westernblot原理及操作方法剖析
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Western blot
• • • • •
原理 分类 主要试剂 操作步骤 常见问题
原理
Western Blot（蛋白免疫印迹）采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE)，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝 酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能 保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的 蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同 位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测 电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 。
常见问题
3. 加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界 面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在 同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制 作用。也可以覆盖一层无水乙醇。
常见问题
4. 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜保湿，避 免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 5.膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路 6.电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温 7.切滤纸和膜时，一定要戴手套，因为手上的蛋白会污 染膜
主要试剂
4. 10% 十二烷基硫酸钠SDS溶液 是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂 去蛋白质电荷； 断裂分子内和分子间的氢键，取消蛋白分子内的疏水作用； 使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构，常温保存。
主要试剂
5. 10% 过硫酸铵（AP） 催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺， 4℃保存， 一周内使用 0.1g过硫酸铵溶于1mlddH2O中
Hale Waihona Puke Baidu
主要试剂
8.10×转印Buffer（贮存液） 4℃保存 • 10×转印Buffer（贮存液）的配制： • 0.25 M Tris 30.28 g • 1.92 M Glycine 144.13 g • 三蒸水定容至 1000 mL • 1×Transfer Buffer（工作液）： • 10×Transfer Buffer 100 mL • 三蒸水 700 mL • 20 % 甲醇 200 mL
操作步骤
7.PVDF膜的免疫学检测 PVDF膜经5%脱脂奶室温封闭1 h→一 抗4℃温和震荡过夜→TBST洗涤三次→HRP标记二抗室温温 育1 h→TBST洗涤三次后，应用化学发光底物检测试剂盒进 行检测 8.结果分析 以GAPDH为内参照，以靶蛋白/内参照灰度的 比值作为蛋白的相对表达含量，进行半定量检测
主要试剂
13.封闭缓冲液 封闭膜上的非特异性蛋白结合位点，防止一抗、二抗 的非特异性反应 • TBST Buffer 100 mL • 5 % Nonfat Milk 5g 14.一抗 15.二抗：羊抗兔IgG/HRP（辣根过氧化酶） 使试剂中的发光物氧化并发光 16. ECL检测试剂
操作步骤
提取总蛋白
主要试剂
在SDS－PAGE不连续电泳中，浓缩胶其pH环境呈弱酸 性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率 低；而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带， 蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成 反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分 子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶 后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动 速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的 缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和 分子大小进行分离。
常见问题
1.分离胶浓度 根据目的蛋白分子量选择胶的浓度
蛋白分子量 (kDa) 4-40 12-45 10-70 15-100 25-200
凝胶浓度 (%) 20 15 12.5 10 8
常见问题
2. 在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性,这是为了控制慢 离子的解离度,从而控制其有效迁移率.要求在样品胶和浓 缩胶中,慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低,以使样 品夹在快、慢离子界面之间,使样品浓缩.而在分离胶中慢 离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高,使样品不再 受离子界面的影响.
主要试剂
1.ddH2O 2.30% 丙烯酰胺混合液 丙烯酰胺(arc)29g和N，N’-亚甲双丙烯酰胺(bis)1g加H2O 至100ml。储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超 过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用 期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可 以过滤。 为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电 泳成功与否。
主要试剂
6.四甲基乙二胺TEMED 催凝剂，加速AP催化作用，在聚合过程中，TEMED催化过 硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲 叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成 三维网状结构
主要试剂
7. 8×SDS-PAGE Loading Buffer溶液（上样缓冲液） loading buffer的功能主要有两个： 第一，里边的指示剂溴酚蓝起到指示的作用，它是一个较 小的分子，可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前 沿位置，以便我们适时终止电泳； 第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使其沉降到点 样孔中，防止样品飘出点样孔。 SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结 合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液， 加loading 100℃加热，也是为了中止酶促反应，防止提取 的蛋白质降解。
主要试剂
9.甲醇 转膜液中主要是降低电导的作用，防止转膜溶液过 热。 10.聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜 PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非 常适合于低分子量蛋白的检测，用前需在甲醇中浸泡，以 活化膜上 的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。
抗原
生物素标记 的二抗 一抗
ECL发光试剂
分类
• SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝 胶电泳） • native-PAGE（非变性聚丙烯酰胺凝胶）
区别在于加不加变性剂（比如SDS）使蛋白质变性，SDSPAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式特别是用于蛋 白质纯度检测和测定蛋白质分子量
蛋白浓度测定
SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳
一抗
封闭
转膜
洗涤
二抗
洗涤
分析
扫描
ECL检测
操作步骤
1.细胞总蛋白提取及定量 2.配胶 3.制胶 先用1ml枪头小心铺12%分离胶，上加少许ddH2O，待 分离胶干凝后，倒去ddH2O ，用滤纸吸干。再铺8%浓缩 胶，注意不要产生气泡，斜插上梳子，待胶干后备用， 拔去梳子。 4.上样 所有上样孔均加样，没有样本，用上样缓冲液代替。 5.电泳 取40 μg蛋白经8%浓缩胶电泳80V 30min，12%分 离胶电泳110V 90min。 6.转膜 电泳结束后，切除浓缩胶，按照负极-3张滤纸-分离 胶-PVDF滤膜--3张滤纸-正极的顺序，组装电转膜体系， 100V 转膜25min。
主要试剂
3. 配胶缓冲液系统 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCL(pH 8.8) ； 浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris-HCL (pH 6.8)； 电泳缓冲液： 5XTris－甘氨酸缓冲系统， 4℃保存 5×电泳缓冲液（贮存液）的配制： 0.125 M Tris 15.1 g 1.25 M Glycine 94 g 0.5 % SDS 5g 三蒸水定容至 1000 mL
常见问题
8.二抗的选择根据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目 的蛋白的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体， 而且二抗要标记有同位素或酶。 9.条带两边扩散：加样量过多 10.条带两边高，中间凹 原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏 高
常见问题
11.条带呈皱眉状，中间高，两边低 原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡 板底部有气泡，或者两边聚合不完全 12.条带有拖尾现象 原因：样品溶解不好 13.混合搅拌速度时不宜太快，容易产生气泡影响聚合，导致 电泳带畸形。 太慢不均匀，特别是甘油
主要试剂
11.三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液Tris buffer saline（1×TBS） 洗去Tween,因为Tween会影响发光 • 10 mM Tris-HCl （pH=8.0）1 M 10 mL • 150 mM NaCl 5 M 30 mL • 三蒸水定容至 1000 mL 12. Tris buffer saline Tween（ TBST）缓冲液 洗去未结合的抗体 • 1×TBS 1000 mL • 0.05 % Tween-20 0.5 mL
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原理 分类 主要试剂 操作步骤 常见问题
原理
Western Blot（蛋白免疫印迹）采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE)，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记 的二抗。经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝 酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能 保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的 蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同 位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测 电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 。
常见问题
3. 加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界 面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在 同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制 作用。也可以覆盖一层无水乙醇。
常见问题
4. 从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜保湿，避 免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 5.膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路 6.电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温 7.切滤纸和膜时，一定要戴手套，因为手上的蛋白会污 染膜
主要试剂
4. 10% 十二烷基硫酸钠SDS溶液 是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂 去蛋白质电荷； 断裂分子内和分子间的氢键，取消蛋白分子内的疏水作用； 使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构，常温保存。
主要试剂
5. 10% 过硫酸铵（AP） 催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺， 4℃保存， 一周内使用 0.1g过硫酸铵溶于1mlddH2O中
Hale Waihona Puke Baidu
主要试剂
8.10×转印Buffer（贮存液） 4℃保存 • 10×转印Buffer（贮存液）的配制： • 0.25 M Tris 30.28 g • 1.92 M Glycine 144.13 g • 三蒸水定容至 1000 mL • 1×Transfer Buffer（工作液）： • 10×Transfer Buffer 100 mL • 三蒸水 700 mL • 20 % 甲醇 200 mL
操作步骤
7.PVDF膜的免疫学检测 PVDF膜经5%脱脂奶室温封闭1 h→一 抗4℃温和震荡过夜→TBST洗涤三次→HRP标记二抗室温温 育1 h→TBST洗涤三次后，应用化学发光底物检测试剂盒进 行检测 8.结果分析 以GAPDH为内参照，以靶蛋白/内参照灰度的 比值作为蛋白的相对表达含量，进行半定量检测
主要试剂
13.封闭缓冲液 封闭膜上的非特异性蛋白结合位点，防止一抗、二抗 的非特异性反应 • TBST Buffer 100 mL • 5 % Nonfat Milk 5g 14.一抗 15.二抗：羊抗兔IgG/HRP（辣根过氧化酶） 使试剂中的发光物氧化并发光 16. ECL检测试剂
操作步骤
提取总蛋白
主要试剂
在SDS－PAGE不连续电泳中，浓缩胶其pH环境呈弱酸 性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率 低；而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带， 蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成 反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分 子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶 后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动 速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的 缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和 分子大小进行分离。
常见问题
1.分离胶浓度 根据目的蛋白分子量选择胶的浓度
蛋白分子量 (kDa) 4-40 12-45 10-70 15-100 25-200
凝胶浓度 (%) 20 15 12.5 10 8
常见问题
2. 在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性,这是为了控制慢 离子的解离度,从而控制其有效迁移率.要求在样品胶和浓 缩胶中,慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低,以使样 品夹在快、慢离子界面之间,使样品浓缩.而在分离胶中慢 离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高,使样品不再 受离子界面的影响.
主要试剂
1.ddH2O 2.30% 丙烯酰胺混合液 丙烯酰胺(arc)29g和N，N’-亚甲双丙烯酰胺(bis)1g加H2O 至100ml。储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超 过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用 期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可 以过滤。 为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电 泳成功与否。
主要试剂
6.四甲基乙二胺TEMED 催凝剂，加速AP催化作用，在聚合过程中，TEMED催化过 硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲 叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成 三维网状结构
主要试剂
7. 8×SDS-PAGE Loading Buffer溶液（上样缓冲液） loading buffer的功能主要有两个： 第一，里边的指示剂溴酚蓝起到指示的作用，它是一个较 小的分子，可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前 沿位置，以便我们适时终止电泳； 第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使其沉降到点 样孔中，防止样品飘出点样孔。 SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结 合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液， 加loading 100℃加热，也是为了中止酶促反应，防止提取 的蛋白质降解。
主要试剂
9.甲醇 转膜液中主要是降低电导的作用，防止转膜溶液过 热。 10.聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride, PVDF)膜 PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非 常适合于低分子量蛋白的检测，用前需在甲醇中浸泡，以 活化膜上 的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。
抗原
生物素标记 的二抗 一抗
ECL发光试剂
分类
• SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝 胶电泳） • native-PAGE（非变性聚丙烯酰胺凝胶）
区别在于加不加变性剂（比如SDS）使蛋白质变性，SDSPAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式特别是用于蛋 白质纯度检测和测定蛋白质分子量
蛋白浓度测定
SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳
一抗
封闭
转膜
洗涤
二抗
洗涤
分析
扫描
ECL检测
操作步骤
1.细胞总蛋白提取及定量 2.配胶 3.制胶 先用1ml枪头小心铺12%分离胶，上加少许ddH2O，待 分离胶干凝后，倒去ddH2O ，用滤纸吸干。再铺8%浓缩 胶，注意不要产生气泡，斜插上梳子，待胶干后备用， 拔去梳子。 4.上样 所有上样孔均加样，没有样本，用上样缓冲液代替。 5.电泳 取40 μg蛋白经8%浓缩胶电泳80V 30min，12%分 离胶电泳110V 90min。 6.转膜 电泳结束后，切除浓缩胶，按照负极-3张滤纸-分离 胶-PVDF滤膜--3张滤纸-正极的顺序，组装电转膜体系， 100V 转膜25min。
主要试剂
3. 配胶缓冲液系统 分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCL(pH 8.8) ； 浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris-HCL (pH 6.8)； 电泳缓冲液： 5XTris－甘氨酸缓冲系统， 4℃保存 5×电泳缓冲液（贮存液）的配制： 0.125 M Tris 15.1 g 1.25 M Glycine 94 g 0.5 % SDS 5g 三蒸水定容至 1000 mL
常见问题
8.二抗的选择根据一抗的种属来源，如：一抗是兔抗大鼠目 的蛋白的抗体，则二抗应选择山羊或其他来源抗兔的抗体， 而且二抗要标记有同位素或酶。 9.条带两边扩散：加样量过多 10.条带两边高，中间凹 原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好; 电泳系统温度偏 高
常见问题
11.条带呈皱眉状，中间高，两边低 原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡 板底部有气泡，或者两边聚合不完全 12.条带有拖尾现象 原因：样品溶解不好 13.混合搅拌速度时不宜太快，容易产生气泡影响聚合，导致 电泳带畸形。 太慢不均匀，特别是甘油
主要试剂
11.三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液Tris buffer saline（1×TBS） 洗去Tween,因为Tween会影响发光 • 10 mM Tris-HCl （pH=8.0）1 M 10 mL • 150 mM NaCl 5 M 30 mL • 三蒸水定容至 1000 mL 12. Tris buffer saline Tween（ TBST）缓冲液 洗去未结合的抗体 • 1×TBS 1000 mL • 0.05 % Tween-20 0.5 mL