大肠杆菌培养方法
大肠杆菌培养和分离
大肠杆菌培养和分离超净台实验准备工作2灭菌和消毒无菌操作目的：为了避免被杂菌污染。
1对实验操作空间：超净台：紫外线灭菌，过滤风桌面：酒精擦拭，酒精灯外焰附近操作2.操作者衣服和手进行：清洁和消毒，70%酒精3.避免已灭菌处理的材料用具和周围物品的接触消毒的方法1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用70%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气、高锰酸钾消毒……（1）消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。
消毒与灭菌的区别（2）灭菌：灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。
以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌的过程。
实验1大肠杆菌的培养和分离超净台上紫外灯和过滤风实验过程：准备阶段：1培养基的配制，2灭菌和消毒操作阶段：1倒平板：分装固体培养基倒平板：将已灭菌的固体培养基倒入培养皿的过程。
分装培养基：1倒平板：将灭菌后的固体培养基倒入培养皿培养基冷却到60度时倒入2培养基的分装（试管，三角瓶，培养皿）倒入三角瓶和试管（漏斗法）1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板。
你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
朊病毒就是蛋白质病毒，是只有蛋白质而没有核酸的病毒。
1997年诺贝尔医学/生理学奖的获得者美国生物学家斯垣利·普鲁辛纳(S.B.Prusiner)就是由于研究朊病毒作出卓越贡献而获此殊荣的。
细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，它使得这层壁坚韧并富有弹性。
一旦失去细胞壁，所有的细菌都将变成球形。
细菌细胞壁的主要功能是保护细胞、维持细胞形状、协助鞭毛运动等，而且还与细菌的抗原性、致病性和对噬菌体的敏感性有关。
纯化大肠杆菌的方法
纯化大肠杆菌的方法
首先，准备工作是非常重要的。
在进行大肠杆菌的纯化前，需要准备好所需的实验器材和试剂，包括培养基、离心管、离心机、超声波破碎机等。
同时，要确保实验室环境的清洁和无菌操作。
其次，进行大肠杆菌的培养和收获。
首先将大肠杆菌接种到含有适当抗生素的培养基中，进行培养。
培养时间和条件根据具体实验而定，一般需要在37摄氏度下培养12-16小时。
培养后，使用离心机将培养液进行离心，收集细菌沉淀。
接下来是大肠杆菌的破碎和裂解。
将收集到的细菌沉淀用适当的缓冲液进行悬浮，然后使用超声波破碎机进行破碎和裂解。
这一步是为了破坏细菌细胞壁，释放细胞内的目标蛋白。
然后进行蛋白的纯化和分离。
通过离心、过滤、层析等方法，将目标蛋白从混合物中分离出来，得到较纯的蛋白样品。
这一步需要根据目标蛋白的特性选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析等。
最后是对纯化后的蛋白进行检测和分析。
使用SDS-PAGE凝胶电
泳、Western blotting等方法对纯化后的蛋白进行检测和鉴定，确
保蛋白的纯度和活性。
通过以上步骤，可以得到较为纯净和活性较高的大肠杆菌蛋白
样品。
这种方法不仅适用于纯化大肠杆菌蛋白，也可以根据具体情
况进行相应的改进和优化，以满足不同实验的需求。
总之，纯化大肠杆菌的方法是一个复杂而又重要的过程，需要
仔细操作和科学设计。
只有通过严格的实验操作和精准的技术手段，才能得到理想的纯化效果。
希望本文介绍的方法对您有所帮助，谢
谢阅读。
大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培养一、菌种冻存液的制备含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80o C冻存。
二、培养基制备LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）液体培养基胰化蛋白胨 10.0g酵母粉 5.0g氯化钠 10.0g水 1000mlpH 7.4固体培养基在液体培养基的基础上再加入 1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制备1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉 5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。
2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。
如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入 2.5g琼脂）。
3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。
所有锥形瓶如上述操作。
用记号笔注明培养基名称、配制日期。
4）高压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min。
5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oC烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取出。
液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌30min以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15mL（直径90mm），在培养皿中厚度大约4mm左右。
将平皿叠放在无菌操作台上，放置10min左右，待琼脂基本凝固可涂平板。
6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待需制备平板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温冷却20min至不烫手可制备平板。
四、接种大肠杆菌1）取实验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管口用酒精灯灼烧，打开离心管。
2）接种方法一：用灭菌枪头蘸取冻存液在平板边缘上划横条，每三道为一组，旋转平皿一圈，最后中间划之字；接种方法二：用移液枪吸取100uL溶液于平板上，用酒精灯灭菌厚的涂抹棒划十字，涂布平板。
大肠杆菌培养基配制及培养方法
大肠杆菌培植之阳早格格创做一、菌种冻存液的造备含有脚量细菌的液体培植基离心后正在重淀中加进等量40%苦油，-80o C冻存.两、培植基造备LB培植基配圆（胰化蛋黑胨（Trypton）：10 g/L；酵母提与物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH ）液体培植基胰化蛋黑胨氯化钠 10.0g火 1000mlpH固体培植基正在液体培植基的前提上再加进％－％的琼脂三、仄板的造备1）称与胰化蛋黑胨10.0g，酵母粉 5.0g，NaCl 10.0g，加进800mL两次火溶解，并用玻璃棒搅拌匀称，安排，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）.2）分拆正在锥形瓶中，每瓶量出有宜太多，出过瓶底一指安排.如需固体培植基正在分拆后的液体培植基内加进约2%的琼脂（150mL液体培植基加进2.5g琼脂）.3）正在锥形瓶心依次覆盖戴滤纸通气小孔的塑料膜战硬量纸，用皮筋捆佳.所有锥形瓶如上述支配.用暗号笔证明培植基称呼、配造日期.4）下压蒸汽灭菌锅121 oC灭菌15min.5）灭菌后的培植基与出置电热饱风搞燥器内60oC烘搞，待锥形瓶的启心纸搞燥后与出.液体培植基可曲交保存或者使用，此时加有琼脂的培植基出有会凝固，可正在预先紫中杀菌30min以上的无菌支配台上，将培植基倒进培植皿内，每个培植皿培植基约10-15mL（曲径90mm），正在培植皿中薄度约莫4mm安排.将仄皿叠搁正在无菌支配台上，搁置10min安排，待琼脂基原凝固可涂仄板. 6）若仄板出有曲交使用，灭菌后将培植基正在锥形瓶中保存，待需造备仄板时，微波炉中火加热约3min，使琼脂熔化，室温热却20min至出有烫脚可造备仄板.四、交种大肠杆菌1）与真验室储备的大肠杆菌BL21冻存液，管心用酒粗灯灼烧，挨启离心管.2）交种要领一：用灭菌枪头蘸与冻存液正在仄板边沿上划横条，每三讲为一组，转动仄皿一圈，末尾中间划之字；交种要领两：用移液枪吸与100uL溶液于仄板上，用酒粗灯灭菌薄的涂抹棒划十字，涂布仄板.3）果真验普遍皆央供挑与单菌降，故涂仄板符合思量冻存液内细菌数量，若菌量过大应适合密释.普遍要领一赢得单菌降的大概性比较大.涂仄板应正在酒粗灯附近举止，若冻存液涂完的仄板应倒置，预防仄皿盖上爆收火蒸气.五、大肠杆菌的培植1）将交种佳的仄皿倒置搁进37℃的恒温培植箱中培植，约莫十几小时后少出菌降.2）挑与死少状态佳，特性明隐的单个菌降，交种于新陈灭菌的LB液体培植基中37℃，220rpm/min恒温振荡培植9-12h.菌降特性：乳红色，圆形，菌降边沿整齐，表面光润，表面战反里颜色普遍.。
实验一大肠杆菌的培养与分离(最新)
恒温培养箱
实验设备和用品： 1、灭菌锅或高压锅 2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈P22 P26 3、直径90mm的培养皿 4、接种环和玻璃三角刮刀 5、恒温培养箱 6、摇床
摇床
实验设备和用品： 1、灭菌锅或高压锅 2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈 3、直径90mm的培养皿 4、接种环和玻璃三角刮刀 5、恒温培养箱 6、摇床 7、酒精灯和超净台
1-1什么是生物技术
• 生物技术=生物工程
应用自然科学及工程学原理，以微生 物体、动物体、植物体或其组成部分作为 生物反应器将物料进行加工，以提供产品 来为社会服务的技术。
1-2 传统生物技术
• 传统生物技术指主要通过微生物 的发酵来生产商品.如:酱、醋、 酒、面包、奶酪、酸奶等
1-3 现代生物技术
②保护细胞免受外力的损伤； ③阻拦大分子物质进人细胞； ④使细胞具有致病性及对 噬菌体的敏感性。
伤 寒 杆 菌 细 胞 壁 中 含 毒 素
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠 体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环 境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才 死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水 分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.
特点：结构简单，形体微小，通常要用光学显微镜或 电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。 用途：90%以上的微生物是对人类有利的。如抗生素 多数来源放线菌和霉菌；酒由酵母菌发酵产生，腐乳 由红曲霉和毛霉发酵制成；微生物也能消除环境污染， 在新能源领域将发挥巨大作用。
1）放线菌
1、结构： 单细胞原核 分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）
分离后,一个菌体 便会形成一个菌 落,这是消除污染 杂菌的通用方法, 也是用于筛选高 表达量菌株的最 简便方法之一
大肠杆菌操作规程(3篇)
第1篇一、目的为确保大肠杆菌培养过程的准确性和安全性，防止污染和交叉感染，特制定本操作规程。
二、适用范围本规程适用于实验室大肠杆菌的培养、传代、保存及相关实验操作。
三、操作步骤1. 准备工作（1）实验环境：实验室应保持清洁、通风，操作台面、仪器设备等应定期消毒。
（2）人员要求：操作人员应熟悉大肠杆菌培养知识，遵守无菌操作原则。
（3）材料与设备：大肠杆菌菌株、无菌水、LB培养基、琼脂糖、接种环、移液器、无菌试管、无菌培养皿、恒温培养箱、酒精灯、高压灭菌器等。
2. 大肠杆菌培养（1）制备LB培养基：按照说明书配制LB培养基，高压灭菌后备用。
（2）接种：将保存的大肠杆菌菌株接种于LB培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养过夜。
（3）传代：次日取培养过夜的大肠杆菌菌液，用无菌水稀释至适宜浓度，涂布于LB琼脂平板上，37℃恒温培养箱中培养18-24小时。
3. 大肠杆菌分离纯化（1）挑取单菌落：用无菌接种环挑取平板上的单菌落，接种于LB培养基中，37℃恒温培养箱中培养过夜。
（2）验证：次日观察菌液是否澄清，若澄清，则证明分离纯化成功。
4. 大肠杆菌保存（1）保存液：配制含有20%甘油的大肠杆菌保存液。
（2）操作：将培养过夜的大肠杆菌菌液转移至无菌离心管中，加入等体积的保存液，混匀后转移至无菌冻存管中，置于-80℃冰箱中保存。
5. 无菌操作（1）操作前，操作人员应穿戴无菌手套、口罩、帽子等防护用品。
（2）操作过程中，避免触碰无菌区域，确保操作台面、仪器设备等无菌。
（3）接种、传代等操作应在无菌操作台（超净工作台）进行。
四、注意事项1. 操作过程中，严格遵循无菌操作原则，防止污染。
2. 试剂、耗材等应定期检查，确保质量。
3. 操作过程中，如发现污染现象，应立即停止操作，对污染区域进行消毒处理。
4. 实验室应定期进行无菌检查，确保实验室环境、操作人员、仪器设备等符合无菌要求。
五、应急处理1. 如发生污染，应立即停止操作，对污染区域进行消毒处理。
实验1 大肠杆菌的培养和分离
（2）具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行 诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。 步骤2:制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意＿和 ＿，加琼脂后灭菌，制成
本图来自十一学校
二、实验流程 配制培养基
包器材
灭菌
倒平板(或斜面)
接种扩大培养 分离
单菌落培养
接种保存
细菌的分离方法
1.种类: 划线分离法和涂布分离法。 划线分离法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操 作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面. 划线时不能划破培养基
2.作用: 是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表 达量菌株的最简便方法之一。
实验一
大肠杆菌的培养和分离
微生物
定义:结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生 生物和某些真菌。
曲霉
酵
母
菌
草履虫
细菌：是单细胞的原核生物。 结构组成：细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，拟核 分裂方式：二分裂
菌落：由单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养 基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有 一定形态结构等特征的子细胞的群落。
为什么要倒置培养？
培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，正放培养 皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并 且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互 影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。
1.下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接 种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
实验1,大肠杆菌的培养和分离
实验1,大肠杆菌的培养和分离篇一：实验1 大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲实验目的1. 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。
2. 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。
3. 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。
实验材料1. 配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。
2. 配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。
实验步骤1. 培养基灭菌。
在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB 固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。
既可以通气，又不使细菌进入。
)。
将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。
同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。
2. 倒平板，倒斜面。
灭菌后。
待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。
超净工作台操作：打超净工作台的紫外灯（注意：打开紫外灯后人必须离开），持续30min，关闭紫外灯，打开过滤风和白炽灯。
将有培养基的三角瓶和培养皿放在灭菌后的超净工作台上后，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。
待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶的培养基约10～20mL倒入1 个培养皿中。
倒入后立即置于水平位置上，轻轻摇晃，使培养基铺满培养皿底，待凝，使之形成平面。
倒斜面（试管内空白斜面），用玻璃漏斗倒入试管内，每试管2mL。
实验大肠杆菌培养和分离
实验大肠杆菌培养和分离
比较消毒与灭菌
比较 理化因素的作 消灭微生物的数 芽孢和孢子能否
项
用强度
量
被消灭
消毒 灭菌
较为温和
部分生活状态 的微生物
强烈
全部微生物
不能
实验大肠杆菌培养和分离
3、常用的灭菌和消毒的方法
（1）灭菌方法：
高压蒸汽灭菌 （湿热灭菌）
实验大肠杆菌培养和分离
2、成分 水、碳源、氮源、 无机盐、生长因子
(生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的 化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶) 不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 调节pH 真菌：5～6 细菌：6.5 ～ 7.5 有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压
实验大肠杆菌培养和分离
实验1： 大肠杆菌的培养和分离
实验大肠杆菌培养和分离
一、基础知识： (一)微生物
病毒 细菌
微生物包括哪五类： 放线菌
真菌
原生生物
病毒界 原核生物界
真菌界 原生生物界
特点：结构简单,形体微小.通常要用光学显微镜或 电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且 体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.
菌落的概念
菌落：单个或少数细菌在固体 培养基上大量生长繁殖时，所 形成的肉眼可见的具有一定形 态结构的子细胞群体。
大肠杆菌
不同微生物形成的菌落具有不同 大肠杆菌菌落： 的特征，是鉴定菌种的重要依据。白色或乳白色，光滑
如菌落的大小、形状、边缘、光泽度、颜色、透明度等。
酵母菌
放线菌
霉菌
实验大肠杆菌培养和分离
均匀混浊生长
实验1 大肠杆菌的培养和分离
()
A．属于单细胞的原核生物 B．在固体培养基表面可见其细胞
C．细胞壁成分与植物不同 D．细胞中含有DNA和RNA
2．微生物实验中分别采用了高压蒸气、酒精、火焰灼烧等几种不同的灭菌处理，这些方法依次
可以用于杀灭什么部位的杂菌
()
A．接种针、手、培养基 B．高压锅、手、接种环
C．培养基、手、接种环 D．接种针、手、高压锅
平均菌落数÷涂布的稀释液体积×稀释倍数 （3）利用鉴别培养基确定细菌种类： 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了 氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高 。因此，我们可以通过检测培 养基pH变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基 中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说 明该细菌能够分解尿素。 3．思考题： （1）农作物不能直接吸收利用尿素，但尿素却是农业生产上的重 要氮肥。农作物如何利用尿素中的氮？
环温度较高，为避免烫死菌种，可将其接触
冷却后再取样和接种。
4．接种划线：在固体培养基的表面连续划线
条，将培养皿转动一定角度后，用接种
环通过第1次划线的
做第2次连续平行划线，然后再以同样方法依次操作。
划线时要轻，不可
，也不要使接种环碰到培养皿边缘。
划线后盖好培养皿，将培养皿
，将培养皿放入恒温培养箱中在
面。 待酒精挥发之后，再点燃酒精灯。 2．接种 （1）接种时的要求 接种过程要在酒精灯火焰附近完成，这是因为在火焰附近形成的上
升气流能避免空气中的微生物落入培养基中。 接种环灭菌：将接种环在酒精灯火焰的外焰灼烧灭菌。对金属丝与
柄部连接部位也要在火焰上穿梭1－2次。灼烧后的接种环温度较高，为 避免烫死菌种，可将其接触培养基或培养容器的内壁冷却后再取菌种。
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大肠菌群测定的操作细则
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1 设备和材料
1.1 温箱：36±1℃。
1.2 冰箱:0～4℃。
1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。
1.4 天平。
1.5 显微镜。
1.6 均质器或乳钵。
1.7 平皿:直径为90mm。
1.8 试管。
1.9 吸管。
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11 玻璃珠:直径约5mm。
1.12 载玻片。
1.13 酒精灯。
1.14 试管架。
2 培养基和试剂
2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中
3.22规定。
2.6 生理盐水。
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
3 操作步骤
3.1 检样稀释
3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
3.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。
每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
3.3 分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
3.4 证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。
凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
3.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
4 粪大肠菌群(faecal coliform)
4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。
4.2 结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。