范秀芝--PCR扩增及产物检测
pcr数据分析
pcr数据分析PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，它可以在体外扩增DNA序列，具有高效、准确、快速的特点。
PCR数据分析是在PCR反应后对产生的数据进行处理和解读的过程。
本文将介绍PCR数据分析的基本原理和常用方法，并探讨其在科研和医学领域中的应用。
一、PCR数据分析的基本原理和流程PCR反应产生的数据主要包括荧光信号强度和扩增曲线。
荧光信号强度反映了PCR反应产物的数量，可用于定量分析。
扩增曲线反映了PCR反应的动力学过程，可以评估PCR反应的效率和特异性。
PCR数据分析的基本流程如下：1. 数据获取：通过荧光检测设备获取PCR反应的荧光信号强度和扩增曲线。
2. 数据预处理：对原始数据进行噪声滤波、背景校正和信号标定等处理，以获得可靠的数据。
3. 荧光信号分析：利用荧光信号强度反映PCR产物的数量，通过计算阈值周期数（Ct值）或标准曲线法进行定量分析。
4. 扩增曲线分析：利用扩增曲线反映PCR反应的动力学过程，评估PCR反应的效率和特异性，判断PCR反应的质量和合理性。
5. 数据解读：根据荧光信号和扩增曲线的分析结果，判断PCR 反应是否成功、产物的数量及其特性。
二、PCR数据分析的常用方法PCR数据分析的方法多种多样，根据研究目的和需求选择合适的方法进行分析。
以下列举几种常用的方法：1. Ct值计算法：计算阈值周期数（Ct值），即荧光信号曲线与阈值线交叉的周期数，可用于定量分析。
Ct值越小，说明样品中目标序列的初始数量越多。
2. 标准曲线法：制作一系列已知浓度的标准曲线，根据荧光信号的强度，通过插值计算目标序列的初始数量。
标准曲线法常用于定量PCR分析。
3. ΔΔCt法：利用Ct值的差异进行定量分析，将目标序列的Ct值与参考序列的Ct值进行比较，计算相对表达量的变化。
4. Melting Curve分析：通过不同温度下DNA的熔解曲线，检测PCR产物的特异性。
每个PCR产物都有独特的熔解温度，可判断PCR反应的特异性和产物的纯度。
实验四 聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段
实验四聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段一、实验目的·了解PCR扩增DNA片段的原理·掌握PCR扩增DNA片段的技术二、实验原理·多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。
1985年 Kary Mullis及同事创立。
随后借助于热稳定性Taq DNA聚合酶的发现，使PCR自动化成为可能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。
·原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。
这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA 分子。
如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
·PCR 的特点及应用：PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。
因此，广泛应用于许多领域。
1.基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序等；2.遗传病的产前诊断；3.致病病原体的检测；4.癌基因的检测和诊断；5.DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证；6.动、植物检疫；7.在转基因动植物中检查植入基因的存在·PCR 反应系统的组成PCR反应系统的组成主要包括：引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。
临床基因扩增检验操作规范
反应中不加模板与Taq酶。
(3) 紫外照射法：
尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法：
dUTP代替反应中的dTTP，使产物中含大量dU，UNG可去除dU，使失去dU的位置，阻止Taq酶的延伸。PCR正常循环前，用UNG处理PCR反应混合液可消除PCR产物的污染，而UNG在正常PCR循环变性一步就会失活，所以，对含dU的新合成PCR产物没有影响 。
PCR操作中存在问题分析
01
阳性变阴性 阴性变阳性 PCR结果不稳定
02
1.阳性变阴性
有些阳性病人，经过PCR检测后为阴性，可能有两种情况： 一是采集标本方法或部位不正确， 二是如果病人取样部位病原体消失，需根据病人的病理情况采样。
标本保存不当，可引起PCR失败。
收集的标本乱放（未放冰箱），病原体的破裂，检测的核酸降解，失去了PCR检测的模板或造成标本污染。
不明原因引起公用试剂如液体石蜡等污染
01
（必须设置一个不含模板DNA但含PCR系统中所有其他成分的对照反应。这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加）。 实验室污染
02
样品处理方法不当，标本中杂质很多，
血清标本有蛋白质、血红素、代谢产物等。
蛋白质——DNA电泳带拖尾
血红素中的卟啉化合物——抑制Taq酶活性
代谢产物——干扰引物配对
PCR检测结果不稳定
操作不当带来的后果
主要指不能严格按照说明进行操作造成PCR检测失败。
RNA：异硫氰酸胍盐（GITC）可使
DNA酶和RNA酶失活。
（二）标本的稳定化处理
01
可在常温下通过邮寄运送，如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血及用于RNA扩增则必须速冻后，放在干冰中运送。
PCR扩增的原理和步骤
PCR扩增的原理和步骤聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。
它具有许多优点：特异性、易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。
但是，传统PCR技术有它的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。
人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究，直到1996年由美国Applied Biosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR(F lurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitati ve PCR,RT-qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，实现了PCR从定性到定量质的跨越，具有里程碑意义。
目前，此项技术已应用于干细胞研究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检测和传染病研究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生物科技等多领域研究中。
本文对实时荧光定量PCR的原理、分类和应用进行阐述。
一、实时荧光定量PCR技术的原理real-time quantitative PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。
(1)荧光域值(t hreshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。
PCR常见异常扩增曲线
PCR常见异常扩增曲线问题解析在PCR反应体系中加入荧光基团，利⽤荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每⼀个循环变得“可见”，最后通过循环阈值( Cycle threshold，Ct) 和标准曲线的关系对起始模板进⾏定量分析。
PCR扩增过程中，每⼀轮循环均检测⼀次荧光信号的强度。
随着反应循环次数的不断增加，所扩增的⽬的基因⽚段呈指数规律增长，反应中产生的荧光信号强度与PCR产物的数量呈正比。
仪器实时检测和采集的荧光信号，随着时间和循环数的不断增加，产⽣⼀条反映实时荧光信号强度变化的曲线，称为扩增曲线。
扩增曲线以循环数为横坐标，荧光强度为纵坐标。
样本扩增曲线是反应PCR进程的镜⼦，我们可以通过观察扩增曲线来评估PCR扩增效率，分析实验是否顺利进⾏。
扩增曲线的正常与否，反映出实验中存在的诸多因素和问题，对新冠核酸检测结果判读⾄关重要。
⼀、正常状态扩增曲线正常PCR扩增曲线呈“S”型，分为基线期、指数期、平台期。
扩增曲线良好的指标是曲线拐点清楚，扩增曲线整体平⾏性好，基线平⽽⽆上扬现象。
基线期PCR起始时，刚开始前几个循环的荧光信号还没有发生变化，接近一条直线，将其称之为基线，一般是3-15个循环。
在基线期内，扩增的荧光信号被背景荧光信号所掩盖，无法判断PCR产物量的变化。
指数期扩增的荧光信号高于背景荧光信号，扩增曲线起峰，开始进入指数期。
在指数期内，每个循环积聚的产物准确加倍（假定100%反应效率）。
该阶段的PCR反应具有高度特异性和精确度。
因为所有试剂均充足，反应的动力学推动反应有利于扩增子加倍，所以产物出现指数级扩增。
只有在这个阶段，Cq值与初始模板量的对数之间存在线性关系，所以在此阶段进行定量分析最合适。
线性期（高变异性）随着PCR反应体系各成分的消耗，其中的一种或者多种成分限制反应，导致反应开始减缓，并且每个循环的PCR产物不再加倍，该阶段不再是指数级扩增。
平台期反应停止，不再产生更多产物，并且如果放置时间够长，PCR产物将开始降解。
pcr检测流程步骤
pcr检测流程步骤PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和扩增DNA。
下面将介绍PCR检测的流程步骤。
第一步：样品采集PCR检测的第一步是采集样品。
样品可以是人体组织、血液、唾液、尿液等。
采集样品时要保证样品的纯净性和完整性，避免污染和损伤。
第二步：DNA提取提取样品中的DNA是PCR检测的关键步骤。
常用的DNA提取方法包括酚-氯仿法、盐析法、磁珠法等。
提取过程中要注意避免DNA的降解和污染，保证提取到的DNA质量和浓度。
第三步：DNA扩增DNA扩增是PCR检测的核心步骤。
扩增过程中需要使用特定的引物（一对寡核苷酸序列）和DNA聚合酶。
引物与待扩增的DNA序列互补结合，并由DNA聚合酶在不断变温循环的条件下进行DNA 链的合成。
循环反复进行多次，可以在短时间内扩增出大量目标DNA序列。
第四步：凝胶电泳凝胶电泳是PCR检测的常用分析方法。
通过将PCR产物置于凝胶中，通过电场作用使DNA分子向电极迁移，根据DNA分子的大小和电荷差异，可以将PCR产物分离。
凝胶电泳的结果可以通过紫外光照射或染色剂染色来观察，从而判断PCR是否成功以及目标DNA片段的大小。
第五步：结果分析通过凝胶电泳后，可以根据PCR产物的带型和大小来判断PCR是否成功。
如果目标DNA片段的带型明显且与预期一致，则说明PCR成功扩增出目标DNA序列。
而如果没有扩增出目标DNA序列，则说明PCR反应失败，需要重新优化反应条件。
第六步：数据解读根据PCR检测的结果，可以对目标DNA序列进行定性和定量分析。
定性分析可以判断样品是否存在目标DNA序列，定量分析可以确定目标DNA序列的浓度。
通过数据解读，可以得出与待测物相关的信息，如基因型、病毒感染程度等。
PCR检测的流程包括样品采集、DNA提取、DNA扩增、凝胶电泳、结果分析和数据解读。
每个步骤都有其重要性和特殊要求，只有在严格遵循操作规程的情况下，才能获得准确可靠的PCR检测结果。
生物检测技术-PCR技术PPT
引物
根据需要扩增的序列长度和特异性要 求，确定引物的浓度和种类。
PCR扩增及产物分析
扩增
在PCR仪中进行扩增反应，设置适当的温度和循环次数，使DNA片 段得以扩增。
电泳分析
将扩增产物进行电泳分离，通过染色或荧光标记等技术对产物进行 分析和检测。
结果判断
根据电泳结果判断PCR扩增是否成功，并对产物进行定性或定量分析。
3
引物合成
将设计好的引物交由专业的引物合成公司进行合 成，得到可用于PCR反应的引物。
反应体系的组成
DNA聚合酶
选择高活性、高保真度的DNA聚合 酶，确保PCR扩增的准确性和特异性。
dNTPs
提供PCR所需的四种脱氧核苷酸，即 dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
缓冲液
提供适宜的酸碱度和离子浓度，维持 DNA聚合酶的活性。
基因突变和突变的检测
基因突变检测
PCR技术可以用于检测基因突变，通过设计特定的引物，可以扩增特定的DNA片段，通过比较正常和异常序列的 扩增产物，可以检测出基因突变的位置和类型。
突变筛选
利用PCR技术可以对大量样本进行突变筛选，通过设计针对特定突变的引物，可以对大量样本进行高通量的突变 检测，有助于疾病的早期发现和治疗。
快速高效
PCR技术能够在短时间内完成DNA的大规模扩增，大大提高了检测效 率。
操作简便
PCR技术流程相对简单，易于操作，使得它在实验室中得到了广泛应 用。
缺点
成本较高
PCR技术所需的仪器、试剂等成本较高， 对于一些经费有限的实验室来说可能是
一个负担。
对样品质量要求高
PCR技术的灵敏度使得其对样品质量 要求较高，样品中微小的杂质或污染
pcr定量检测流程
pcr定量检测流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!Download Tip: This document has been carefully written by the editor. I hope that after you download, they can help you solve practical problems. After downloading, the document can be customized and modified. Please adjust and use it according to actual needs. Thank you!PCR定量检测流程如下：①样品采集：根据检测需求，采集相应的生物样本，如血液、唾液、组织等，确保样本新鲜且无污染。
②核酸提取：使用磁珠法、酚-氯仿法或盐析法等，从样本中提取纯化的DNA 或RNA，严格控制操作以防核酸降解和污染。
③试剂准备：配置PCR反应液，包括模板核酸、特异性引物、荧光探针、dNTPs、缓冲液及热稳定DNA聚合酶等。
④加样与封管：将配置好的反应液精确加入反应管中，每管含有所需的所有反应组分，密封管盖以防污染。
⑤仪器设置：在实时荧光定量PCR仪上设定实验参数，包括循环次数、退火温度、延伸时间和荧光采集模式等。
⑥循环扩增：仪器自动执行PCR循环过程，包括高温变性、适温退火和中温延伸，每次循环使靶序列呈指数扩增。
⑦荧光检测：在每次循环的延伸阶段，仪器实时监测荧光信号强度，代表扩增产物的累积。
⑧数据分析：通过仪器软件分析荧光信号随循环数增加的变化，计算Ct值（循环阈值），依据标准曲线定量原始模板量。
⑨结果判定：根据Ct值与已知标准品的比较，得出样本中靶基因的绝对或相对定量结果，判断阴阳性或表达水平。
PCR结果分析CT法详细介绍
PCR结果分析CT法详细介绍PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种通过体外扩增特定DNA片段的方法，可以从极少量的DNA样本中扩增目标片段，并且可以进行定性和定量分析。
PCR的CT法（Cycle Threshold，循环阈值）是PCR结果分析的常用方法，本文将详细介绍PCR的CT法及其应用。
PCR的CT法基于PCR反应过程中的指数增长特点，通过检测反应体系中的荧光信号来确定目标DNA扩增的临界循环数。
CT值表示在反应体系中，荧光信号的强度超过阈值的所需循环数。
CT值越低，说明样本中的目标DNA浓度越高。
CT值的计算有多种方法，常用的有绝对和相对两种。
绝对法是通过建立标准曲线，根据标准曲线上对应CT值所对应的模板浓度，来计算未知样本中目标模板的浓度。
具体步骤如下：1.准备一系列已知模板浓度的DNA样品，使用这些样品进行PCR反应。
2.对PCR反应产物进行测量，记录荧光信号的强度和对应的CT值。
3.根据已知模板浓度与对应的CT值，建立标准曲线。
标准曲线的斜率可以代表PCR的效率，截距则代表背景信号的大小。
4.通过测量未知样本的CT值，根据标准曲线上对应的模板浓度，计算未知样本中目标模板的浓度。
相对法是通过比较不同样品的CT值来分析物种间或样品间的相对差异。
具体步骤如下：1.选择一个参照标准样品作为参照物，同时进行PCR反应，并计算其CT值作为参照CT值。
2.对其他样品进行PCR反应，测量其CT值。
3.计算其他样品的相对CT值，即用其他样品的CT值减去参照CT值，得到相对CT值。
4.通过比较不同样品之间的相对CT值，可以得出目标物在不同样品中的表达差异以及不同样品之间的相对浓度差异。
CT法在许多领域具有广泛的应用。
例如，在生物学研究中，通过比较不同组织或不同时间点的PCR结果的CT值，可以研究基因的表达差异；在医学诊断中，可以通过分析血液或组织样本中的CT值来检测和定量病原体或致病基因的存在；在食品安全监测中，可以通过PCR反应并分析CT值来快速检测食品中的致病菌或有害基因。
PCR产物电泳结果分析【范本模板】
产物检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。
假阴性,不出现扩增条带：PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活:需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因.有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位.②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带,一条引物无条带，此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度.③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效.④引物设计不合理,如引物长度不够，引物之间形成二聚体等.Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul.或100ul,应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。