水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定 分光光度法-编制说明
壳聚糖的分子量
壳聚糖的分子量
壳聚糖分子量可采用黏度法、凝胶色谱法和端基法测定.黏度法适合于大分子壳聚糖分子量测定,凝胶色谱法可以测定壳聚糖的重均分子量、数均分子量和分子量分布.端基法只能用于测定壳寡糖数均分子量,
1.重均分子量（Mw）、重均分子量（Weight-average Molecular Weight）：所有合成高分子化合物的分子量以及大多数天然高分子化合物的分子量都是不均一的，它们是分子量不同的同系物的混合物。
定义:聚合物中用不同分子量的分子重量平均的统计平均分子量。
Wi ：相应的分子所占的重量分数。
重均分子量与门尼粘度密切相关，因此常以门尼粘度的高低来显示出弹性体分子量的大小。
测定方法有光散射法、超速离心沉降速度法以及凝胶色谱法等。
mi是分子质量Mi是相对分子质量ni 应该指的是分子数 wi是质量分数
2.数均分子量（Mn）
3.粘度平均分子量( Mv )用Geo rge等人修订的Mark-Houwink公式计算:
[η]= 1. 81×10-3Mv0. 93
4.Z均分子量。
还原糖与总糖
实验一还原糖和总糖含量的测定原理3，5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范实验围内还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，可用比色测定。
操作简便，快速，杂质干扰较少。
实验方法一葡萄糖标准曲线的制定葡萄糖标准曲线的制定：准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移至100mL容量瓶中，再定容至刻度，摇匀。
浓度为1mg/Ml。
取9支25mm×250mm的试管，分别按下表加入试剂：（ml）项目0 1 2 3 4 5 6 7 8G标液0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 G的量0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 H2O 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 3，5-二硝基水杨酸加入21.5mL蒸馏水,摇匀。
于520nm波长处测A值。
以葡萄糖mg数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
二样品中总糖和还原糖含量的测定以测定山芋中总糖和还原糖含量为例。
1．样品中还原糖的提取：准确称取2g山芋粉，放在100mL烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加工50-60mL蒸馏水，于50o C恒温水浴中保温20分钟，过滤，将滤液收集在100mL 容量瓶中，再定容至100mL。
2．样品中总糖的水解及提取：准确称取1g山芋粉，放在锥形瓶中，加入10mL6mol/L 盐酸，15mL水，在沸水浴中加热半小时，取出一、二滴置于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液检查水解是否完全。
如已水解完全，则不呈蓝色。
冷却后加1滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色，过滤并定容到100mL。
再精确吸取上述溶液10mL于100mL 容量瓶中，定容到刻度，混匀备用。
3．样品中糖含量的测定：取7支队5mm×250mm试管分别按下表加入试剂：加完试剂后，其余操作均与制作标准曲线时相同。
水溶性羧甲基壳聚糖的制备及其应用
节至中性 , 用7 5 % 甲醇水溶液洗涤 "此方法的特
点是碱用量少 , 操作简单 , 可以制备质量均一的 产品 , 但反应介质较贵 "
2 .3梭 甲基壳聚糖梭化度测定方法
梭 甲基壳聚糖梭化度 , 梭化位置直接影响其
溶解性 ! 乳化性 ! 与金属的鳌合性 ! 吸湿和保湿 性等 "氯乙酸在碱性条件下与壳聚糖的C 6 一 OH 和 CZ 一 N HZ 均可发生取代反应 , 所以最终产物是各种 梭 甲基壳 聚糖的混合物统称N , O 一 梭 甲基壳 聚糖 (C ar boxym et hyl 一 ehi t osan , 简称N ,o 一 e M e ) "关于
. 3 .1电导滴定法 2
称取一定量的N , O一 C M C 溶于蒸馏水中 , 并加
入N aO H 标准溶液 , 转移至 电导池 中通N Z, 在 磁 力 搅拌 下用标 准盐 酸滴 定 同时测 定 电导 率 " 以标 准 盐酸的体 积与电导率作图 " 其梭化度( D S ) 计算式如
下:
D S= A x 0 . 203/ ( l+0 . 022B 一0. 8 OA ) 0
存在(一 C o o N a和一 coo H ) , 此计算式只适 用于梭 甲
基壳聚糖 完全 以R 一 C O O H 形式存在 "
误差 " 另外 , 此方法操作比较繁琐 " 2. . 3离子选择电极法 3
准确称取干燥的c M 一 e h it n 样 品1. i 3 9一 1. 5 9置
3 轻 甲基壳聚糖的应用
接块或戮稠 , 不利于传质进行 , 影响反应效果 " 反应结束后 , 产品是溶液状态 , 不能直接洗涤 , 需要用超滤膜透析除去小分子杂质 , 处理麻烦 "
3,5—二硝基水杨酸法测定还原糖总结
四、操作步骤
（四）小麦样品中总糖和还原糖的测定 1.取3支试管，编号分别为 1-3 ，按下表向每支试管中加入试剂。 管号
试剂
还原糖抽提液（ml） 总糖抽提液（ml） DNS(ml) 水（ml）
1
0 0 0.5 4.5
2
0.5 0 0.5 4
3
0 0.5 0.5 4
2.将3支试管放入沸水浴中加热煮沸 5min后，冷却。 3.以空白试管（1号管）作对照，于 540nm 波长下，分别测定各管 OD 值并记录。
三、试剂与仪器
（3）3，5—二硝基水杨酸 把 6.3g3，5—二硝基水杨酸溶于 262ml 2 mol/l 的氢氧化钠中将此溶液与500ml 含有 182g 酒石酸钾钠的热水混合，向该溶液中加入 5g 重蒸 酚和 5g 亚硫酸钠，充分搅拌溶解待溶液冷却后， 用水稀释到 1000ml，存储于棕色瓶中。
三、试剂与仪器
（一）仪器
小麦面粉、pH 试纸、容量瓶、玻璃漏斗、移液 管、量筒、试管、沸水浴锅
（二）试剂
（1）6mol/l HCl 和 6mol/l NaOH溶液 （2）1mg/ml葡萄糖溶液 准确称取 80℃烘干恒重的分析纯葡萄糖 0.1g，置于小 烧杯中加入少量蒸馏水溶解后，移到 100ml 容量瓶中，用蒸 馏水定溶至 100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用。
二、实验原理
• 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及产物，3 ，5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝 基水杨酸。 • 在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深 浅成正比关系，利用分光光度计在 540nm 波长下 测定光密度值查对标准曲线并计算，便可求出样品 中还原糖和总糖的含量。
3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖
四种糖的测定方法
四种糖的测定方法
1. 莫尼酮试剂法（Benedict试剂法）
莫尼酮试剂法是测定还原性糖（如葡萄糖和果糖）的常用方法。
该方法利用莫尼酮试剂中的铜离子与还原性糖发生氧化还原反应，生成红色或黄色的沉淀。
根据沉淀的颜色来定量测定糖的含量。
2.酚硫酸法
酚硫酸法是测定非还原性糖（如蔗糖和乳糖）的一种方法。
该方法利用硫酸和酚的作用来将糖酸化，生成暗红色的化合物。
通过比色法来测定溶液的吸收值，然后通过标准曲线计算出糖的含量。
3.高效液相色谱法（HPLC）
高效液相色谱法是一种精确测定各种糖的含量和成分的方法。
该方法使用高效液相色谱仪来分离糖，并使用UV检测器来检测糖的吸收峰。
根据吸光度与浓度的关系，以及外部标准曲线，可以定量测定糖的含量。
4.旋光法
旋光法是一种测量光学活性糖（如葡萄糖和果糖）的方法。
光学活性糖分子可以使光线在通过时转动其振动平面。
旋光仪可以测量这种旋光现象，并根据旋转角度和样品底物的厚度来计算样品中的糖含量。
以上是四种常见的糖的测定方法。
根据不同的糖类和实验需求，可以选择适合的方法进行测定。
这些方法在食品工业、生化研究等领域起着重要作用，帮助人们更好地了解和利用糖的性质和功能。
第二讲糖分析方法
第二讲糖的分析方法一、中性糖的测定1．还原糖的次亚碘酸盐定量法适用：各种醛糖；适用于测定淀粉酶解时糖苷键水解的百分率，也可测定淀粉酶产物的寡聚糖链长。
基本反应：CH2OH(CHOH)n CHO+I2+3NaOH→CH2OH(CHOH)nCOONa+2NaI+2H2O (氧化)I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+ NaI (滴定) 2．3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法原理：在碱性溶液中，3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色氨基化合物，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。
注意：该法不是化学计量反应，戊糖、已糖和双糖与DNS反应的生色度A500/μmol糖的值分别是：戊糖（木糖、阿拉伯糖）：0.42；已糖（葡萄糖、半乳糖、甘露糖）：0.46；双糖（麦芽糖、乳糖）：0.65。
有人认为还原糖的醛基被氧化为羧基，但当量不准确，不同的糖类产生不等等量的色度，表明它的化学反应是较复杂的。
3．Somogyi-Nelson法还原糖将铜试剂还原成氧化亚铜，在浓硫酸存在下与砷钼酸生成蓝色溶液，在560nm下的光密度与还原糖浓度呈比例关系。
注意：比方法重复性较好，产物稳定，测定范围10-180μg/mL。
4．苯酚-硫酸法苯酚-硫酸试剂可与游离的或寡糖、多糖中的已糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）起显色反应，已糖在490nm处，戊糖及糖醛酸在480nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。
注意：（1）该法颜色持久，较稳定；（2）每种糖的显色值不同，故不宜直接用于杂多糖的定量测定；分析杂多糖时，可根据各种单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。
（3）有颜色的样品，测定值偏高；（4）此法较适于检测凝胶柱部分收集样品中相对糖量的分析。
5．蒽酮-硫酸法糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生颜色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收，显色与多糖含量呈线性关系。
果蔬中还原糖与总糖的测定
果蔬中还原糖与总糖的测定果蔬中总糖及还原糖含量的测定一、实验目的1、掌握总糖和还原糖含量的测定方法。
2、学习分光光度计的原理和操作方法。
3、了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理。
二、实验原理总糖是指样品中的还原单糖，在本实验条件下可水解为还原单糖的蔗糖和麦芽糖，以及可部分水解为葡萄糖的淀粉。
多糖为非还原糖，可用酸将没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，再利用还原糖的性质进行测定，这样就可分别求出总糖和还原糖的含量。
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糖醛，生成的糖醛或羟甲基糖醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糖醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比。
糖类与蒽酮反应生成的有色物质，在可见光区的吸收峰为630nm，可在此波长下进行比色，故可用于糖的定量。
三、实验器材1、材料：梨2.仪器：分光光度计、恒温水浴、电子分析天平、高速冷冻离心机、容量瓶（100ml）×2）玻璃漏斗、量筒、灰浆、锥形瓶、试管、移液管、pH试纸3。
试剂：蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于1000ml体积分数为80%的硫酸中，当日配制使用。
标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：称取100mg葡萄糖，溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可加几滴甲苯作防腐剂）。
6mol/lhcl溶液20%氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠固体，溶于蒸馏水中，稀释至100ml。
4、实验操作1、葡萄糖标准曲线的绘制：取6根大试管，从0到5编号，按下表加入每种试剂试剂管号标准葡萄糖溶液/ml蒸馏水/ml蒽酮试剂/mla620nm01.04.00.10.94.00.20.84.00.30.74.00.40.64.00.50.54.0012345置冰水浴中5min煮沸10min，冷却后室温放置10min，在620nm处比色以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/ml）为横坐标做图得标准曲线。
2、样品中还原糖的提取和测定称取1g梨，加入约3ml蒸馏水，在研钵中研磨成匀浆，移入三角瓶中，用约12ml蒸馏水冲洗研钵2~3次，将洗涤液移入三角瓶中。
端羧基测定
端羧基测定全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：端羧基测定是一种常用的化学分析方法，用于确定样品中端羧基（carboxyl）基团的含量。
端羧基是一种重要的官能团，存在于许多天然和合成化合物中，包括有机酸、蛋白质、多肽和药物等。
端羧基的测定在许多领域具有重要的应用价值，例如在医药、食品、环境和化工等领域中。
端羧基测定的原理是利用端羧基与某种化学试剂之间的反应来进行定量或半定量的分析。
常用的端羧基测定方法包括氧化-还原滴定法、紫外-可见分光光度法、荧光光谱法、红外光谱法、核磁共振法等。
氧化-还原滴定法是最常用的一种端羧基测定方法，其原理是将待测样品与能氧化端羧基的溴酸溶液反应，生成二碳酸酯，然后用过量的亚硫酸钠溶液滴定未反应的溴酸，从而确定端羧基的含量。
这种方法简单易行，准确性高，适用于大多数样品的测定。
紫外-可见分光光度法是另一种常用的端羧基测定方法，其原理是利用端羧基在特定波长下吸收紫外或可见光的特性来进行测定。
这种方法对于端羧基较强吸光的化合物具有较高的灵敏度和选择性，适用于含有芳香环结构的化合物的测定。
端羧基测定是一种重要的化学分析方法，具有广泛的应用价值。
通过端羧基测定，我们可以准确地确定样品中端羧基的含量，进而对化合物的结构和性质进行分析和鉴定。
在今后的研究和实际应用中，端羧基测定将继续发挥其重要的作用，为各行各业的发展和进步做出贡献。
第二篇示例：端羧基测定是一种用于测定物质中端羧基含量的方法，被广泛应用于化学、生物、医药等领域。
端羧基是一种通过一个碳氧键连接到碳链上的碳氧羰基，是有机物分子中常见的官能团之一。
端羧基在化学反应、生物代谢等过程中都起着重要作用，因此对其准确测定具有重要意义。
端羧基测定的方法有多种，常用的有气相色谱法、高效液相色谱法、红外光谱法、核磁共振法等。
每种方法都有其特点和适用范围，选择合适的方法进行端羧基测定可以获得准确的结果。
气相色谱法是一种常用的端羧基测定方法，其原理是通过气相色谱仪对样品中的化合物进行分离和定量分析。
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国家标准《水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法》编制说明（一）工作简况，包括任务来源、协作单位、主要工作过程、国家标准主要起草人及其所做的工作等；1、任务来源本标准根据国标委公布的2018年第四批国家标准计划项目（国标委发[2018]83号），本项目计划编号为20184458-T-469，名称为水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法。
本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC 387）提出并归口。
本标准由等联合起草。
2、目的和意义水溶性壳聚糖是由壳聚糖水解得到的一类具有生物活性的低聚合度壳聚糖, 具有抗氧化、提高免疫力、抑菌、降血糖等生物学作用, 它不仅溶于酸性溶液，还可溶于中性溶液和碱性溶液，因此被广泛应用于食品、医药、农业、化妆品等领域。
3、协作单位4、标准编制过程和主要工作过程（1）2017年9月至2018年2月，标准起草单位组织相关技术人员对“水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法”标准项目进行了预研。
根据国家制修订有关程序和要求，2017年12月下旬，青岛科技大学主持在青岛召开了《水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法》国家标准制定研讨会。
会上，组成了标准起草工作组，进一步明确了任务要求，根据研究内容详细安排了工作进度，并成立了标准起草工作小组。
会议研究讨论了《水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法》初稿，对起草小组在标准起草过程中的一些思考及难点问题进行了深刻讨论，各单位代表结合各自的优势和特长就标准内容及方法选择进行了讨论，为“水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法”标准制定奠定了必要的基础。
课题组成员广泛收集了国内外标准、文献，了解了国内外相关技术动态，并且明确了工作思路和进程安排。
（2）2018年3月标准起草单位在收到全国生化检测标准化技术委员会文件后，提交了项目建议书以及国家标准草案。
（3）2019年1月收到全国生化检测标准化技术委员会生检标[2019]1号文件以及该标委会转发的国标委发[2018]83号《国家标准委关于下达2019年第四批国家标准制修订计划的通知》立项文件，计划编号：20184458-T-469。
5、国家标准主要起草人及其所做的工作5.1 青岛科技大学的张永勤、吕兴霜、张凤国、邢明霞、许文廷、王家林负责该标准项目的前期调研、方法建立及优化以及标准中方法的起草工作；5.2 中国测试技术研究院的周李华，青岛科技大学的张永勤负责方法验证和标准修订工作；5.3 青岛市计量技术研究院的夏春、李剑负责实验过程的量值溯源工作；5.4 青岛正大农业发展有限公司、武汉新华扬生物有限责任公司、青岛蔚蓝生物基团有限公司的毕毅奋、王斐、詹志春、邵静、张菁、周樱、徐丽、宋雅丽、李玉奎、刘安邦等人负责样品测试工作。
（二）国家标准编制原则和确定国家标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等）的论据（包括试验、统计数据），修订国家标准时，应增列新旧国家标准水平的对比；1、标准编制原则（1）依据：本标准的编制依据GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》，并参照GB/T 6379.1-2004《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分总则与定义》和GB/T 6379.2-2004《测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法》。
（2）科学性壳聚糖是最有应用价值的糖类之一，目前它已广泛应用于医药、食品、环境、纺织、化妆品、生物技术、环境治理、生物医学材料等领域，其降解产物水溶性壳聚糖，即，壳聚糖的低聚、寡糖糖，则显示了更高的生物学活性，如有抗菌、抗肿瘤、抗氧自由基、抗癌、降脂、抗血凝、抗酸、抑菌、抗溃疡、增强免疫等生物活性。
该类分子结构中含有大量氨基基团，使得该类产品在应用和保藏期间较易被氧化而变质，并失去生物活性。
所以，糖类分子中还原性端基糖的含量是该类产品的关键质量和技术指标，另外也是壳聚糖酶的酶活力测定的重要技术指标，因此，糖类分子中还原性端基糖含量测定方法的准确性、可靠性是至关重要的。
我国最新修订的食品中还原糖的测定方法“GB 5009.7-2016 食品安全国家标准食品中还原糖的测定”共包含直接滴定法、高锰酸钾滴定法、铁氰化钾法和奥氏试剂滴定法四种滴定法。
实验步骤繁琐冗长，不利于还原性端基糖的大批量测定，而已沿用半个世纪的可见分光光度法中的DNS法则可弥补这些缺陷，然而由于该法存在灵敏度较低、标准曲线远偏离原点、非化学计量等问题已严重影响了测定的准确性，因此，该法并未被纳入国家标准，这实际上已经成为阻碍糖类行业发展的瓶颈问题。
而本标准项目“水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法”则可解决上述问题。
（3）前瞻性在标准编制的设计中，将“还原性端基糖”的概念引入标准以代替传统意义上的“还原糖”的概念，以满足不同聚合度的水溶性壳聚糖样品的检测需求。
这是因为，目前所采用的还原糖的测定方法一般是以某种还原性单糖作为还原糖的代表，以还原性单糖，如氨基葡萄糖的质量浓度或质量分数作为待测样品中还原糖含量的计量方法，而实际上，所测得的还原糖的量包含了所有具有还原性末端的糖类分子的量，因此，mol/g或mol/L既可以代表还原性端基糖的量又可以代表具有还原性末端的糖类分子的量，而非传统意义上人们由于惯性思维而想到的葡萄糖或其它还原性单糖。
既然以摩尔来计量，即可用于测定和比较所有具有不同聚合度的还原性端基糖的水溶性壳聚糖样品，对其他水溶性糖的还原端基糖的测定具有借鉴价值，从而提高了测定方法的普适性和前瞻性，避免标准的重复制定。
（4）适用性该标准方法的优点在于： 1. 更准确，符合化学计量规则，其摩尔吸光系数不因底物聚合度的改变而改变，明显优于DNS法； 2. 非还原性杂质干扰小，超高的稀释倍数使得杂质浓度极低而免于对测定的干扰，可用于食品级市售壳寡糖的还原性端基糖的测定。
（5）可操作性与现行的“GB 5009.7-2016 食品安全国家标准食品中还原糖的测定”中所采用的滴定法相比，更便于大批量测定，节省人力物力和财力。
2、确定国家标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等）的论据（包括试验、统计数据）2.1指标的建立水溶性壳聚糖是一类既可以溶于酸溶液，又可以溶于中性和碱性水溶液的壳聚糖的降解产物，其聚合度为为2~30。
该类分子结构中含有大量氨基基团，使得该类产品在应用和保藏期间较易被氧化而变质，并失去生物活性。
所以，糖类分子中还原性端基糖的含量是该类产品的关键质量和技术指标，另外也是壳聚糖酶的酶活力测定的重要技术指标，因此，糖类分子中还原性端基糖含量测定方法的准确性、可靠性是至关重要的。
该项目主要研制内容包括分析方法的选择、显色剂及其浓度和加量、显色温度和时间、测定波长及测定时间、公式和计算方法等。
2.2 分析方法及其条件的选择与优化2.2.1 分析方法的选择根据文献调研和报道，可见分光光度法适用于水溶性壳聚糖中还原端基糖含量的检测。
我国最新修订的食品中还原糖的测定方法“GB 5009.7-2016 食品安全国家标准食品中还原糖的测定”共包含直接滴定法、高锰酸钾滴定法、铁氰化钾法和奥氏试剂滴定法四种滴定法。
实验步骤繁琐冗长，致使测定效率低下，不利于还原性端基糖的大批量测定，而可见分光光度法中的DNS法则可弥补上述缺陷，然而，该法标准曲线远偏离原点（如图1所示）、且不同聚合度的还原糖存在非化学计量问题，因而，国标并未将该法纳入国标还原糖的测定。
而经本起草工作组研制的“水溶性壳聚糖中还原性端基糖的测定分光光度法”则可解决上述问题，该法在已报道的还原糖测定方法的基础上，对反应时间、DTT 浓度、测定波长及测定时间进行了优化，图2为经各参数优化后制作的标准曲线。
MBTH 法与DNS法相比，标准曲线过原点，不会因待测样品稀释倍数不同而造成测定值的明显差别。
图1. DNS法氨基葡萄糖标准曲线（左图为各波长下标曲的斜率、R2和截距，右图为540nm所测标曲）图2 MBTH 法氨基葡萄糖标准曲线（左图为各波长下标曲的斜率、R2和定量限，右图为590nm 所测标曲）2.2.2 氨基葡萄糖测定条件的选择本起草工作组所研制的方法（图2中的右图）是在显色剂及其浓度和加量、显色温度和时间、测定波长及测定时间的优化基础上获得的，利用图2中的左图即可确定测定波长。
水溶性壳聚糖的还原性端基糖可以与MBTH 试剂以及硫酸铁铵试剂生成青蓝色化合物，还原端基糖的浓度在一定范围内与其颜色强度呈正比例线性关系。
根据前期试验结果，本方法设定MBTH 反应温度范围为80℃、反应时间范围为13分钟，其中MBTH 试剂中DTT 的浓度为0-1.4mg/mL ，通过水溶性壳聚糖还原端基糖的测定分析确定最终体系的DTT 浓度。
DTT 的优化结果如图4所示，该图为采用酶标板来研究DTT 浓度对盐酸氨基葡萄糖标准曲线的斜率、R2、截距、显色时间稳定性的影响。
另外，定义SEN=斜率，COR=1000*（1-R 2），INT=1000*截距；定义11i t t S E N S E N S E N i --=△，11i t t COR COR COR i --=△，11i t t INT INT INT i --=△，其中t 1为40min ，i=2-15（t i 分别对应50min-180min ）。
其中，SEN 表示斜率，斜率越大，灵敏度越高，COR 表示R 2，COR 越小，标准曲线线性越好，INT 表示截距，INT 越小，标准曲线更过原点，△SEN 、△COR 、△INT 分别表示斜率稳定性、R 2稳定性、截距稳定性，这些量越小，稳定性越好。
根据图3，并依据SEN 越大，COR 、INT 、△SEN 、△COR 、△INT 越小，所得到的标准曲线斜率更高，线性更好，更过原点，时间稳定性好，将优势组的选择总结成表1，综合各方面考虑，最终选择5号即DTT 为0.8 mg/mL 用于盐酸氨基葡萄糖标准曲线的实验，测定时间以显色后60-100分钟测定为宜。
图4 DTT浓度对盐酸氨基葡萄糖标准曲线的斜率、R2、截距、时间稳定性的影响表1 DTT优化的优势组波长（nm）630SEN 2,3,4,5COR 2,3,4,5,7INT 2,3,5,7△SEN 5,6,7△COR 2,3,4,5,7△INT 2,5,6,7综合优势组 5图4为在该优化条件下所得显色产物的扫描波谱，其标准曲线如图2所示。
图4. 最有条件下所测显色产物的扫描波谱2.2.3 水溶性壳聚糖的还原端基测定波长的优化氨基葡萄糖的标准曲线和水溶性壳聚糖的还原端基的回归曲线必须都过原点才能得到较准确的测定值。