植物组培过程中培养物的玻璃化及其防治方法
组培常见问题
植物组培过程中污染产生的原因及防治措施一、污染的原因污染是指在培养过程中，培养基或培养材料上滋生真菌、细菌等微生物,使培养材料不能正常生长和发育的现象。
组织培养中污染是经常发生的，常见的污染病原是细菌和真菌两大类。
细菌污染常在接种1-2d后表现，培养基表面出现黏液状菌斑.真菌污染一般在接种后3d以后才表现，主要症状时培养基上出现绒毛状菌丝,然后形成不同颜色的孢子层。
造成污染的原因也很多，主要有（1) 培养基及各种使用器具灭菌不彻底（2）外植体消毒不彻底（3) 接种时不严格无菌操作（4) 接种和培养环境不清洁（5) 培养容器原因,包括盖子和封口膜等。
二、材料带菌或培养基灭菌不彻底会造成成批接种材料被细菌污染，操作人员不严格遵守无菌操作规程也是造成细菌污染的重要原因。
培养环境不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养容器的口径过大以及封口膜破损等主要引起真菌污染。
2 污染的预防措施2.1灭菌要彻底在组培生产中，各种培养基以及接种过程中使用的各种器具都要严格灭菌。
首先是培养基的灭菌，耐高温的培养基需要在121—123℃条件下灭菌20-30min。
若出现灭菌时间不足或温度不够，培养一段时间后就会在培养基表面产生细菌性的污染。
一些不耐高温的物质，可采取细菌过滤器除去其中的微生物。
其次，接种用的器具除了经过高温霉菌外，在接种的过程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧灭菌，特别是在不慎接触到污染物时，极易由于器具引起污染。
第三，对于被污染的培养瓶和器皿要单独浸泡，单独清洗，有条件的灭菌后再清洗。
2。
2环境消毒不清洁的环境也会使培养的污染率明显增加,尤其是在夏季,高温高湿条件下污染率更高。
接种和培养环境要保持清洁,定期进行熏蒸或喷雾消毒。
高锰酸钾和甲醛熏蒸效果好,但对人体有一定的伤害，一般每年熏蒸2-3次。
平时读接种室和培养室可采用紫外线照射消毒或喷2%来苏尔消毒。
臭氧消毒机对环境消毒效果较好,而且使用灵活方便,对人体的伤害也相对较小。
植物组织培养的三大难题及解决方法
植物组织培养的三大难题及解决方法摘要：植物组织培养是以细胞全能性为理论基础建立的一种离体培养技术，阐述了植物组织培养快繁中褐变、玻璃化、污染和移栽成活率低等问题出现的原因，提出预防和控制措施。
关键词：植物组织培养；污染；玻璃化；褐化中图分类号：q813.1+2 文献标识码：a 文章编号：1674-0432（2012）-11-0142-2植物组织培养是利用植物体的一部分进行无性繁殖，而产生大量同源母本基因幼苗的生物技术。
植物的组织培养到如今以和农业、园艺、林业、医药等多个方面有了密不可分的关系，为其提供了理论基础和研究方法。
利用自然条件在获得珍稀植物和经济价值较高的植物时，由于受地域及季节的限制，很难达到高效、快速的目的。
通过组织培养这一技术手段则能满足这一要求。
组织培养在挽救珍稀植物、创造新物种等方面做出了重要的贡献[1]。
但是在植物的组培技术上面临的三个难题却经常困扰大家。
它们分别是污染，植物玻璃化和植物褐化。
1 污染污染是在组培过程中所面临的首要难题，该问题经常遇到并且难以解决。
不能把污染率降低到可行的范围内植物组培就很难进行下去，这是该问题所要面对的第一个难题。
在进行植物的组织培养时，通常存在两种污染方式：一种是外植体消毒不彻底以及无菌操作过程中引起的污染；另一种是引起内源菌污染的主要原因的真菌和细菌[2]。
大多数的研究结果表明引起污染的主要原因为外植体的生长状况、环境条件和操作过程[3]。
外植体污染是最难解决的污染之一。
污染来源主要为外植体处理不当或培养基的灭菌不彻底，或对接种工具的消毒不够，或操作人员的操作不慎，或环境不洁等所致。
选取外植体的原则是污染少易启动[4-5]。
选择有最大分化潜能的外植体是确保组织培养成功的关键[6]。
常规试验一般选用0.1%hgcl2溶液浸泡，再用无菌水对外植体进行反复冲洗，灭菌效果最好且污染率低。
胡重怡等在烟草无菌苗培养前种子消毒技术的研究中使用先用70%c2h5oh溶液进行消毒，再用30%h2o2的浸泡，再用无菌水反复冲洗外植体，所得烟草种子污染率底[7]，h2o2分解后生成有杀菌作用的氧气而成为无毒害的化合物[8-9]对外植体的损害小。
植物组织培养的三大难题[1]
![植物组织培养的三大难题[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/7d69cb08763231126edb11a2.png)
第一作者简介:杨丽琴(19842),女,宁夏灵武人,硕士,主要从事植物学方面的研究。
E 2mail :ylq616@ 。
通讯作者:王俊。
E 2mail :w_jun @ 。
基金项目:国家科技攻关资助项目(2005BA901A18)。
收稿日期:2008-01-11植物组织培养的三大难题杨丽琴,李 瑞,王 俊,胡海英,吴晓玲(宁夏大学,宁夏银川750021) 摘 要:在植物组织培养过程中,常发生褐变、污染、玻璃化现象三大难题,严重影响了组织培养材料的正常发育,给组织培养带来了一定的困难。
结合近些年的研究,对三者发生的原因以及控制措施进行了综述,以期为科研和生产提供一定的理论依据和实践指导。
关键词:组织培养;褐变;污染;玻璃化中图分类号:Q 943.1 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2008)04-0104-04 植物组织培养技术是指在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体,在人工配制的培养基上培养成完整植株的过程[1]。
植物组织培养研究自Haberlandt (1902)的工作开始,至今已有100年的历史。
现在植物组织培养技术已在科研和生产中广泛应用,成为最引人注目的生物技术之一。
特别是近30年来,不少组织培养工厂应用该技术大量生产花卉、蔬菜及特种经济植物幼苗、脱毒苗,使作物种植逐步走向集中控制化、规模化、自动化、不受自然影响的工厂化生产[2]。
尽管组织培养方面理论研究已相当精深,但在试验和生产过程中常常会遇到褐变、菌类污染和玻璃化现象三大难题[3],严重者会导致试验和生产的失败,给科研和生产造成巨大的经济损失。
所以,植物组织培养操作过程中的经验积累和技术的掌握是很重要的。
现根据国内外的研究成果,对植物组织培养中的三大难题进行了分析,并提出了相应的解决方法。
1 褐变现象1.1 褐变概念及产生机理褐变是指外植体在诱导脱分化或再分化过程中,自身组织从表面向培养基释放褐色物质,以至培养基逐渐变成褐色,外植体也随之进一步变褐而死亡的现象[4]。
蓝莓组织培养中污染褐变玻璃化的防止措施
蓝莓为多年生小灌木树种,春季早花,夏季果熟,入秋叶呈红色,观赏效果极佳,可作为观光果园栽培树种,也可制作盆景;其果实中含有花青素、黄酮等多种多酚类生理活性成分,具有明目、防止脑神经衰老、抗癌、抗氧化等多种生理活性功能,越来越受到消费者的青睐,经济价值较高,市场潜力巨大,开发前景广阔。
蓝莓组培育苗技术的研究,采用蓝莓组培快繁技术,短期内获得大量的无病毒苗木。
探讨蓝莓苗木的工厂化技术育苗体系,有助于我国蓝莓产业化发展,满足社会需求[1-2]。
但在蓝莓组培过程中,很容易产生污染、褐变、玻璃化等现象,限制了蓝莓的组培快繁和大规模生产,是目前急需解决的关键问题。
笔者总结了蓝莓组织培养繁育中常出现的污染、褐变、玻璃化的防止措施,对蓝莓苗木的快速繁殖和推广具有重要意义。
1污染1.1操作人员注意卫生首先要注意工作人员卫生,工作人员进入无菌室不能吃东西、吸烟等,应常剪指甲。
工作服要每周清洗消毒1次,夏季要每3d 清洗消毒1次,工作服灭菌后在缓冲室更换;一次性用品要及时更换,口罩、帽子要经常清洗。
进入无菌室前要用肥皂洗手,进入培养室后再用75%酒精对双手进行消毒[3]。
1.2改善接种室环境条件接种室应保持密闭、洁净;培养室应控制空气相对湿度在70%左右,湿度太高时可用抽湿机除湿。
每次接种前均应清洁接种室的地面,并喷75%酒精沉降灰尘,然后打开紫外灯灭菌20~30min ,紫外灯灭菌结束后,用75%酒精擦洗工作台面。
每次接种结束时,应清洁接种室的地面,并定期清洗无菌操作台的过滤膜和用甲醛熏蒸接种室[4]。
1.3对培养基及接种工具彻底灭菌培养瓶在使用之前要彻底清洗,所用的培养基以及接种过程中使用的器具也要严格灭菌。
一是培养基灭菌。
培养基需要在121℃条件下灭菌20~30min ,一般灭菌后的培养基不能放置太久,1~2d 内用完最好,最长不能超过1周,以减少培养瓶污染。
二是接种器具灭菌。
将接菌器具用报纸、牛皮纸等包扎严密,进行高温高压灭菌。
植物试管苗玻璃化现象的发生及防治
植物试管苗玻璃化现象的发生及防治刘柏林甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州（730070 ）E-mail：liubl926@摘要：植物试管苗玻璃化现象在不同的植物器官、组织、细胞以及原生质体的组织培养中普遍存在。
玻璃化苗的形态解剖学特征、生理生化特点与正常的试管苗有显著不同。
微环境、基因型、内源激素、植株自身的生理状态等一系列因素影响玻璃化的发生。
本文通过研究玻璃化的发生机制，提出具体的防治措施。
关键词：试管苗；玻璃化现象；发生机制；防治措施1. 引言在植物组织的离体培养中，我们常发现有外观形态异常、呈半透明状的试管苗出现，我们把这种现象称为植物试管苗的玻璃化现象，其出现的概率可高达100%[1～3]在组织培养中丝2．玻璃化苗的形态解剖学特征2.1 形态学特征与正常苗相比,玻璃苗在形态学上发生了显著变化,其共同特点是:植株矮小肿胀,呈半透明状;茎短而粗,几乎无节间;叶片厚而狭长,皱缩或卷曲,脆弱易破碎;叶表无角质层,无功能性气孔器,叶仅有海绵组织,没有栅栏组织[7]。
Debergh 等[8]描述了洋蓟（Cynara scolymus）玻璃化苗的形成过程：叶片和小叶柄逐渐显示出多水，尤其是丛生叶中央的幼叶逐渐肿胀，然后肿胀的小叶突然明显地生长，长度约为正常叶片的5～6 倍；绿色叶片变成半透明,最终坏死。
2.2 解剖学特征茎皮层及髓部的薄壁组织过度生长，细胞间隙大，输导组织发育不良或畸形，导管和管胞木质化不完全。
叶片的栅栏组织细胞层数减少，或仅有海绵组织。
叶肉细胞间隙大，表皮组织发育不良，包括叶表角质层变薄或缺少角质层蜡质，有的是蜡质发育不完全，或蜡质结晶的结构发生变化。
果胶及纤维素等也发育不良。
在有些植物玻璃化苗的叶表发现有大量的排水孔。
气孔器数量或多或少，但功能不正常，其原因可能是保卫细胞中胼胝质含量增加，而纤维素含量减少。
叶绿体中基粒和基质的组织结构异常，叶绿素含量低。
根茎之间维管组织联系有缺陷[13]。
如何防止香蕉试管苗玻璃化
如何防止香蕉试管苗玻璃化试管苗是一种通过细胞培养技术，从单个细胞不断分裂，最终形成植株的种植方式。
相比于传统的种植方式，试管苗具有生长条件控制和生长节奏可控等一系列优势。
在现代农业生产中已经得到广泛的应用。
但是，试管苗也存在玻璃化现象，特别是香蕉试管苗更是容易出现这种问题。
本文将从比较直观的三个方面，谈谈如何防止香蕉试管苗玻璃化。
实验室环境的控制试管苗的光照、温度、湿度等环境条件都对其生长产生重要影响。
研究表明，香蕉试管苗在条件不适宜的情况下容易产生玻璃化现象，而这些环境条件也是试管苗最容易受到影响的方面。
因此，控制实验室环境条件变得极为重要，包括以下三个方面：光照光合作用是植物生长的基本过程，香蕉试管苗生长所需的光线一定要充足。
较强的光照会刺激细胞内压力的增加，从而促进纤维素合成，增强香蕉试管苗细胞壁的硬度，有利于预防玻璃化现象的发生。
合理的光照时间和光照强度可以避免香蕉试管苗过度生长，同时促进其生长发育。
对于香蕉试管苗来说，建议选择透光性好、光照均匀的培养箱。
同时，应根据不同发育周期的香蕉植株生长需求，调节光照时间和光照强度。
温度温度是影响香蕉试管苗生长的重要因素。
适宜的温度环境可以促进香蕉试管苗的正常发育。
香蕉试管苗生长最适宜的温度为22-30℃之间。
在不同的生长阶段，香蕉试管苗对温度的适应程度不同。
一开始的发芽阶段应该控制在20度以下的环境；在生根阶段，应该维护在适宜的温度下，加强保温措施；在生长发育期，应该控制在24-27度之间，并且避免高温和严重的温差。
湿度水分与植物生长密切相关。
对于香蕉试管苗来说，适宜的湿度可以帮助细胞内矿物质的吸收，维持细胞内及细胞间的稳定水分状态。
湿度对于香蕉试管苗的生长十分敏感，特别是对于人工培养的香蕉试管苗，需要额外注意。
通常，香蕉试管苗的最佳湿度约为80%。
在不同生长周期中，湿度的要求也不同。
在生根初期，香蕉试管苗需要高湿度环境，为细胞分裂及根的生长发育提供所需的环境；在生长发育期，适宜的湿度为70%-80%左右。
第四讲 组培中常见的问题与对策
无机盐浓度过高可引起酚类物质外溢，Mn和Cu是参与
酚类合成和氧化的重要因子，降低盐离子浓度可减少酚 类外溢；
6-BA/KT不仅能促进酚类合成，还刺激多酚氧化酶的活 性，降低这两种激素浓度可减轻褐化；
加入吸附剂（活性碳）和抗氧化物质（PVP、VC）
3）外植体受伤害程度
机械伤害 减少切口伤面，缩短切口在空气中的暴露时间；
催化下迅速氧化成褐色的琨类化合物，导致整个组 织代谢紊乱，死亡。
1、褐变产生的影响因素
影响植物组织培养褐变的因素很复杂，随植物的种 类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同，褐 变的程度也有所不同；
培养基种类，继代次数，外植体放置方式，光照及
培养基中的添加物等，均对褐化有影响
1）外植体的选择
1）接种前培养基出现大量污染 菌落只存在于培养基表面：可能是密封不好或放置 培养基的空气中孢子过多； 菌落存在于培养基内：贮存母液污染，器具不洁净 或灭菌不彻底。
2）接种后真菌大面积污染，菌落位置不定 可能是接种室的孢子过多或超净台的滤网不洁； 经常清洗或更换滤网，用甲醛熏蒸接种室； （将50ml甲醛倒入10g高锰酸钾中，使甲醛蒸汽散 发出来，密闭门窗24小时）
逐渐变成褐色，外植体组织也随之进一步变褐、死
亡，这一现象称为褐变（Browning）。
褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、 悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常 发生。
褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少
和PPO活性有直接关系。在完整组织中两者是分开
的，当切割受到伤害时，酚类化合物外溢，在酶的
化学伤害 各种消毒剂引起的伤害，选择合适的消毒剂和消毒 时间
植物组织培养 第4章 植物组织培养中常见问题及解决办法
3、发生方式 ：以茎尖、茎段等发生不定芽的方式繁 殖不易发生变异或变异率极低。甘肃农业大学通过节 培法繁殖名贵葡萄品种，经5年—8年继代培养，其变 异频率与常规方法相同，在数成株中仅发现一株变异 此外用菊花茎尖、腋芽培养，变异较低，而从花瓣诱 导的变异较高。由花椰菜根诱导的不定芽和再生植株 中有不少变异，而从顶端分生组织（花菜）产生的 4000个再生植株基本没有变异。通过愈伤组织和悬浮 培养分化不定芽的方式获得再生植株变异率较高。通 过分化胚状途径再生植株变异较少，通过茎尖或分生 组织培养增殖侧芽可以保持基因型基本不变。在高浓 度的激素作用下，细胞分裂和生长加快，不正常分裂 频率增高，再生植株变异也增多。
玻璃化
具体解决的方法为：
1、培养基成分：增加培养基中的溶质水平，
以降低培养基的水势；减少培养基中含氮化合 物的用量； 2、培养条件：增加光照；增加容器通风，最 好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现 象有明显的作用；降低培养温度，进行变温培 养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生 3、生长调节剂：降低培养基中细胞分裂素 含量，可以考虑加入适量脱落酸。 -
在正常发育的植物组织中,底物、氧气、多酚
氧化酶(PPO)同时存在并不发生褐变，是因为在正
常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡
内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区
域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结 构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的 条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进 行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质， 从而引起褐变。
消毒：花雷或幼穗的表面消毒用70%酒精
－－－次氯酸钠10－20分钟或0.1%升汞7 －10分钟。操作熟练仅用70%酒精表面消 毒后即取花药接种
植物组织培养中的常见问题及对策
20221020世纪30年代以来，随着现代科学技术的快速发展，植物组织培养技术得到了广泛的发展和应用。
目前，利用植物组织培养技术能使离开本体的植物体重新分化芽苗，得到新的小植株，具有快速繁殖能力的植物品种已经多达千种以上。
但是，无论初代还是继代的植物培养都存在易受污染物影响、易黄化和褐化导致枯死的现象，植物组织培养中还存在着不确定的变异率。
这些问题严重影响外植体的进一步脱离分化和再分化，成为植物组织培养的拦路虎，绝对不可小觑。
通过分析以上植物组织培养中的问题，研究其解决对策并加以执行，对提升植物组织培养成功率具有积极作用，也是当下值得深入探索的重要问题。
1植物组织培养过程中的污染问题及对策1.1植物组织培养过程中污染问题的危害及其成因污染问题一直是植物组织培养过程中的重大问题。
植物组织培养过程中有适宜快速繁殖的条件，微生物也能在其中快速繁殖，给试验材料产生不同程度的霉变、浑浊、云雾状、粘液状、泡沫状等形状、颜色和大小不同的污染痕迹。
污染问题带来的直接影响是阻碍植物组织培养材料的良好保存和新产品植株的培育。
同时，污染问题背后造成大量间接影响，带来大量的培养材料和前期工作时间的浪费，影响植物组织培养进度，被迫提高科研成本，阻碍科研和生存项目的发展。
植物组织培养过程中的污染原因大致包括：植物本身的种类和大小、预处理方法、灭菌消毒方式、人员操作和环境因素四大类。
1.2植物组织培养过程中污染问题的对策1.2.1选择外植体的种类和大小不同，污染风险等级也不尽相同。
在自然环境中难以避免植物本身携带各种真菌、细菌和相关的病虫害。
在适宜生长的野生状态下，细菌和病虫害都会影响植物的正常生长，在植物组织培养过程中，其威力更大。
植物组织培养过程中，应选取细菌较少或不带细菌的材料作为外植体。
避免选择长期生长在存在大量微生物环境中有块茎、鳞茎等器官的外植体。
外植体材料表面积越大，各类菌体含量越高，污染几率直线上升。
因此，应选择外植体材料表面积较小的植株，降低菌体污染的可能性。
植物组培技术常见问题及其预防措施
植物组培技术常见问题及其预防措施摘要主要对植物组培技术中常见问题如污染、材料褐变和玻璃化现象等方面进行阐述，并在此基础上提出相应对策。
关键词植物组织培养技术；常见问题；预防措施中图分类号：S722 文献标志码：B 文章编号：1673-890X （2015）36-0-02植物组织培养技术作为当代生物科学中最有生命力的一门学科，应用广泛，在农业、林业、工业和医药业等行业均有涉及，且产生了巨大的经济和社会效益，但由于组培育苗操作程序复杂，各种技术难题仍受到广大科研工作者的困扰，如污染、材料褐变、瓶苗玻璃化等常见问题屡见不鲜，试验组培成功的植物多样，但利用组培规模化生产的植物并不多见，下面对该技术中常见的三大问题（污染、材料褐变和玻璃化现象）及预防措施进行阐述[1-4]。
1 污染问题1.1 污染原因污染是指在培养过程中，培养基或培养材料上滋生真菌、细菌等微生物，使培养材料不能正常生长和发育的现象。
在实验室及规模化生产中，组织培养中污染时有发生，造成污染的原因主要有以下几点：培养基以及在培养过程中的各种器具灭菌不彻底；培养时外植体消毒不彻底；接种和培养环境不清洁；接种人员无菌操作不严格；培养容器原因，包括盖子和封口膜等。
此外，材料灭菌不彻底同样也会造成成批接种材料被细菌污染，而且培养过程不严格遵守无菌操作规程也是造成细菌污染的重要原因。
培养环境不清洁、超净工作台的过滤装置失效、培养容器的口径过大以及封口膜破损等主要引起真菌污染[5-9]。
1.2 污染的预防措施1.2.1 灭菌彻底严格各个环节的操作流程，特别是培养基及操作过程中的各种器具必须要严格灭菌。
培养基灭菌有以下要求：耐高温培养基在121～123 ℃条件下灭菌20～30 min。
其次，接种用的器具除了经过高温霉菌外，在接种的过程中，每使用1次后，都要蘸酒精在酒精灯火焰上灼烧灭菌，特别是在不慎接触到污染物时，极易由于器具引起污染。
最后，对于被污染的培养瓶和器皿要单独浸泡，单独清洗，有条件的灭菌后再清洗[10-14]。
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植物组培过程中培养物的玻璃化及其防治方法
当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，苗体趋于透明，其茎、叶表面无蜡质，这种现象通常称为玻璃化。
玻璃化为组培苗的生理失调症，它的出现会使组培苗生长
缓慢、繁殖系数有所下降，玻璃化的嫩茎不宜诱导生根。
1 导致玻璃化的主要因素：
①材料差异，在不同的种类、品种间，组培苗的玻璃化程度有所差异。
②激素水平过高,若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高，易引起玻璃化现象。
③培养基水势，培养基中离子种类,比例不适。
④
环境温度、光照强度和通气性。
温度过低或过高,光照时间强度不足及培养容器中空气湿度过高，透气性较差所造成的通气不良,易造成组培苗含水量高,从而发生玻璃化现象。
⑤琼脂浓度降低、有杂质等。
2 常用的防治措施有
①增加光照强度和光照时数。
②降低细胞分裂素含量。
在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落
酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生
③增大培养基中琼脂的含量，以降低培养基的水势
④降低NH4+浓度，减少培养基中含氮化合物的用量
⑤增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻组培苗玻璃化的现象有明显的作用；
降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻组培苗玻璃化的现象发生；。