细胞生物学常用技术共99页

细胞生物学技术课件

数据显示：FCM的数据
显示方式包括单参数直 X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用
方图、二维点图、二维等高图、假三维图和列
“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系或对数关系
表模式等。
Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率
二维等高图
一是作为领导干部一定要树立正确的权力观和科学的发展观，权力必须为职工群众谋利益，绝不能为个人或少数人谋取私利
细胞生物学技术
—流式细胞仪应用： ❖ 目前流式细胞仪(FCM)已在各学科中获得应
用。
❖ 细胞生物学：定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如 DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体,等等。
一是作为领导干部一定要树立正确的权力观和科学的发展观，权力必须为职工群众谋利益，绝不能为个人或少数人谋取私利
一是作为领导干部一定要树立正确的权力观和科学的发展观，权力必须为职工群众谋利益，绝不能为个人或少数人谋取私利
细胞生物学技术
★流式细胞术 ★Western Blot ★蛋白质芯片
一是作为领导干部一定要树立正确的权力观和科学的发展观，权力必须为职工群众谋利益，绝不能为个人或少数人谋取私利
FALS Sensor
Fluorescence detector
+
一是作为领导干部一定要树立正确的权力观和科学的发展观，权力必须为职工群众谋利益，绝不能为个人或少数人谋取私利
细胞生物学技术
—流式细胞仪

细胞生物学重要技术

三、显微操作技术
• 在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。视野内移动的机械装置。 • 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。胚胎移植以及显微切割等。 –细胞核移植技术已有几十年的历史， Gordon 等人细 1962）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。（ 1962 ）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等上个世纪70 年代在鱼类细胞核移植方面学者童第周等上个世纪 70年代在鱼类细胞核移植方面 70 进行了许多工作，并取得了丰硕成果。进行了许多工作，并取得了丰硕成果。
（一）透射电子显微镜
1. 原理
• 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，波长与加速电压(通常50～120KV)的平方根成反比。波长与加速电压(通常50～120KV)的平方根成反比。 50 KV)的平方根成反比 • 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、统、电源系统等5部分构成。电源系统等5部分构成。 • 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。分辨力0 nm，放大倍数可达百万倍。 • 用于观察超微结构，即小于 0.2µm、光学显微镜下无法看用于观察超微结构，即小于0 m 清的结构，又称亚显微结构。清的结构，又称亚显微结构。
• 原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 • 分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。 • 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。

细胞生物学课件PDF 细胞生物学技术

戊二醛 CH2
C
O
H
包埋剂: 环氧树脂(万能胶)
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首页
不使用超薄切片的
透射电镜技术
负染法和投影法
负染法是在将颗粒和纤
维样品分散在具有亲水性支撑膜的载网上以后，滴加磷钨酸或醋酸双氧铀等染料，并随即吸去多余的染液。样品干燥后残余染料将沉积在样品的周围以及样品的凹陷、空隙处，而样品本身反而呈浅色，故称为负染。
把放射性前体(例如3H-胸苷、14C-尿苷和
3H-亮氨酸分别是DNA、RNA和蛋白质合成的前
体)加到细胞中，使放射性前体与已存在的前体
分子混合，因为它们原子之间仅是原子核重量
不同，而化学性质相同，这样，细胞就以同样
方式对其产生反应。
蛋白质
3H-亮氨酸
细胞
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2.3.3. 放射自显影技术
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首页用超速离心机分离细胞器和大分子
用制备超速离心机可从细胞匀浆的混合物中分离出细胞的各种组分。
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首页离心级段
图解表示如何用递增的速度反复离心、分离纯化细胞提取液较小的细胞组分一般要求巨大的离心力速度才能沉淀。图中备个离心级段的典型数值：
低速： 1000g l 0分钟中速： 2000g 20分钟高速： 80000g 1小时超高速：150000g 3小时
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首页复型和冷冻蚀刻技术
升华后，细胞内外
凡空隙处或含游离水较多的地方将下陷，从而除上述膜的脂质面外，其他一些结构也被显示出来，并进一步增强了断面的浮雕效果。

细胞生物学技术[PPT课件]

优点：
细胞生物学技术
—流式细胞仪
❖ 1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器中，就会得出数据。
❖ 2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。
❖ 3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰，又可测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
-
Charged Plates
中；其它液体被当作废
液抽吸掉，某些类型的
仪器也有采用捕获管来
进行分选的。
Single cells sorted
into test tubes
FALS Sensor
Fluorescence detector
+
细胞生物学技术
—流式细胞仪
单参数直方图（Histogram）
数据处理原理：FCM的数据处理主要包括数据的显示和分析，至于对仪器给出的结果如何解释则随所要解决的具体问题而定。
细胞生物学技术
—流式细胞仪应用：
❖ 目前流式细胞仪(FCM)已在各学科中获得应用。
❖ 细胞生物学：定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如 DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分析，并可纯化X或Y染色体,等等。
细胞生物学技术
细胞生物学技术
—流式细胞仪
工作原理
流式细胞仪技术，主要是测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器 (光电倍增管或一个固态装置)，光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析。如左图所示。

细胞生物学技术

第二章细胞生物学技术细胞生物学的发展是与实验技术的进步密切相关的，细胞生物学的每一个重大进展都是由于引入了新的研究技术的结果。

光学显微镜的发明开创了细胞学，电子显微镜的出现使人们对细胞结结构的认识深入到超微结构水平。

细胞化学和分析细胞学技术可对细胞的各种成分进行定位和定量的分析，有利于细胞结构与功能的研究。

细胞培养技术可将细胞在体外环境中生长，在体外研究细胞的结构、功能和生命活动规律，而细胞工程技术则可人为地将细胞进行改造，以获得具有特定生物学特性的细胞。

近年来，分子生物学技术的广泛应用，更有力地推动了细胞生物学的发展。

细胞生物学技术种类很多，包括物理技术、化学技术和实验生物学技术等，本章仅对主要的细胞生物学技术作简略的介绍，对于在细胞生物学研究中广泛应用的分子生物学技术，由于篇幅有限，本书不作介绍了。

第一节显微镜技术显微镜技术是细胞学和细胞生物学得以建立和发展的重要工具，包括光学显微镜（light microscope）、电子显微镜(electron microscope )和扫描探针显微镜(scanning probe microscope)三个层次的显微镜和相应的技术。

在光学显微镜下看到的细胞结构称为细胞显微结构（microscopic structure），由于受到分辨率的限制，光学显微镜不能分辨直径小于0.2μm的结构，如生物膜、细胞骨架和一些细胞器等。

电子显微镜下则可以观察到这些光学显微镜下看不到的结构，称为细胞亚显微结构（submicroscopic structure）。

随着电子显微镜分辨率的不断提高，再结合一些其他技术如扫描探针显微镜和X光衍射等，己使人们对细胞结构的认识达到分子水平。

一般把细胞从亚显微水平到分子水平的结构统称为细胞超微结构（ultrastructure）。

图2-1显示了不同分辨率时所看到的拇指表皮结构，从大体、显微、亚显微、一直到分子、原子水平。

图2-1 细胞与原子比例图（引自Alberts等，2002）参照前书图2-1一、显微镜与分辨率人类最初只是用肉眼直接观察周围世界，可是人眼观察事物的能力是有限的，一般情况下在25cm的明视距离内，只能分辨相距0.1～0.2mm的两个物体，如果小于这一距离，人的眼睛就不能分辨。

细胞生物学研究技术

二、生物化学与分子生物学技术
（一）、细胞化学技术
组织化学或细胞化学染色（histochemical or cytochemical staining）是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。
2 光镜标本的制备
以石蜡切片为例：
材料处理
固定脱水
切片染色
观察
包埋
染色剂：普通染色剂，荧光染色剂
3 光镜技术的应用 A 观察活细胞的形态结构，生命运动，
细胞周期。 B 细胞器的定位及功能研究。 C 基因产物与大分子物质的定位及定量。 D 监测细胞代谢活动。
例：胞内钙离子浓度的监测
钙是通用的第三信使，能特异地选择性地调节细胞的活动，因此测定细胞中钙离子浓度在空间和时间上的变化，对于监控许多细胞的生理活动有重要作用。如受精时，卵细胞突然定位地将钙离子释放到胞浆中。
（五）、分子杂交技术
分子杂交技术（molecular hybridization）是在研究DNA分子复性变化基础上发展起来的一种技术。其原理是，具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成 DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。
D 倒置显微镜
组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。
E 荧光显微镜
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。

细胞生物学全套ppt课件

染色质与染色体的相互转化及生物学意义
染色体的形态结构：着丝粒、端粒、异染色质等
DNA复制、转录和翻译
01
02
03
04
DNA复制的过程、特点及意义
转录的过程、特点及意义
翻译的过程、特点及意义
基因表达的调控机制
05
细胞增殖与细胞周期
细胞增殖的方式与意义
细胞增殖的方式
真核细胞主要通过有丝分裂进行增殖，原核细胞则通过二分裂方式进行增殖。
06
细胞分化与发育
细胞分化的概念及类型
细胞分化的概念
细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程。
细胞分化的类型
包括稳定性分化和不稳定性分化。稳定性分化是指细胞在分化后，其形态、结构和功能长期保持相对稳定；不稳定性分化则是指细胞在分化后，其形态、结构和功能仍可发生可逆性变化。
干细胞与再生医学的应用
干细胞的类型与特性
包括胚胎干细胞和成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能的特性。
再生医学的概念及应用
再生医学是利用干细胞、生长因子等生物活性物质，促进机体损伤组织的再生与修复的新兴医学领域。其应用包括细胞治疗、组织工程和基因治疗等。
干细胞治疗的优势与挑战
干细胞治疗具有来源广泛、可塑性强、免疫原性低等优势，但也面临着安全性、有效性和伦理等方面的挑战。
细胞组分分离技术
超速离心、层析、电泳等。
细胞生物学研究技术
基因编辑、细胞成像、蛋白质组学等。
02
细胞膜与物质运输
细胞膜的结构与功能
细胞膜的基本结构
01
磷脂双分子层、膜蛋白等
细胞膜的功能

细胞生物学技术2011111

二甲苯：
最常用，易挥发，透明力强，能溶于醇及醚，但不能与水混合，是石蜡的溶剂。组织在二甲苯中透明的时间不宜过长，否则易于收缩、变硬、变脆。故一般在浸入二甲苯前，应先经二甲苯与酒精混合液，以减少组织的收缩。
（五）、组织浸蜡与包埋
1. 浸蜡：组织经脱水、透明后，即进入已溶化了的石蜡中，熔化的石蜡透过组织间隙，渗透到组织中，然后包埋成组织蜡块。
组织透明
组织块经脱水后，需进行石蜡包埋，然后切片，但酒精不能与石蜡混合，需经一种乙醇与石蜡之间的媒介物进行透明，即透明剂。
透明剂可取代组织中的乙醇使组织透明，组织透明后浸入石蜡中，石蜡可取代组织中的透明剂，浸入组织中。透明剂是石蜡的溶剂。透明剂的种类：最常用的有二甲苯、甲苯、苯、香柏油等。
生物素
酶
抗生物素
生物素标记一抗
标记抗生物素——生物素技术
酶标记抗生物素
生物素
酶
抗生物素
生物素 —— 抗体复合物
以抗生素为桥连接两个复合物
生物素 —— 酶复
合物
桥式抗生物素-生物素技术（BRAB）
重症妊娠中毒症子宫蜕膜IGF-1的表达
重症妊娠中毒症绒毛膜IGF-1的表达
1 正常组织阴性对照
特制的包埋框
纸盒的制作
选蜡原则包埋：以硬蜡为好。夏天用溶点高的蜡（60-62℃）
冬天用稍软的蜡即可（56-58℃）
石蜡包埋的操作过程：
⑴ 组织浸蜡至第三号
3
蜡中
⑵ 装好金属包埋框
⑶ 包埋蜡置电炉上
溶化，到温度应控
制在65℃左右。
标
签
⑷ 点燃酒精灯，准备
无齿尖镊子，写好标
签；