HE染色和免疫组化步骤

二十四、HE染色：

1›伊红染液配方：

称取伊红2 g，溶于5 ml 蒸馏水，逐滴加入冰醋酸，边加边搅拌至糊状，再加入数毫升蒸馏水，继续滴加冰醋酸至沉淀不再增加，过滤，将沉淀和滤纸一起置于50-60℃温箱中烘干，溶于400 ml 95%的酒精中。

2›苏木精染液配方：

A液：苏木精2 g ；无水乙醇250 ml 。B液：钾矾（硫酸铝钾）17.6 g；水750mL 。

具体步骤：

分别按以上配方配好A液和B液，并混合后加入碘酸钠0.2g，冰醋酸20mL染液配好后，将瓶口用裹着棉花的纱布塞紧，放在暗处通风的地方，并经常摇动以促进它的成熟。成熟时间约1个月。此染液需要提前1个月配置好，备用，如果想要促进它的成熟，可在染液里加入0.2 g碘酸钠。此染液染核效果良好，染色均匀，不会发生沉淀，而且可以长期稳定保存。此染液可同时与伊红等进行细胞的染色。

整个染色过程包括五个内容：脱蜡复水、染色、脱水、透明和封片。1›脱蜡复水：a. 65℃温箱烤片30min后, 石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min,

b. 石蜡切片依次各级浓度酒精复水：经100%酒精→100%酒精→95%酒精→80%酒精→70%酒精→50%酒精→蒸馏水，各1-2 min。2›染色：a. 苏木精染色约4min。染色时间主要根据染色剂的成熟

度以及室温高低，可以适当缩短或延长（现在的成熟度4min左右）。

b. 水洗5-10min

c. 脱水Ⅰ切片经50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇，各1-2 min。

d. 复染伊红染色10s-20s ，着色以较浅为宜。

3›脱水Ⅱ：用95%乙醇洗去切片多余的红色，然后放入100%无水乙醇两次各1.5 min，共3min。

4›透明：切片依次经乙醇-二甲苯等量混合液1.5min、纯二甲苯Ⅰ5min、Ⅱ5min。二甲苯要定期更换，切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。

5›封片滴加中性树胶，注意组织不能有气泡。轻压盖玻片可赶走气泡。

二十六、免疫组化

1›脱蜡复水a. 65℃温箱烤片30min后, 石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min,

b. 石蜡切片依次各级浓度酒精复水：经50%酒精+50%二甲苯→100%酒精→100%酒精→95%酒精→80%酒精→70%酒精→50%酒精→蒸馏水，各90s。

2›抗原修复：10 mM柠檬酸钠微波炉高火保持沸腾不少于20 min，沸腾需要8-10分钟，大约共30min。一般每次7min，四次。

3›PBS清洗2-3次，每次2 min，注意力度，你可用力过大，组织不能干。

4›封闭：滴加3%H2O2，现用试剂盒阻断剂，室温避光孵育10-15 min，阻断内源性过氧化物酶的活性。

PBS清洗3次，每次2min 。

5›孵育一抗：将一抗按一定比例稀释（需摸索，大多抗体1：:100稀释较好，稀释液可为PBS或一抗稀释液），37℃孵育2h或4℃过夜。6›PBS清洗3次，每次2 min。

7›滴加试剂盒增强剂室温孵育20min，PBS清洗3次，每次2 min。8›孵育二抗：将二抗按一定比例稀释（1:200），室温静置或37℃1 h或直接购买中杉金桥的即用型二抗试剂，37℃30min。

9›PBS清洗3次，每次2min。

10›DAB显色：将A、B液按一定比例（1:20）混匀，在显微镜下掌握染色程度，出现黄色立即终止染色。一般5min-10min。肉眼观察有颜色差异即可终止染色，一般不超过10min，染色时间灵活，最短有过2min。现配现用。

11›自来水冲洗5-10 min。

12›复染：苏木精复染约90 s(颜色要浅) 。

13›PBS或自来水冲洗5-10 min。

14›脱水、透明：石蜡切片依次经各级浓度酒精脱水：经50%酒精→70%酒精→80%酒精→90%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精→50%酒精+50%二甲苯各90s。

→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ，各5 min。

15›封片、镜检