稀有人参皂苷的制备方法及其抗过敏活性研究

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酶法转化二醇型人参皂甙Rd及制备稀有人参皂甙C-K

酶法转化二醇型人参皂甙Rd及制备稀有人参皂甙C-K张阳;林毅【摘要】利用蜗牛酶酶法对二醇型人参皂甙Rd进行转化,并制备稀有人参皂甙C-K.采用薄层色谱和高效液相色谱法,对转化产物及酶反应相关影响因素进行检测.结果发现:在酶量为166.7μkat·g-1,pH值为5.0,温度为40℃的恒温水浴9h的条件下,酶解人参皂甙Rd可得稀有人参皂甙C-K.在此基础上,研究得到酶反应的最适条件范围:酶量为500.1～833.5μkat·g-1,pH值为3～5,温度为40～50℃,反应时间为6～24h.%Rare ginsenoside C-K was prepared using enzymatic transformation with snailase from protopanaxadiol ginsen-oside Rd. Products and influencing factors of enzymatic transformation were examined by TLC and HPLC. The results showed that rare ginsenoside C-K could be obtained at the following conditions: enzyme amount 166. 7μkat ? G-1, Ph 5. 0, thermostatic water bath at 40 'C for 9 h. Based on that, the optimum ranges of enzyme amount, Ph value, temperature and reaction time were further determined as 500.1~833. 5 μkat ? G-1, Ph 3~5, 40~50 ℃, 6~24 h, respectively.【期刊名称】《华侨大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(032)006【总页数】4页(P668-671)【关键词】酶法转化;二醇型人参皂甙Rd;稀有人参皂甙C-K;蜗牛酶【作者】张阳;林毅【作者单位】华侨大学化工学院,福建泉州362021;华侨大学化工学院,福建泉州362021【正文语种】中文【中图分类】Q541人参皂甙作为人参的主要有效成分，具有广泛的药理作用［1］.稀有人参皂甙C－K是二醇型人参皂甙在人体肠道内经肠道菌的去糖基化后的主要代谢产物和最终吸收形式.它在许多方面都体现了良好的生物活性，尤其在抗肿瘤方面，在体内外均具有良好的抑制癌细胞生长、转移、诱导细胞凋亡等作用［2-3］，现己成为人参皂甙研究的新热点.1996年，Hasegawa等［4-5］运用体外厌氧培养人肠道菌群技术，对人参皂甙的肠道菌代谢过程进行了系统研究，提出了Rb1，Rb2和Rc降解到C－K的具体代谢途径，尤其是深入研究Rb1的代谢途径.目前，利用二醇型人参皂甙Rb1通过酶转化法制取C－K已有很多相关报道，但对于二醇型人参皂甙Rd的研究大多集中在人参皂甙Rd提取、含量测定及药理药效等方面的研究［6］，并未见以人参皂甙Rd为直接底物酶法转化制备稀有人参皂C－K的报道 .鉴于此，本文将利用蜗牛酶对人参皂甙Rd进行转化，并制备人参皂甙C－K.人参皂甙C－K标品（纯度大于98.8%，吉林长春三和参业科技有限公司）；蜗牛酶粗酶（福建漳州金田生物科技公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；高效硅胶板（山东青岛裕民源硅胶试剂厂）；其他试剂均为分析纯.1.2.1 酶活的测定取500μL酶溶液于离心管中，40℃恒温水浴中预热3min；然后，加入1mL，1 mg·mL－1的人参皂甙Rd，及4.0mL，pH＝5.0的磷酸柠檬酸缓冲液，于40℃反应10min，再加入4.5 mL色谱级甲醇终止反应，经高效液相色谱（HPLC）测定稀有人参皂甙C－K的含量.酶活力单位（kat）：在40℃，pH＝5.0的条件下，每分钟生成1μmoL稀有人参皂甙C－K所需酶量定义为1个酶活力单位.经测定，蜗牛酶的β－葡萄糖苷酶酶活为309.56μkat·L－1.1.2.2 蜗牛酶酶解人参皂甙Rd的酶转化反应取5mg人参皂甙Rd，加入1mL，pH＝5.0的磷酸柠檬酸缓冲液溶解，按166.7μkat·g－1的量加入蜗牛酶，混匀；于40℃下恒温水浴9h.终止反应后，进行薄层层析色谱（TLC）检测.1.2.3 薄层层析色谱检测用微量点样器吸取标品及酶解产物溶液，分别点样于薄层板的起始线上，点样次数依据样品浓度确定，每次点样后需用电吹风迅速吹干.将薄层板浸入展开剂（CHCl3－AcOEt－MeOH－H2O＝15∶40∶30∶20），液下层的深度为距薄层板底边1.0cm左右.展开后，取出，吹干，均匀喷以10%的硫酸－乙醇显色剂，于110℃下显色10min，经凝胶成像系统检测结果.1.2.4 高效液相色谱检测在酶解产物中加入反应物1／2体积的正丁醇萃取3次，合并萃取液，挥干；然后，置于10mL容量瓶中，加色谱纯甲醇至刻度，过膜，做高效液相色谱（HPLC）检测.色谱条件：色谱柱选用C18柱Dimension（150mm×4.6mm）；UV检测器；检测波长为203nm；柱温为35℃；流动相为乙腈－水（48∶52）；流速为1.0mL·min－1，进样量为20μL.人参皂甙Rd酶解产物的TLC检测，结果如图1所示 .图1中：编号1～4样品分别为人参皂甙C－K标品，人参皂甙Rd，酶解产物，酶解产物和人参皂甙C－K标品的混合物.从图1可看出，酶解产物与人参皂甙C－K标品有相同Rf值点，与人参皂甙Rd无相同Rf值点.比较酶解产物、酶解产物与人参皂甙C－K标品混合物的图谱可知，混合物中无新Rf值点出现，且混合物与人参皂甙C－K标品同Rf值点的深浅与大小增加.这表明，在酶量为166.7 μkat·g－1，pH＝5.0，40℃恒温水浴9h的酶解条件下，酶解产物中不存在人参皂甙Rd，即已为蜗牛酶水解 .该酶水解人参皂甙Rd的糖基，主要转化为目标产物人参皂甙C－K，还有少量中间产物，转化率较高.人参皂甙Rd酶解产物的HPLC检测，结果如图2所示.样品的保留时间为21.005min，与文献上的人参皂甙C－K数据一致［7］.由于所用流动相为乙腈和水，而溶剂为甲醇所以存在前端杂峰，除溶剂峰之外另有其他杂质峰，说明人参皂甙Rd在本文所述条件下的产物并不单一，与TLC分析结果相符合.2.3.1 不同酶加入量的酶转化反应取5份2mg的人参皂甙Rd，加入1mL，pH＝5.0的磷酸柠檬酸缓冲液，分别加入不同酶量的蜗牛酶，混匀，于40℃恒温水浴9h，终止反应后进行TLC检测，结果如图3（a）所示.图3（a）中：编号1为人参皂甙C－K标品；2～6样品的蜗牛酶酶量分别为166.7，333.4，500.1，666.8，833.5μkat·g－1 .从图3（a）可以看出，当酶量为166.7，333.4 μkat·g－1时，由于酶量不足，故斑点大小与深浅较之酶量为500.1，663.8，833.5μkat·g－1的斑点略小且浅 .酶量增加，产物浓度随之增加，但当酶量为500.1，663.8，833.5μkat·g－1时，这三者的斑点并无较大变化，即此基础上酶量的增加对酶转化反应影响不大.说明酶降解的速度和数量与底物及酶的量有直接关系，结果与酶促反应动力学结论一致.在pH＝5.0，40℃的恒温水浴9h酶解条件下，500.1～833.5μkat·g－1的酶量应为该反应最适酶量范围.2.3.2 不同pH值的酶转化反应取7份2mg的人参皂甙Rd，分别加入1mL不同pH值的磷酸柠檬酸缓冲液，按166.7μkat·g－1加入蜗牛酶，混匀，于40℃恒温水浴9h，终止反应后进行TLC检测，结果如图3（b）所示.图3（b）中：编号1为人参皂甙C－K标品；2～8样品的pH 值分别为2.6，3.2，3.8，4.4，5.0，5.6，6.2.从图3（b）可以看出，当反应pH 值大于5.6或pH 值小于3.2时，对酶转化反应影响较大.究其原因可能是过高或过低的pH值影响了酶蛋白的结构和功能，导致了酶催化活性的下降.检测结果说明：蜗牛酶在pH＝3～5稳定，高于或低于此范围，酶活力明显降低，对酶解反应影响较大.这表明，酶量为166.7μkat·g－1，于40℃恒温水浴9h的酶解条件下，该反应最适pH范围为3～5.2.3.3 不同反应温度的酶转化反应取5份2mg的人参皂甙Rd，分别加入1mL，pH＝5.0的磷酸柠檬酸缓冲液，按166.7μkat·g－1加入蜗牛酶，混匀，于不同温度条件下恒温水浴9h，终止反应后进行TLC检测，结果如图3（c）所示.图3（c）中：编号1为人参皂甙C－K标品；2～6样品的反应温度分别为30，35，40，45，50℃.从图3（b）可以看出，当反应温度为30，35℃时，温度较低，导致酶活力降低，使得酶反应速度较慢，目标产物较少，对酶解反应影响较大；随着温度的升高酶活力增大，但在40～50℃温度范围内，温度对酶解反应无较大影响.这表明，在酶量为166.7μkat·g－1，pH＝5.0，恒温水浴9h酶解条件下，该酶解反应最适温度范围为40～50℃.2.3.4 不同反应时间的酶转化反应取7份2mg的人参皂甙Rd，分别加入1mL，pH＝5.0的磷酸柠檬酸缓冲液，按166.7μkat·g－1加入蜗牛酶，混匀，于40℃恒温下水浴反应不同时间，终止反应后进行TLC检测，结果如图3（d）所示.图3（d）中：编号1为人参皂甙C－K标品；2～8样品的反应时间分别为6，9，12，15，18，21，24h.从图3（d）可以看出，当反应时间在6～24h范围内，不同的反应时间对酶转化反应影响不大，且酶解反应在此时间范围内均有较高转化率，说明蜗牛酶酶解时间短，转化效率高.在酶量166.7μkat·g－1，pH＝5.0，40℃酶解条件下，该酶解反应最适时间范围为6～24h.利用生物转化法对天然产物进行生物转化或结构修饰，是当今研究的热点.文中研究表明：利用蜗牛酶粗酶可将含量较高的天然皂甙人参皂甙Rd转化为经济价值更大、更具生物活性的稀有人参皂甙C－K.所用蜗牛酶粗酶转化效果良好，价格低廉，约为精制蜗牛酶制剂价格的1／5，蜗牛酶粗酶的选用大大降低了酶在生产成本中的比例.工业酶制剂转化法既可以减少制备工艺的繁琐，又可避免过多副产物的生成，便于产物的分离纯化.明艳林［7］曾选用果胶酶、纤维素酶、β－葡萄糖苷酶、蜗牛酶、柚皮苷酶和木聚糖酶等6种酶酶解转化二醇组皂甙Rb1获取稀有人参皂甙C－K.研究结果发现：在同等条件下，蜗牛酶是6种酶中转化效率最高的酶，且中间产物少，酶解转化完全.这6种酶为酶解转化皂甙类物质常用酶，基于蜗牛酶酶解特点，文中选用蜗牛酶来进行酶解转化.人参皂甙Rd分子中糖基的连接键是β－糖苷键，酶解过程中，蜗牛酶中所含β－葡萄糖苷酶水解人参皂甙Rd分子上的C－20位和C－3位糖苷键，主要产物为稀有人参皂甙C－K.迄今，二醇型人参皂甙代谢成C－K的途径已基本明了，尤其对于Rb1代谢到C－K的具体途径研究的较为清楚.依据文献［7－8］，推测人参皂甙Rd代谢至C－K途径如下：人参皂甙Rd C－3位末端糖苷键断裂，失去一份子葡萄糖，形成F2；然后，F2进一步代谢，C－3位末端糖苷键断裂，失去一分子葡萄糖，形成稀有人参皂甙C－K.人参皂甙Rd代谢成C－K的具体过程，有待进一步验证.1976年，日本学者Nagai等从绞股蓝中分离出84种皂甙类物质.其中Ⅲ，Ⅳ，Ⅷ，，Ⅻ分别与人参皂甙Rb1，Rb3，Rd，F2化学结构完全相同［9-10］.绞股蓝中的总皂甙含量是人参皂甙的3倍，其人参皂甙Rd含量是人参的8倍［11］，理论上可利用绞股蓝制取C－K.我国绞股蓝资源丰富，且绞股蓝相对人参价格要廉价很多，以绞股蓝作为原料可以大大降低成本，更适于工业化生产.目前，仅有少量文献报道有利用酸法水解绞股蓝皂甙［12］获得抗癌药物，但酸法水解副产物多，难于分离纯化并且污染环境.除此之外，绞股蓝的研究更多的仅仅体现在对绞股蓝总皂甙基础研究和简单的开发利用层面，并没有太多深层次的开发产品问世.本实验利用蜗牛酶粗酶转化二醇型人参皂甙Rd并制取稀有人参皂甙C－K，为绞股蓝的深度利用奠定了基础.【相关文献】［1］王本祥.人参的研究［M］.天津：天津科学技术出版社，1985：107.［2］弓晓杰.人参皂苷酶代谢产物化学修饰及其抗癌活性研究［D］.吉林：吉林农业大学，2004. ［3］周伟，周珮.稀有人参皂苷Compound K研究进展［J］.药学学报，2007，42（9）：917－923.［4］HASEGAWA H，SUNG J H，MATSUMIYA S，et al.Main ginseng saponin metabolites formed by intestinal bacteria［J］.Planta Med，1996，62（5）：453－457.［5］HASEGAWA H，SUNG J H，BENNO Y.Role of human intestinal prevotella oris in hydrolyzing ginseng saponins［J］.Planta Med，1997，63（5）：436－440.［6］周超群.人参皂甙 Rd的研究进展［J］.中草药，2009，40（5）：832－836.［7］明艳林.人参皂甙肠道代谢物IH－901抗肝癌分子靶点研究［D］.厦门：厦门大学，2007. ［8］周伟.稀有人参皂甙Compound－K的制备和活性研究［D］.上海：复旦大学，2008. ［9］朴香兰，吴倩.绞股蓝研究进展［J］.时珍国医国药，2010，21（7）：1758－1760. ［10］刘欣，叶文才，萧文鸾，等.绞股蓝的化学成分研究［J］.中国药科大学学报，2003，34（1）：21－23.［11］岳琳娜，高学玲，岳鹏翔.绞股蓝有效成分的研究进展［J］.饮料工业，2008，11（6）：9－12.［12］许志超，韩凌，赵余庆.绞股蓝总皂苷水解产物中稀有抗肿瘤活性成分的化学［J］.亚太传统医药，2008，4（11）：41－43.。

人参皂苷生物转化研究进展

人参皂苷生物转化研究进展人参皂苷是人参属植物药理活性的重要物质，尤以稀有人参皂苷及苷元的抗肿瘤，保护神经系统，保肝护肝等药理活性最为显著，因此，研究稀有人参皂苷获取的方法也日益增多。

该文对人参属植物中人参皂苷的生物转化进行了简要的概述和展望。

标签：人参属；皂苷类；生物转化；稀有人参皂苷；β-葡萄糖苷酶五加科人参属植物人参、西洋参、三七均是我国传统名贵药材，现代研究表明，其主要活性成分大多为人参皂苷。

据现代药理学研究表明[1-3]，皂苷类是人参属植物抗疲劳，抗肿瘤，抗血栓，提高免疫力，调节生理机能等药理活性的重要物质基础。

但随着人们对人参属总皂苷分离后的进一步药理活性研究发现，稀有人参皂苷及苷元（如人参皂苷Rg3，Rh1，C～K，Rb3，Rh2等）具有很强的抗肿瘤[4]，保护神经系统[5]，保肝护肝[6]等药理活性。

人参属植物中皂苷的成分主要是人参皂苷，其骨架结构属于达玛烷型四环三萜和齐墩果烷型三萜，以三七为例，三七中所含有人参皂苷依据苷元的不同又可分为原人参二醇型和原人参三醇型，如人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd等和人参皂苷Re，Rg1，Rg2，Rf等。

人参属植物三七总皂苷（PNS）的主要成分是人参皂苷Rb1和Rg1[7]，据研究表明这些主要人参皂苷成分在人体肠道中的吸收却微乎其微[8]，而通过口服后经胃酸及肠道菌的一系列生物转化代谢后产生的次级代谢产物，如C-K，与大量天然富含的人参皂苷相比具有更好的抗肿瘤，抗过敏，抗炎症作用[9，10]，同时也显著地增加了其在人肠道中的吸收率，也正是由于其变化后明显提高的抗肿瘤等药理活性，近年来引起了研究者的广泛的关注。

目前，根据大量人参皂苷与稀有人参皂苷的结构鉴定，得出二者的结构差异主要是达玛烷骨架结构的C-3、C-6和C-20位上支链所连接的糖基的种类和数量有所不同，进而设法通过多种技术手段去除骨架结构达玛烷四环三萜这些支链上所连接的糖基来获得稀有人参皂苷成为人们研究的热点。

理化及生物转化稀有人参皂苷的方法

颜红娇，赵庆宇靖，郭琰，等.理化及生物转化稀有人参皂苷的方法［J ］.中南农业科技，2024，45（4）：238-241．稀有人参皂苷不是植物的天然成分，仅存在于红参、黑参等炮制人参中，因其含量极低（仅含万分级），故称为稀有人参皂苷。

市售的稀有人参皂苷均为原人参皂苷（如Rb 1、Rb 2、Rb 3、Rc 、Re 等）的代谢衍生物，由于原人参皂苷化学结构中的糖基数目存在不同程度的减少［1］，表现出较强的细胞膜穿透性，从而导致稀有人参皂苷具有较高的药理活性［2］，如抗肿瘤［3］、抗炎［4］、改善记忆［5］等。

临床研究较多的是Rg 3、Rh 2、CK 等，尽管药理活性强大、临床疗效显著，但因数量稀少，价格居高不下，因此开发可以将原人参皂苷高效定向转化为稀有人参皂苷的技术显得尤为重要。

本研究主要从生物、化学、物理的角度，总结、归纳和分析稀有人参皂苷的制备方法，以期为稀有人参皂苷的制备及大批量生产提供参考。

1生物转化法1.1酶转化糖苷酶为最常用的转化酶［6］，如采用嗜热的β-葡萄糖苷酶对人参原三醇组皂苷进行酶解，能得到稀有人参皂苷Rg 2和Rh 1［7］。

若人为干扰糖苷酶致其基因突变［8］，则突变后的糖苷酶转化人参皂苷形成稀有人参皂苷的能力大幅提高。

除糖苷酶外，还有一些转化效率较高的酶，如重组内切纤维素酶［9］能够将三七、三七花中的总皂苷转化成稀有皂苷F 2、Rh 2、Rk 1等；蜗牛酶能将人参皂苷Rb 1转化成稀有人参皂苷CK ［10］；人参皂苷Ⅲ型酶能将Rb 1转化为稀有人参皂苷Gyp 17和Gyp 75［11］。

在酶转化技术的基础上，用联合超声技术制备稀有人参皂苷CK ，以人参总皂苷计，转化率高达6.91%［12］，适用于工业生产。

1.2微生物转化五加科植物，如西洋参、刺五加、人参等，其根际土壤中含有较多能参与稀有人参皂苷转化的微生物。

西洋参根际土壤中分离出的菌株可以特异性转化人参皂苷Rb 1为稀有人参皂苷CK ［13］；刺五加根际土壤中分离出的菌株可以转化人参皂苷Rb 1、Rd 产生稀有人参皂苷Rg 3［14］；人参根际土壤中分离出的菌株可以特异性转化人参皂苷Rb 1为稀有人参皂苷Rd ［15］。

什么是稀有人参皂苷？

什么是稀有人参皂苷？要了解稀有人参皂苷，先了解人参皂苷。

人参皂苷是科学家从五加科植物（如西洋参、人参、高丽参等）中提取出的一种四环三萜类皂苷。

从上世纪60年代开始，由于科学家发现人参皂苷具有抗癌活性，人参皂苷成为抗癌天然药物研究的一个热门领域。

稀有人参皂苷活性更强在研究的过程中，科学家发现人参皂苷经过转化后的次级代谢衍生物，具有更强的生物活性。

于是科学家将这种次级代谢衍生物命名为“稀有人参皂苷”，而将直接从五加科植物中提取出来的人参皂苷成为“原型人参皂苷”。

由于稀有人参皂苷具有更强的抗癌活性，对于人参皂苷的研究重点逐渐聚焦在稀有人参皂苷上面。

经过半个多世纪的研究，科学家目前已经发现了60多种稀有人参皂苷，包括Rk2、Rg3、Rh2、Rg5、Rk1、Rk3、Rh1、Rh3、Rh4、aPPT、aPPD等。

这些稀有人参皂苷所具备的抗癌作用各不相同。

稀有人参皂苷不仅仅是Rh2和Rg3由于目前稀有人参皂苷的研究开发和应用程度不同，人们对稀有人参皂苷的认识也不相同。

在国内，稀有人参皂苷Rh2和Rg3是目前在抗癌领域应用最多的，所以很多人对这两种稀有人参皂苷都有一些了解。

这也让不少人对稀有人参皂苷存在一个误区，以为具有抗癌作用的稀有人参皂苷只有这两种。

其实在国外，稀有人参皂苷的抗癌应用早已超出了Rh2和Rg3这两种，Rk2、Rg5、Rk1、Rk3、Rh1、Rh3、Rh4、aPPT、aPPD等这些稀有人参皂苷，都已经有了相关的抗癌产品，甚至已经有了将多种稀有人参皂苷聚合在一起的产品。

稀有人参皂苷活性强弱比较既然已经这么多种稀有人参皂苷被应用于抗癌产品，人们不禁会问，那这些稀有人参皂苷的活性谁强谁弱呢？加拿大科学家通过实验测定了部分稀有人参皂苷的活性，并进行比较，其结果如下：Rg3<Δ(20-22)PPD=Rg5≤aPPT=Rk1和Rg5混合物=Rh2 ≤Δ(20-21)PPD<aPPD=Δ(20-21)PPT = Δ(20-22)PPT = Rk2和Rh3混合物≤Rk2=Δ(20-21) PPD和Δ(20-22) PPD混合物从测定结果来看，目前在国内应用比较广的稀有人参皂苷Rg3和Rh2，其活性并不占优势。

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稀有人参皂苷的制备方法及其抗过敏活性研究人参皂苷是五加科人参属植物（人参、西洋参、三七等）的主要药效成分,具有增强免疫、调节中枢神经、保护心脑血管、抗肿瘤以及抗疲劳等多种药理作用。

人参皂苷分为常见人参皂苷和稀有人参皂苷,其中常见人参皂苷是指在人参属植物中含量较高的人参皂苷（如人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1等）,而稀有人参皂苷则是指在人参属植物中含量较低或不存在的人参皂苷,大都属于常见人参皂苷脱去部分糖基,或脱去糖基的同时母核侧链结构发生改变所产生的次级人参皂苷（如人参皂苷20（R/S）-Rg3、20（R/S）-Rh2、20（R/S）-Rh1、Rk1、Rg5、Rk2、Rh3、F4、Rg6、Rk3、Rh4等）。

药理研究表明,相比于常见人参皂苷,稀有人参皂苷具有更为突出的抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化等生物活性。

关于稀有人参皂苷抗过敏活性的研究进展较为缓慢,仅有的几篇关于稀有人参皂苷单体抗过敏活性的研究报道也只是停留在活性验证阶段,鲜少有关于稀有人参皂苷抗过敏活性的构效关系以及作用机制方面的研究,更没有利用稀有人参皂苷混合物（有效部位）或单体研制开发抗过敏中药新药的报道。

目前稀有人参皂苷的制备方法有酸催化降解法、碱催化降解法、酶降解法、微生物降解法等,但这些方法存在制备效率低、副产物多、制备成本高、环境污染等诸多缺点。

因此,对稀有人参皂苷的新制备方法及其抗过敏活性进行深入研究,不仅具有重要的学术意义,亦对发掘稀有人参皂苷新的医药用途具有推动作用。

基于上述研究现状,本文首先对稀有人参皂苷混合物及单体的制备方法进行了研究,建立了新的稀有人参皂苷混合物及单体的制备方法,并分别通过OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型、抗原诱导的大鼠嗜碱性细胞白血病细胞株（rat basophilic leukemia cell line,RBL-2H3）脱颗粒模型和抗原诱导的Th1/Th2免疫失衡模型,对稀有人参皂苷混合物及其中部分单体的抗过敏活性进行了深入研究,并探讨了其作用机制。

首先,采用酸降解法制备了人参皂苷降解产物,并结合硅胶柱层析法、制备高效液相色谱法及NMR等手段,从中分离、鉴定了15种稀有人参皂苷单体。

接着以它们作为标准品,建立了稀有人参皂苷的HPLC含量测定方法并进行了方法学考察,结果表明,15种稀有人参皂苷的线性关系（R2>0.9990）、日内精密度（RSD<3%）、日间精密度（RSD<4%）、稳定性（RSD<3%）、重复性（RSD<3%）均良好,加样回收率在94.11%113.15%之间（RSD<3%）。

基于上述定量方法,本文对高温高压法制备稀有人参皂苷混合物的条件进行了优化,考察了料液比、提取温度和提取时间对稀有人参皂苷得率的影响,并根据实验结果建立了新的稀有人参皂苷混合物的制备方法。

实验结果表明,料液比1:12,提取温度145℃,提取时间2 h为最佳提取条件。

在该条件下制备的稀有人参皂苷混合物,产物中包含多达15种稀有人参皂苷,它们分别是人参皂苷Rk3、Rh4、20（S）-Rg2、20（S）-Rh1、20（R）-Rh1、Rg6、F4、Rk1、Rg5、20（S）-Rg3、20（R）-Rg3、20（S）-Rh2、20（R）-Rh2、Rk2、Rh3,其中含量较高的成分是人参皂苷20（S）-Rg2、20（S）-Rh1、20（R）-Rh1、Rk1、Rg5、20（S）-Rg3、20（R）-Rg3。

本方法制备的稀有人参皂苷混合物与回流提取法制备的提取物相比较,稀有人参皂苷的得率是回流提取法的3.93倍,稀有人参皂苷总含量是回流提取法的14.74倍,而且经进一步纯化后,混合物中稀有人参皂苷含量之和大于50%。

在稀有人参皂苷的抗过敏活性研究中,本文首先利用OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型,分别考察了稀有人参皂苷混合物对肺组织病理学、免疫器官质量、脾脏T细胞中CD4+和CD8+T细胞的比值、血清中总Ig E水平以及肺泡灌洗液中细胞因子水平的影响。

实验结果显示,稀有人参皂苷混合物能够减轻哮喘小鼠肺组织中的炎性症状,减弱脾脏质量的升高趋势和胸腺质量的降低趋势,减弱脾脏中CD4+和CD8+T细胞的比值的降低趋势,降低血清中总Ig E水平及肺泡灌洗液中IL-4水平,从而发挥抗过敏作用。

为进一步明确稀有人参皂苷混合物中发挥抗过敏作用的稀有人参皂苷单体,即为了明确有效成分,本文利用抗原诱导的RBL-2H3细胞脱颗粒模型,考察了生物活性研究相对集中的8种原人参二醇型稀有人参皂苷单体（人参皂苷Rk1、Rg5、20（S）-Rg3、20（R）-Rg3、20（S）-Rh2、20（R）-Rh2、Rk2、Rh3）对细胞脱颗粒的影响。

首先通过优化实验,确立了抗原诱导RBL-2H3细胞脱颗粒模型的最优条件,即抗DNP-Ig E单抗浓度为0.125μg/m L,DNP-BSA浓度为0.125μg/m L,激发时间为1 h。

活性实验结果表明,人参皂苷Rg5和Rh3对RBL-2H3细胞脱颗粒过程中β-HEX的释放具有显著的抑制作用,人参皂苷20（S）-Rh2具有一定的抑制作用,其他稀有人参皂苷无明显活性;进一步的研究还表明,人参皂苷Rg5和Rh3可能是通过抑制肥大细胞胞外Ca2+内流起到抑制脱颗粒作用。

人参皂苷Rg5是人参皂苷20（S）-Rg3 C20-22位脱水产物,而人参皂苷Rh3是人参皂苷20（S）-Rh2 C20-22位脱水产物,它们的活性均比对应的原人参皂苷强,说明在稀有人参皂苷抑制肥大细胞β-HEX释放过程中C20-22位双键可能发挥了关键作用。

在上述实验中,人参皂苷20（S）-Rh2对肥大细胞β-HEX的释放具有一定的抑制作用,人参皂苷20（R/S）-Rg3无抑制作用,然而文献记载人参皂苷Rh2和Rg3具有潜在的抗过敏活性。

考虑到人参皂苷20（S）-Rh2和20（R/S）-Rg3可能通过其它途径发挥抗过敏作用,本文进一步考察了其对Th1/Th2免疫平衡的调节作用。

通过抗原诱导的Th1/Th2免疫失衡模型,分别研究了人参皂苷20（S）-Rh2和20（R/S）-Rg3作用后的朗格汉斯状树突细胞（Langerhans cell-like dendritic cells,LDCs）对Th1/Th2免疫失衡的影响。

首先考察了稀有人参皂苷作用后的LDCs对小鼠腘窝淋巴结细胞表面Th1/Th2细胞因子和趋化因子受体表达的影响,然后研究了稀有人参皂苷对LDCs 功能的具体影响。

结果表明,人参皂苷20（S）-Rh2和20（R/S）-Rg3均具有抗过敏活性,人参皂苷20（S）-Rh2主要通过上调LDCs表面CD40的表达,诱导T细胞向Th1方向分化,从而调节Th1/Th2免疫平衡;而人参皂苷20（R/S）-Rg3主要通过下调LDCs表面TIM-4的表达,抑制T细胞向Th2方向分化,从而调节Th1/Th2免疫平衡,且人参皂苷20（R）-Rg3具有更强的活性。