细胞培养与细胞生物学常用技术讲课教案

细胞培养与细胞生物学

常用技术

目录

实验一软琼脂克隆形成 (2)

实验二细胞划痕愈合 (4)

实验三细胞活力检测 (6)

实验四细胞免疫荧光 (8)

实验五细胞转染 (12)

实验六细胞总RNA提取 (15)

实验七逆转录反应 (18)

实验八Real Time PCR (20)

实验一软琼脂克隆形成

【原理】

正常情况下，贴壁生长的细胞必须依附在固体基质上才能生长，将其悬浮于液体或半固体基质中培养则难以增殖，这种现象称为锚定依赖性生长（anchorage dependent growth）。而某些细胞在在被转化后，例如恶性肿瘤细胞，可以不依赖固体基质，在半固体（琼脂、甲基纤维素）培养基中也可增殖并形成细胞集落，这种现象称为锚定非依赖性生长（anchorage independent growth）。锚定非依赖性生长是肿瘤细胞的一种标识，也是检测恶性转化细胞较为准确的标志之一。软琼脂克隆形成技术，则是在体外水平检测肿瘤细胞和转化细胞系锚定非依赖性生长能力最常用的手段之一。该技术利用低熔点琼脂糖模拟体内细胞所处的半固体状态，并将细胞消化成单细胞，使细胞处于不贴壁及单细胞状态。经过三周左右的生长，通过比较克隆形成率，来比较不同细胞或同一种细胞在不同的处理之后的转化及锚定非依赖生长的能力。因此，软琼脂克隆形成实验是肿瘤研究领域一种重要的体外检测技术。

【材料】

1、仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酒精灯、高压灭菌锅、水浴锅；

2、试剂：DMEM培养基、胎牛血清、无水乙醇、75%乙醇、PBS 溶液、0.25%胰酶溶液、低熔点琼脂糖；

3、细胞株：肝癌细胞系HepG2；

【步骤】

1、配制1.2%和0.7%的低熔点琼脂糖，高压灭菌后置于42℃水浴锅（或者恒温温箱）中，使其保持融化状态；

2、配制2x DMEM培养基（含20%FBS、2x抗生素），37℃预热；

3、将1.2%的低熔点琼脂糖胶与2x DMED培养基等体积混合，将混合液加入到6孔板中，每孔1.5mL，轻轻混匀，避免产生气泡，室温放置待其凝固；

4、取对数生长期的细胞，胰酶消化后尽量吹散细胞，制成单细胞悬液，取出10μL，细胞悬液进行细胞计数，用无血清培养基稀释细胞至1x104个/mL；

5、待下层胶完全凝固后，各取1.5mL的0.7%琼脂糖胶与2x培养基进行等体积混合，加入300μL细胞悬液，充分混匀后入6孔板中，每孔1mL（即1000个细胞/孔），每种细胞设置3个平行孔；

6、将6孔板置于CO2培养箱中孵育培养2-3周后，每孔加入1mL 0.1%结晶紫染色，室温染色10min，再用清水洗30min，镜下拍照，计数并分析克隆形成情况。

实验二细胞划痕愈合

【原理】

细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的浓度梯度后而产生的移动。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫应答、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。细胞划痕愈合实验（wound healing）简称划痕实验，是最早用来研究细胞迁移的体外实验，操作简单，经济实惠，因而被广泛应用。

细胞划痕愈合的操作过程十分简单，基本的步骤包括“划痕”的制造，细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。具体过程为：当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”；然后置于显微镜下连续拍照，记录划痕边缘的细胞逐渐进入空白区域，即“划痕”愈合的过程，最后根据“划痕”愈合的速率反映细胞迁移的速率。

【材料】

1、仪器：CO2培养箱、活细胞工作站、超净工作台、酒精灯；

2、试剂及耗材：DMEM培养基、胎牛血清、75%乙醇、PBS溶液、0.25%胰酶溶液、30mm直径细胞培养皿、尺子、记号笔；

3、细胞株：肝癌细胞系HepG2；

【步骤】

1、培养皿接种细胞前，先用直尺测量，并在培养皿背面做“横

线”标记，大约每隔0.5～1.0cm一条，一共5条线；

2、取处于指数生长的细胞，胰酶消化后收集细胞沉淀，细胞计数后稀释至2.5x105个/mL；

3、取背面做好标记的培养皿（直径30mm），每皿接种2mL细胞，置于培养箱培养34h；

4、取出细胞培养皿，用10μL枪头比着直尺，垂直于底面的横线划痕；

5、加入1mL PBS缓冲液，清洗细胞3次，洗去划痕产生的细胞碎片；

6、加入2mL无血清培养基，置于活细胞工作站下拍照24h，每小时拍一张照片；

7、根据收集图片数据分析实验结果，计数细胞迁移率。

迁移率=【（T0时划痕宽度值-Tt时划痕宽度值）/T0时划痕宽度值】x100%

实验三细胞活力检测

【原理】

最常用的细胞活力检测方法为噻唑蓝比色法（MTT法）。MTT全称为3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体内琥珀酸脱氢酶可以将外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，但死细胞没有此功能，因此结晶形成的量与活细胞数成正比。DMSO 能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。由于该方法灵敏度较高，而且相对比较经济，因此广泛应用于药物筛选等细胞毒性检测领域。

【材料】

1、仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、酒精灯、多功能酶标仪；

2、试剂：细胞培养基、胎牛血清、MTT（5mg/mL）、DMSO、75%乙醇、PBS溶液、顺铂母液

3、细胞株：肝癌细胞系HepG2；

【步骤】

一、细胞接种

1、从CO2培养箱中取出细胞培养瓶，吸弃培养基，PBS洗涤2次，胰酶消化后，加入培养基重悬细胞并转移至离心管中；

2、800rpm离心2min，弃上清；