⽤。
通常在5’末端⽤多聚核苷酸激酶标记，但每⼀个分⼦仅有⼀个可标记的基团，⽐内部掺⼊标记的探针灵敏度更低，且杂交温度需要去摸索。
2.双链DNA探针：有⾼度特异性，能⽤于随机引物进⾏标签，快速和可靠。
缺点是;在杂交前需要变性。
3.RNA探针：质粒克隆表达或PCR产⽣的DNA模板进⾏体外转录合成RNA探针。
Northern blot 分析
Northern blot分析RNA的提取和电泳（1）RNA的提取：以休眠解除不同时期的花芽为植物材料，采用Aidlab的EASYspin Plus 植物RNA快速提取试剂盒分别提取不同时期花芽的总RNA。
（2）制胶：将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。
称取0.5g琼脂糖，置于干净的烧瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热融化均匀。
待胶凉至60-70℃时，依次向其中加入9ml甲醛、5ml10×MOPS buffer和0.5μl EB，混合均匀后立即灌胶（注意避免产生气泡）。
（3）RNA样品缓冲液：去离子甲酰胺50%，甲醛5%，10×MOPS1%，EB（1mg/ml）1%。
（4）样品制备：取DEPC处理过的500μl离心管，将每个样品25μg左右的RNA沉淀溶于30μl RNA样品缓冲液中，将离心管置于65℃水浴中保温10min，再置于冰上5min；每管中加入3μl甲醛凝胶加样缓冲液，混匀。
（5）上样：将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（1×MOPS缓冲液），液面高出胶面1-2mm，小心拔出梳子使样品孔保持完好。
用微量移液器将制备好的样品加入加样孔。
（6）电泳：盖上电泳槽，接通电源，样品端接负极，于3-4V/cm的电压下电泳3-4h，当溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳。
电泳结束后，即可在紫外灯下检测结果。
试剂配制：（1）10×MOPS缓冲液：200mM MOPS；50mM NaAc；10mM EDTA；调pH值为7.0，过滤灭菌后，避光保存。
（2）甲醛凝胶加样缓冲液：50%甘油；1mM EDTA（pH8.0）；0.25%(m/v)溴酚蓝；0.2mg/ml 溴化已锭（3）RNA样品缓冲液：10%10×MOPS缓冲液；17%甲醛；45%去离子甲酰胺转膜及烘膜（1）按胶块大小剪取膜一张，剪去膜一角，在DEPC水中浸湿后，置于20×SSC中浸泡至使用时取出。
NorthernBlotting实验步骤
Northern Blotting实验步骤实验概要Northern杂交采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。
但与Soughern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。
虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。
实验步骤1. 总RNA提取2. 变性胶的制备：取琼脂糖0.2g，加入DEPC H2O12.4ml，加热熔化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。
待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。
3. 样品制备：取总RNA 30μg，加入甲醛4.0μl、甲酰胺12.5μl，上样缓冲液2.5μl。
65℃温育15min，迅速冰浴5min。
然后加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0μl4. 电泳：上样，50V电泳（电泳时间约2hr左右）。
以1×甲醛凝胶电泳缓冲液为电泳液，电泳结束后转膜。
5. 将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜：（1）．在一个标准变性凝胶电泳完成后，凝胶用DMPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于2×SSC（20×SSC用DMPC-H2O稀释）中浸泡15～30min.。
（2）．构建转移平台：在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比塑料盒长，但比塑料盒窄。
剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸，将其横放在玻璃板上，滤纸两头垂入盘中，用20×SSC浸湿滤纸，并向盘中加入足量的20×SSC。
Northern Blot 实验 Protocol
Northern Blot（Northern印迹杂交）是一种用于检测RNA表达水平的方法，它通过将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，然后与特定基因互补配对的探针进行杂交，从而检测目的片段。
实验原理：Northern Blot利用了RNA的分子量大小不同，通过电泳方法将其按照大小分离，然后转移至硝酸纤维素膜上。
探针与特定的基因互补配对，当探针与目标RNA片段杂交时，可以检测到特定基因的表达情况。
所需试剂和耗材：1.RNA样品或mRNA样品。
2.探针模板DNA。
3.尼龙膜。
4.NorthernMax Kit（Cat. # 1940,Ambion, Inc.）等试剂。
实验仪器：1.恒温水浴箱。
2.电泳仪。
3.凝胶成像系统。
4.真空转移仪和真空泵。
5.UV交联仪。
6.杂交炉。
7.恒温摇床。
8.脱色摇床。
9.漩涡振荡器。
10.分光光度计。
11.微量移液器。
12.电炉或微波炉。
13.离心管。
14.烧杯。
15.量筒。
16.三角瓶等。
准备工作：1.准备好所需的试剂和耗材，确保它们在有效期内，并按照要求储存和使用。
2.确保实验区域干净整洁，并无菌操作。
3.了解和掌握实验步骤，以及如何解决可能出现的问题。
4.使用DEPC水处理相关玻璃器皿，保证无RNA酶的污染。
实验方法：1.将RNA样品进行电泳分离，根据分子量大小将RNA分子分离至琼脂糖凝胶中。
2.将凝胶中的RNA分子转印到硝酸纤维素膜上。
3.将硝酸纤维素膜上的RNA与特定基因的探针进行杂交。
4.通过底片暗盒制作X光底片，以检测RNA的表达情况。
5.对硝酸纤维素膜进行脱色处理，以便进一步检测和分析。
6.通过分光光度计测定X光底片的吸光度，以定量分析RNA的表达水平。
7.根据定量分析结果进行数据分析，绘制图表等。
注意事项：1.在实验过程中，要注意防止污染，尤其是避免交叉污染，因为这会对实验结果产生极大的影响。
2.所有溶液都应该是新鲜的，并且在使用之前应该进行充分的过滤和离心处理。
NorthernBlot原理及实验方法
Norther n Blot原理及实验方法原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而将在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的RN A探针进行反应。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
实验方法：[仪器、试剂、材料]（一）仪器恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶等。
（二）材料总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜（三）试剂：Norther nMax Kit（Cat. # 1940，Ambion,Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，RandomPrimer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free KlenowFragmen t和10 X Buffer, Sephade x G-50,SDS，双氧水,灭菌水等。
[方法与步骤]1.用具的准备：180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。
电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。
处理DEPC水(2 L)备用。
2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RN AZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZa p。
3．制胶：1．称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。
60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)2．在通风厨中加入3.6ml的10＊Denatur ing Gel buffer，轻轻振荡混匀。
Northern blot技术
核酸杂交技术(Southern Blot、Northern Blot ）（一）Southern Blot 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二…（一）Southern Blot原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
（二）Northern Blot原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。
（三）探针标记技术1 标记物：放射性和非放射性两种放射性：非放射性：生物素、地高辛素、荧光素2、标记方法（1）切口平移法（2）随机引物法（3）末端标记法（4）单链DNA探针标记（5）寡核苷酸探针标记法northern blot简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。
“Northern blot”这一术语实际指的是RNA分子从胶上转移到膜上的过程，当然它现在通指整个实验的过程。
northern blot的实验流程
按大小分离RNA:在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA电泳1. 试剂及其配制1)甲醛（37%-40%溶液，12.3mol/L）：配制100ml,37-40ml的甲醛溶液，加入DEPC处理的水定容到100ml。
2)甲酰胺（去离子）3)10×MOPS电泳缓冲液（1L）a)将41.8g的MOPS溶解于700ml灭菌的DEPC处理的水中，用2N的NaOH调整到pH值为7.0。
b)加20mlDEPC处理的1mol/L的乙酸钠和20ml DEPC处理的0.5mol/LEDTA（pH=8.0），用DEPC处理的水将溶液的体积调整到1L。
c)通过一个0.45um的微孔滤膜过滤灭菌溶液，同时，将其在室温下避光贮存。
4）RNA Loading Buffer (+EB)：TaKaRa2．配制含有2.2mol/L 甲醛的琼脂糖凝胶（100ml 1.5%)1)称量0.375g 琼脂糖到18ml灭菌水中,用微波炉法溶解琼脂糖，将溶液冷却至55℃。
2)加入2.5ml 10×MOPS电泳缓冲液，4.5ml去离子甲醛，在化学通风橱中灌制凝胶。
3.处理样品以及RNA marker向4μl的RNA样品（RNA maker同理）中加入4μl RNA loading buffer，震荡混匀厚稍离心，然后65℃水浴10min，速冷后即可使用。
4.电泳电泳槽中加入1×MOPS缓冲液，于4~5V/cm电压下电泳，大约1h左右。
变性RNA在膜上的转移和固定1 转移胶的制备：1)用DEPC处理的水淋洗胶。
2)将胶浸入5倍体积的0.01mol/L NaOH-3mol/L NaCl中20min。
3)将凝胶转移至一个玻璃干烤皿内，用锋利的刀片修去凝胶的无用部分以保证胶与膜对齐。
4)用长和宽均大于凝胶的玻璃板作为平台，将其放在大干烤皿内，上面放一张滤纸。
5)于干烤皿内倒入相应的转移缓冲液（带正电荷的膜用0.01mol/L NaOH-3mol/LNaCl）直至液面略低于平台表面，当平台上方的滤纸完全湿透后，用玻璃棒或移液管赶走所有的气泡。
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合成DNA探针步骤：
（具体参考Roche DIG DNA Labeling and Detection Kit）
1. PCR、凝胶电泳分离目标片段，克隆后测序或者直接把胶回收产物取一部分送测以检验序列是否准确。
（注：假如以前已经测定过该片段，不必反复送测）
2. 20μl体系
10 ng至3 μg DNA，加双蒸水至15μl，盖紧用蜡封好。
沸水浴10分钟以使DNA变性，迅速置于冰中。
Note: Complete denaturation is essential for efficient labeling.
3 加入以下试剂：
Hexanucleotide Mix, 10 × (vial 5) 2 μl
dNTP Labeling Mix (vial 6) 2 μl
Klenow enzyme labeling grade (vial 7) 1 μl
混匀，短暂离心。
37° C孵育1 h 到20 h (overnight)，一般为16-18小时
4加入2 μl 0.2 M EDTA (pH 8.0) 或于65° C 加热10 min以终止反应。
Note: The length of the DIG-labeled fragments range from 200 to 1000 bp.
合成RNA探针步骤：
（具体参考Roche DIG RNA Labeling Mix, 10 × conc.）
过程应保证无RNA酶的环境。
1. PCR、凝胶电泳分离目标片段，克隆后测序，需向公司说明测序结果要带上SP6、T7的序列，RNA探针是单链的，选择使用哪个启动子至关重要。
假如northern blot的对象是单链RNA，合成的RNA探针序列就必须与它互补。
呼肠孤病毒基因组为双链RNA，因此不需要考虑这个问题。
2. 提纯质粒，酶切以进行线性化
3. 转录：
在冰上加入以下试剂：（20μl体系）
1 μg 线性化的质粒DNA x μl
DIG RNA labeling mix, 10 × 2 μl
Transcription buffer, 10 × 2 μl
加无RNA酶的水至总体积为18 μl
RNA polymerase (SP6, T7 or T3) 20 U/μl 2 μl
混匀，短暂离心。
37° C孵育2 h.
4. 消化DNA
加2 μl RNase-free DNase I
37° C孵育15 min
Note: Only required for RNase-protection experiments!
5. 加2 μl 0.2 M EDTA (pH 8.0)终止反应。
6. 纯化，见说明书。