莱克多巴胺荧光微球免疫层析检测方法的建立
莱克多巴胺(血清)
莱克多巴胺（瘦肉精）快速检测卡——胶体金法(血清)一、简介“瘦肉精”快速检测卡应用了竞争抑制免疫层析的原理，样本中的“瘦肉精”在流动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素膜（NC膜）检测线上“瘦肉精”-蛋白偶联物的结合。
如果样本“瘦肉精”含量≥3ppb/ml，检测线不显颜色，结果为阳性。
反之，检测线显红色，结果为阴性。
本产品是检测莱克多巴胺（瘦肉精）的快速筛选试剂，整个检测过程只需5-10分钟，适用于尿液样品的检测。
二、试剂组成1、莱克多巴胺免疫胶体金快速检测卡（50份/盒）；2、一次性塑料吸管（1个/袋）；3、干燥剂（1片/袋）；4、使用说明书（1张/盒）。
三、标本收集用干燥、洁净的离心管或适当容器采集血清。
如果不立即检测，可将血清冷冻保存；血清在2-8℃冷藏可保存24小时，要注意避免腐败造成失效或污染。
如果血清出现沉淀或浑浊物，请离心后再检测。
四、操作步骤1、在进行测试前先完整阅读使用说明书，使用前将检测卡和待检样本溶液恢复至室温。
2、撕开装有莱克多巴胺检测卡的包装袋，小心取出检测卡，水平放置于实验台上。
3、用塑料吸管吸2-3滴血清样本加入样本孔中。
4、5-8分钟内观察结果，10分钟后结果无效。
五、结果判定1、阳性结果：出现一条红色质控线（C）。
2、阴性结果：出现质控线（C）和反应线（T）两条红线。
3、无效结果：无红线出现，表明检测结果无效，需重新实验。
六、注意事项1、检测卡在保质期内一次性使用。
4℃冰箱中保存的检测卡检测前应平衡至室温后再开袋使用，否则会影响检测结果。
2、谨防检测卡受潮，铝箔包装袋受损或检测卡受潮后。
检测卡不能使用。
3、尽量不要触摸检测卡中央的白色膜面，检测时避免阳光直射。
4、塑料吸管不可混用，以免交叉污染；5、出现阳性结果，应用本卡复查并作阳性对照实验，必要时送实验室进一步定量。
6、铝箔包装袋中的小包是干燥剂，不可误服。
7、自来水、蒸馏水或去离子水不能作为阴性对照。
莱克多巴胺CLIA分析试剂盒的研制
莱克多巴胺CLIA分析试剂盒的研制陈巧钦1江良振1庄晓勇1沈浩龙1张长弓1*何琼1张志刚2郭书林3黄印尧3 (1.厦门市波生生物技术有限公司福建厦门361021;2.肉食品安全技术生产国家重点实验室(厦门银祥集团)福建厦门361100;3.厦门出入境检验检疫局福建厦门361026)摘要通过制备莱克多巴胺-牛血清白蛋白偶联物(Ractopamine-BSA,RAC-BSA)人工抗原,制备并获得高活性单克隆抗体,用辣根过氧化物酶(HRP)标记RAC抗原,以鲁米诺(luminol)为发光底物,建立直接竞争法检测分析莱克多巴胺,并对包被液、包被条件、封闭蛋白、孵育时间、酶用量等参数进行优化,成功研制出化学发光法检测RAC试剂盒。
该方法的线性检测范围可达0.1~10.0ng/mL,线性相关系数r=0.998,IC50值为0.763ng/mL;理论检测限小于0.1ng/mL;批内变异系数7.62%~8.65%;批间变异系数8.15%;回收率在85%±15%,与常见的克伦特罗等其他β-激动剂不发生交叉反应。
关键词莱克多巴胺CLIA试剂盒文献标识码:A文章编号:1003-4331(2014)02-0001-05The development of CLIA analysed kit for RactopamineChen Qiaoqin1Jiang Liangzhen1Zhuang Xiaoyong1Shen Haolong1Zhang Changgong1*He Qiong1Zhang Zhigang2Guo Shulin3Huang Yinyao3(1.Xiamen Boson Biotech Co.Ltd,361021;2.State Key Laboratory of Food Safety Technology for Meat Products,Xiamen,Yinxiang GroupCo.Ltd.,361100;3.Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People's Republic of China,361026) Abstract A highly active monoclonal antibody was gained by making manmade antigen of Ractopamine and BSA conjugate.We es⁃tablished a direct competition method to detect Ractopamine that uses HRP as markers and luminol as chemiluminescent substrates. We optimized many parameters in this method,including coating buffer,coating condition,blocking condition,incubating time,and enzyme consumption.Based on this method we developed a chemiluminescent detecting kit.The linear range is0.1~10.0ng/mL,the linear correlation coefficient is r=0.998,the IC50is0.763ng/mL,the detection limit is under0.1ng/mL,the within-run assay coeffi⁃cient of variation is7.62%~8.65%,the between-run assay coefficient of variation is8.15%,the coefficient of recovery is between85%±15%,and there is no cross reaction with clenbuterol and otherβ-agonists.Key words Ractopamine CLIA kit莱克多巴胺(Ractopamine,RAC)与克伦特罗(“瘦肉精”)同属β-兴奋剂类药物中的一员,对人体危害性很大。
荧光免疫层析法 定量
荧光免疫层析法定量【实用版】目录一、荧光免疫层析法的概述二、荧光免疫层析法的原理三、荧光免疫层析法的定量方法四、荧光免疫层析法的应用领域五、荧光免疫层析法的优势与局限性正文一、荧光免疫层析法的概述荧光免疫层析法是一种基于抗原抗体反应原理的快速免疫检测方法，通过检测样品中特定抗原或抗体的荧光信号来实现对目标分子的定量检测。
该方法具有操作简便、结果快速、灵敏度高、特异性强等优点，广泛应用于生物医学、食品安全、环境监测等领域。
二、荧光免疫层析法的原理荧光免疫层析法主要利用抗原抗体的特异性结合反应，通过荧光标记的抗体或抗原与待测样品中的相应抗原或抗体结合，形成荧光标记的抗原抗体复合物。
然后，通过层析的方式将复合物分离出来，并在特定波长下检测其荧光信号，从而实现对目标分子的定量检测。
三、荧光免疫层析法的定量方法荧光免疫层析法的定量方法通常分为以下两个步骤：1.标准曲线的建立：通过一系列不同浓度的标准品进行测定，得到标准品的荧光信号与浓度的对应关系，建立标准曲线。
2.待测样品的测定：将待测样品与荧光标记的抗体或抗原进行反应，形成荧光标记的抗原抗体复合物，并进行层析分离。
在特定波长下检测其荧光信号，根据标准曲线推算出待测样品中目标分子的浓度。
四、荧光免疫层析法的应用领域荧光免疫层析法广泛应用于生物医学、食品安全、环境监测等领域，如病原微生物检测、药物残留检测、肿瘤标志物检测等。
五、荧光免疫层析法的优势与局限性优势：1.操作简便，结果快速，适合现场检测；2.灵敏度高，特异性强，能够检测到较低浓度的目标分子；3.荧光信号稳定，不易受环境因素干扰。
荧光免疫层析法 定量
荧光免疫层析法定量
摘要：
1.荧光免疫层析法简介
2.荧光免疫层析法定量原理
3.荧光免疫层析法定量方法
4.荧光免疫层析法定量应用
5.荧光免疫层析法定量优缺点
正文：
荧光免疫层析法是一种将荧光标记物与抗体结合，通过检测荧光信号来定量分析样品中目标物质的方法。
该方法具有操作简便、快速、灵敏度高、检测限低等优点，因此在生物医学研究和临床诊断中得到了广泛应用。
荧光免疫层析法的定量原理是：首先，将荧光标记物与抗体结合，形成荧光抗体复合物；然后，将荧光抗体复合物固定在层析膜上，形成检测线；接着，将待测样品通过层析膜，如果样品中含有目标物质，荧光抗体复合物与目标物质结合，导致荧光信号的减弱；最后，通过检测荧光信号的强度，可以定量分析样品中目标物质的含量。
荧光免疫层析法定量的具体方法包括：标准曲线法、竞争法、间接法等。
标准曲线法是通过制备一系列不同浓度的标准品，建立荧光信号与目标物质含量之间的标准曲线，从而推算出待测样品中目标物质的含量。
竞争法是通过目标物质与荧光标记物竞争结合抗体，从而影响到荧光信号的强度，根据竞争程度可以推算出目标物质的含量。
间接法是先通过荧光抗体复合物与目标物质结
合，再通过其他方法检测荧光信号的强度，从而定量分析目标物质的含量。
荧光免疫层析法在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用，如病原微生物检测、肿瘤标志物检测、药物浓度监测等。
荧光免疫层析法的优点包括快速、灵敏、操作简便等，但也存在一定的局限性，如易受荧光标记物稳定性、仪器设备精度等因素的影响。
总之，荧光免疫层析法是一种具有广泛应用前景的定量分析方法，在生物医学研究和临床诊断中具有重要价值。
荧光微球免疫层析法定量检测牛乳中酪蛋白
*通讯作者: 赖卫华, 教授, 主要研究方向为食品安全。E-mail: talktolaiwh@ *Corresponding author: LAI Wei-Hua, Professor, State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, No.235, Nanjing East Road, Nanchang 330047, China. E-mail: talktolaiwh@
Fluorescent microsphere-based lateral flow assay for the quantitative detection of casein in milk
YANG Ya-Jie1, NI Xiao-Qin1, WANG Qian2, YOU Qiong2, ZHANG Fu-Sheng2, LAI Wei-Hua1*
ABSTRACT: Objective To develop a fluorescent microsphere-based lateral flow assay for the quantitative detection of casein in milk. Methods Casein was used as the antigen to immunize the New Zealand rabbits to make the corresponding polyclonal antibody against the antigen, and EDC mediated method was used to couple the purified polyclonal antibody with fluorescent microspheres. The filter pad, sample pad, conjugate pad, NC membrane, and absorption pad were assembled to develop the fluorescent microsphere-based lateral flow assay for the quantitative detection of casein in milk. Results The results could be obtained within 25 min without sophisticated equipment, and the limit of detection of the test strip was 100 ng/mL. The developed assay was highly specific to the casein protein as a result of that it had no cross-reactivity with other non-target proteins, such as BSA and OVA. The recovery rates of the intra-assay at casein concentrations of 100.0, 500.0, and 1000.0 ng/mL were (89.03±5.2)%, (93.47±6.9)% and (91.2±7.8)%, respectively, while the inter-assay were (87.69±6.2)%, (92.73±8.3)% and (89.82±8.5)%, respectively. Conclusion The fluorescent microsphere-based lateral flow assay for the quantitative detection of casein in milk with the advantages of rapid, convenient, and high sensitivity was established preliminarily. KEY WORDS: casein; lateral flow assay; fluorescent microspheres; quantitative detection
莱克多巴胺免疫亲和柱的制备与应用研究
莱克多巴胺免疫亲和柱的制备与应用研究王迪;杨曙明;刘潇威;于洪侠【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2010(29)8【摘要】用多元酸酐与混合酸酐相结合的方法合成了莱克多巴胺(Rac)抗原,免疫动物获得特异性抗体,并以蛋白A柱纯化得到IgG抗体.琼脂糖凝胶(Sepharose 4B)经溴化氰(CNBr)活化后与IgG抗体偶联,制备莱克多巴胺免疫吸附剂.据此建立了尿液中莱克多巴胺的免疫亲和柱净化/液相色谱-荧光法(HPLC-FL)测定的分析方法.免疫制备特异抗体50%抑制浓度(IC50)为5 μg/L.Sepharose 4B经CNBr活化后与2 mg抗体的偶联率达87.4%.1 mL吸附剂的柱容量为67.57 ng.尿液中莱克多巴胺的回收率为76% ～90%.【总页数】5页(P812-816)【作者】王迪;杨曙明;刘潇威;于洪侠【作者单位】农业部环境保护科研监测所,农业部/天津市产地环境与农产品安全重点开放实验室,天津,300191;中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,北京,100081;农业部环境保护科研监测所,农业部/天津市产地环境与农产品安全重点开放实验室,天津,300191;中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,北京,100081【正文语种】中文【中图分类】O657.72;R446.6【相关文献】1.恩诺沙星免疫亲和柱的制备与应用研究 [J], 朱新生;强敏;陆源;王韦岗;牛瑞;王云2.莱克多巴胺、沙丁胺醇与克伦特罗三合一免疫亲和柱的制备及应用 [J], 余乐;霍光华;符金华3.去氢甲睾酮单克隆抗体免疫亲和柱的制备与应用研究 [J], 马力4.神经性贝类毒素免疫亲和柱的制备与应用 [J], 董昕; 白景妙; 吴海燕5.真菌毒素免疫亲和柱的制备与评价 [J], 金晓林; 张东升因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
动物源性食品中克伦特罗 莱克多巴胺及沙丁胺醇的快速检测胶体金免疫层析法
附件6动物源性食品中克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的快速检测胶体金免疫层析法（KJ201706）1范围本方法规定了动物肌肉组织中克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于猪肉、牛肉等动物肌肉组织中克伦特罗、莱克多巴胺及沙丁胺醇的快速测定。
2原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理。
样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。
通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇进行定性判定。
3试剂与材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1试剂3.1.1甲醇：色谱纯。
3.1.2氢氧化钠。
3.1.3磷酸二氢钾。
3.1.4磷酸氢二钠。
3.1.5盐酸。
3.1.6氯化钠。
3.1.7氯化钾。
3.1.8三氮化钠。
3.1.9乙二胺四乙酸二钠。
3.1.10三羟甲基氨基甲烷，即Tris。
3.1.11乙酸乙酯。
3.1.12磷酸二氢钠。
3.1.13氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取氢氧化钠（3.1.2）4g，用水溶解并稀释至100mL。
3.1.14缓冲液：准确称取磷酸二氢钾（3.1.3）0.3g，磷酸氢二钠（3.1.4）1.5g，溶于约800mL水中，充分混匀后用盐酸（3.1.5）或氢氧化钠溶液（3.1.13）调节pH至7.4，用水稀释至1000mL，混匀。
4℃保存，有效期三个月。
3.1.15展开液：准确称取磷酸二氢钾（3.1.3）2g，磷酸氢二钠（3.1.4）1.44g，氯化钠（3.1.6）8g，氯化钾（3.1.7）0.2g，三氮化钠（3.1.8）0.5g，乙二胺四乙酸二钠（3.1.9）1.0g溶于约500mL水中，充分混匀后用水稀释至1000mL。
3.1.16Tris缓冲液（pH9.0，1mol/L）：称取Tris（3.1.10）121.14g，溶于约700mL水中，充分混匀后加入盐酸（3.1.5）调试pH至9.0后用水定容至1000mL。
荧光微球免疫层析技术定量检测N 末端脑利钠肽前体方法的确定
·47·荧光微球免疫层析技术定量检测N末端脑利钠肽前体方法的确定周 薇 韩 江 赵秀丽 万振洲通信作者 泰州市第四人民医院检验科 江苏泰州 225300魏赵延 江苏正大天创生物工程有限公司 江苏泰州 225300摘 要：利用免疫层析技术与荧光微球标记技术相结合的方式，依据双抗体夹心原理，制备N末端脑利钠肽前体免疫层析试纸条；并从灵敏度、特异性、精密度、稳定性等方面进行全面的方法学评价。
利用免疫荧光层析法建立N末端脑利钠肽前体试剂盒，并对试剂盒的各项指标进行评价，建立一种能够定量检测血清N末端脑利钠肽前体的荧光微球免疫层析方法，用于评估心力衰竭，并对试纸条进行性能评估。
结果表明，试剂盒的线性范围为30-35000…ng/l，线性相关系数r≥0.9900，检出限不高于30ng/l，重复性检测结果的变异系数CV≤10%，批间差检测结果的变异系数CV≤15%，试剂盒特异性高，有效期大于24个月。
免疫荧光层析法能有效地检测血清中N末端脑利钠肽前体的含量，该方法稳定性好，具有良好的应用前景。
关键词：N末端脑利钠肽前体 定量检测 免疫荧光层析法N末端脑利钠肽前体是心室受到牵张时心室肌细胞合成和分泌的肽，心室首先合成一种由108个氨基酸组成的脑利钠肽前体（proBNP），proBNP在释放到血液之前降解为有活性的脑利钠肽（BNP）和无活性的NT-proBNP，它在多种病理状态下都会升高，尤其是在循环血量增加致室壁张力增高以及NT-proBNP清除减少的情况下。
与BNP相比，NT-proBNP半衰期更长（60-120min），更稳定（常温下血标本可放置72h），操作的重复性好，检测早期和(或)轻度心力衰竭时的敏感性更高。
由于NT-proBNP浓度可反映短暂时间内新合成的而不是贮存的BNP释放，因此更能反映BNP通路的激活。
大量证据表明，血浆NT-proBNP水平随心力衰竭程度的加重而升高。
目前已成为诊断心力衰竭的重要指标之一。
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莱克多巴胺荧光微球免疫层析检测方法的建立刘道峰;邓省亮;赖卫华;夏骏【摘要】A composition,with a stable character and uniform size,and which contains fluorescent microspheres as a novel label, was obtained successfully by a EDC one-step method. A fluorescent lateral flow assay for detecting ractopamine which has high sensitivity(LOD available is 2. 5ng/mL) , satisfying specificity and a wide range for detecting was developed based on this composition as probe. The method of fluorescent microspheres lateral flow assay is more sensitive than that of colloidal gold lateral flow assay. The novel fluorescent microspheres do contribute to improve the sensitivity of immu-nochromatographic assay.%以荧光微球作为新型标记物,采用EDC法进行偶联,制备莱克多巴胺抗体荧光微球复合物,复合物粒度均一、性质稳定,并以之为探针建立莱克多巴胺荧光微球免疫层析检测方法,检测限为2.5 ng/mL,且特异性强、检测范围宽.与胶体金免疫层析方法相比,荧光微球免疫层析方法的灵敏度更高,新型的荧光微球可以提高免疫层析方法的灵敏度.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2012(028)001【总页数】5页(P73-77)【关键词】荧光微球;莱克多巴胺;免疫层析;检测【作者】刘道峰;邓省亮;赖卫华;夏骏【作者单位】南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;江西省科学院微生物研究所,江西南昌330029;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;江西省兽药饲料监察所,江西南昌 330029【正文语种】中文莱克多巴胺（ractopamine，Rac）是一种属于苯胺类的β－受体激动剂，主要以盐酸盐形式存在。
其具有重新分配机体营养、抑制脂肪沉积、提高蛋白质含量、增加酮体瘦肉率、改善肉质以及促进动物生长的作用［1－3］。
因此，近年来在经济利益的驱使下，大量莱克多巴胺被滥用于畜牧业和养殖业。
人体摄入Rac的量过大时，会导致一系列不良反应，主要有肌肉震颤、心跳和呼吸加快等，严重的会危害生命。
鉴于此，许多国家已经禁止将莱克多巴胺作为饲料及饲料添加剂使用。
如欧盟于1996年便明令禁止在畜牧生产中使用包括莱克多巴胺在内的所有β－肾上腺素兴奋剂类药物，中国农业部亦于2002年明确将其列入《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》。
目前，检测莱克多巴胺比较经典的方法有高效液相色谱－质谱联用法（HPLC－MS）［4］、气相色谱－质谱联用法（GC－MS）［5］、高效液相色谱法（HPLC）［6］，这些都是比较传统的办法，亦是目前的确证方法［7，8］。
另外，目前常用的还有酶联免疫（ELISA）［9］的方法。
但由于以上方法均需先进检测仪器、检测费用昂贵、步骤繁琐、耗时，且对操作人员专业性要求较高，不适用于基层企事业单位的大通量快速筛查检测。
因此，研究莱克多巴胺的快速筛查方法有重要的意义。
荧光微球（fluorescent microspheres，FMs）是指将荧光染料通过物理和化学等方法吸附或包埋到粒子内而形成的，直径在纳米至微米级（0.01～10μm）范围内，受激发光源激发能发出荧光的固体微粒。
相比胶体金等传统标记物（须大量聚集才会被辨别出［10］），它的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限。
在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性［11］。
形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响［12］。
因此，荧光微球作为标记物的免疫层析技术有较高的研究价值与前景。
本试验以荧光微球作为标记物，初步建立了一种快速、灵敏的现场检测方法。
莱克多巴胺、西马特罗、特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇、OVA：美国Sigma公司；BSA：瑞士Roche公司；1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）：上海国药集团化学试剂有限公司；NC膜：CN140，德国Sartorious公司；荧光微球（52.9 mg／m L，表面羧基400 nmol／mg）、Anti－Rac单克隆抗体、Rac全抗原、胶体金、免疫微球复溶液：江西中德生物工程有限公司。
点喷系统：BIO－DOT XYZ－3050，美国BIO－DOT公司；荧光分光光度计：F4500，日本Hitachi公司；超细微粒粒度分析仪：ZLS Nicomp380，美国PSS公司；水处理系统：Milli－Q，美国Millipore公司；可编程切条机：HGS－201，浙江杭州峰航科技有限公司；高速冷冻离心机：H－2050R，湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司；磁力搅拌器，HJ－6，江苏金坛吉特仪器厂；真空干燥箱：DZX－6090B，上海福玛实验设备有限公司。
1.3.1 免疫微球合成及表征以5 m L标记体系分别标记30，40，50μg／mg（抗体／微球）的免疫微球，具体方法：烧杯（用前铬酸浸泡3 d，再用蒸馏水洗涤并浸泡1 d，p H 5.0的PB缓冲液润洗30 min）中加入定量的PB缓冲液（p H 5.0，下同），加入荧光微球2.5 mg，快速搅拌下加入相应标记量的抗体（稀释10倍并缓慢加入），再缓慢加入10 mg／m L EDC 19.2μL（与微球表面羧基摩尔量相等），保证最终体系体积为5 m L。
室温缓慢搅拌反应2 h，再加入500μL 10% （m／m）BSA 封闭 30 min。
8 000 r／min，10 ℃ 离心10 min，弃上清，并以PB清洗，相同条件离心，重悬于500μL免疫微球复溶液中，4℃保存备用。
另分别取荧光微球和不同免疫荧光微球，多次清洗，超纯水重悬，以超细微粒粒度分析仪分别测定不同微球粒度及zeta电位，以荧光分光光度计连续扫描各微球荧光光谱。
1.3.2 结合垫制备以 XYZ3050点喷系统分别将1.3.1步骤中免疫微球复溶液重悬后的3种荧光微球喷涂到结合垫上，喷涂量4μL／cm，得到不同标记量的3种结合垫，30℃真空干燥2 h，干燥保存备用。
1.3.3 Rac NC膜的制备与处理用XYZ3050点喷系统分别在NC膜的适当位置喷涂Rac全抗原、羊抗鼠二抗形成检测线（T线）和质控线（C线），30℃真空干燥1 h，制成Rac NC膜，干燥环境保存。
另取Rac NC膜分别于0.5%BSA（m／m）、0.5%OVA（m／m）中封闭10 min，超纯水漂洗残余封闭剂，沥干水分，30℃真空干燥1 h，干燥保存备用。
1.3.4 荧光微球标记免疫层析试纸条组装分别取1.3.2步骤得到的30，40，50μg ／mg不同标记量结合垫与1.3.3步骤所得的BSA封闭、OVA封闭与未封闭的NC膜，于干燥环境中，依次按聚酯膜、样本垫、结合垫、Rac NC膜、吸水垫的顺序将各部分粘贴于试纸条PVC底板上，用切条机切成4 mm宽的试纸条，组装卡壳，干燥保存。
1.3.5 荧光微球免疫层析检测方法的判定将试纸条平放，滴加样品待检液80μL于加样孔，5 min后于手持式荧光读取仪中观察。
若T线显色（有可见条带）则判读为阴性，样本中不含Rac或低于检测限；T线不显色（无可见条带）则判读为阳性，样本溶液中Rac浓度大于检测限。
若C线不显色，则判定为试纸条无效。
1.3.6 荧光微球免疫层析试纸条参数选取与评价（1）免疫层析最佳参数选取：将Rac标品用甲醇溶解，并用PBS稀释至1 000，100，20，10，5，2.5，1.25 ng／m L。
分别向不同组试纸条滴加以上浓度标品80μL，同时以PBS作阴性对照，按1.3.5所述检测方法分别判断不同组试纸条显色情况。
择优作为本方法最终条件。
（2）灵敏度及检测范围的测定：Rac标准品以甲醇溶解，PBS调整终浓度为10 000，1 000，100，40，20，10，5，2.5，2，1.25 ng／m L，将优化后试纸条，以1.3.5所述方法在Rac浓度0～10 000 ng／m L间判读结果，每个浓度重复5次。
（3）方法特异性：用甲醇稀释RAC的结构类似物西马特罗、特布他林、克伦特罗、沙丁胺醇至1 mg／m L，再用PBS缓冲液稀释至终浓度为1，5，10，50，100，500 ng／m L。
以1.3.5所述的标准方法检测，每个浓度重复5次，判断试纸条的检测特异性。
（4）与胶体金方法的比较：参阅文献［9］将试验所用Anti－Rac单克隆抗体标记到胶体金上，按其相应方法优化工艺参数并组装成胶体金免疫层析试纸条。
按1.3.6（2）方法同时将胶体金试纸条与荧光微球试纸条在Rac浓度为0，1.25，2.5，3，4，5，6，7，8，10，20 ng／m L的添加水平上判断试纸条响应情况及灵敏度，每浓度3个平行。
2.1.1 zeta电位及粒度由图1和图2可知，微球偶联前后在纯水中均带负电荷，zeta电位相对时间均比较稳定；偶联前，微球平均粒径为232.8 nm，颗粒多分散性指数（Variance）为0.167。
表明所用微球在溶液中性质稳定，颗粒规则、大小均匀。
偶联后zeta电势有所下降，平均粒径有所增大（316.8 nm），表明由EDC介导的通过表面羧基的偶联方法成功，多分散性指数依然较小（0.275），说明得到的免疫微球颗粒均一，适合作为免疫层析检测探针。
2.1.2 荧光微球光学性质经荧光分光光度计连续扫描发现所用微球最大激发波长为462.4 nm，最大发射波长为592.8 nm，说明所用荧光微球有较大的Stokes位移，意味着在此微球标记的免疫层析检测中激发光及发射光可以更轻松地被分开，背景干扰较低，故以此微球做免疫层析标记物有较强优势。
由图3可知，经过偶联后，不同抗体标记量的微球发射光谱峰型规则，荧光强度有所降低，但仍与偶联前有相同的峰位，发射谱峰未见漂移。