乳酸杆菌
乳酸杆菌结构
乳酸杆菌结构介绍乳酸杆菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一类广泛存在于自然界中的革兰氏阳性杆菌。
它们的特点是能够通过发酵代谢产生乳酸，同时还能够抑制其他微生物的生长。
由于其在食品工业和保健领域的重要作用，乳酸杆菌的结构和功能备受科研人员的关注。
乳酸杆菌的形态特征乳酸杆菌的形态特征主要包括菌体形态和菌落形态两个方面。
菌体形态乳酸杆菌的菌体通常为直杆状或短杆状，长度在1-5微米之间。
菌体的直径通常在0.5-1微米之间。
乳酸杆菌的菌体通常不具有鞭毛和纤毛，因此在显微镜下观察时，它们呈非运动状态。
菌落形态乳酸杆菌的菌落形态通常呈灰白色或乳白色，并且通常呈不透明的光滑表面。
乳酸杆菌的菌落通常呈圆形或洋葱球形，直径通常在0.5-2毫米之间。
乳酸杆菌的细胞结构乳酸杆菌的细胞结构主要包括细胞壁、细胞膜、细胞质和核酸四个部分。
下面将对每个部分进行详细介绍。
细胞壁乳酸杆菌的细胞壁是由肽聚糖和由蛋白质构成的多糖复合物组成的。
它起到了支持和保护细胞的作用。
乳酸杆菌的细胞壁通常具有较高的抗原性，这使得乳酸杆菌在人体内表现出很强的免疫刺激作用。
乳酸杆菌的细胞膜位于细胞壁的内部。
它由磷脂和蛋白质构成。
细胞膜具有渗透性，能够控制物质的进出。
乳酸杆菌的细胞膜还参与了能量的合成和储存。
细胞质乳酸杆菌的细胞质是细胞内的液体基质。
细胞质中含有细胞器、营养物质和其他重要的细胞成分。
乳酸杆菌的细胞质中还含有一种叫做乳酸菌素的物质，它具有抗菌和免疫调节等生物活性。
核酸乳酸杆菌的核酸包括DNA和RNA。
DNA存在于细胞质中的核区域，是细胞的遗传物质。
RNA则通过转录过程，将DNA中的遗传信息转化为蛋白质。
乳酸杆菌的代谢途径乳酸杆菌的代谢途径主要包括乳酸发酵和异乳酸发酵两种。
乳酸发酵乳酸发酵是乳酸杆菌主要的代谢途径。
在这种代谢途径中，乳酸杆菌通过将葡萄糖等碳源转化为乳酸，同时产生能量。
乳酸发酵对乳酸杆菌来说是一种重要的能量产生方式。
乳酸杆菌分级
乳酸杆菌分级摘要：一、乳酸杆菌简介1.乳酸杆菌的定义2.乳酸杆菌的分类3.乳酸杆菌的特点二、乳酸杆菌的分级1.按照菌株编号分类2.按照功能特性分类3.按照应用领域分类三、乳酸杆菌的应用1.食品工业中的应用2.医疗保健中的应用3.环保产业中的应用四、乳酸杆菌的发展趋势1.菌株选育与改良2.技术创新与产品研发3.乳酸杆菌在新领域的应用正文：乳酸杆菌分级：乳酸杆菌（Lactic Acid Bacteria，LAB）是一类能将糖发酵产生乳酸的细菌，广泛应用于食品、医疗和环保等领域。
为了更好地了解和利用乳酸杆菌，我们需要对它们进行分级。
一、乳酸杆菌简介乳酸杆菌是一类革兰氏阳性杆菌，无芽孢，多数呈杆状，少数呈球状。
乳酸杆菌广泛分布在自然界，尤其在动植物体内和人类肠道中含量丰富。
乳酸杆菌具有耐酸、耐碱、耐高温等特性，对人体有益且无害。
二、乳酸杆菌的分级1.按照菌株编号分类：乳酸杆菌根据菌株编号可以分为很多种，如Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus casei等。
2.按照功能特性分类：根据乳酸杆菌的功能特性，可以将其分为产酸、产气、产黏液等不同类型。
3.按照应用领域分类：乳酸杆菌根据其在食品、医疗和环保等领域的应用，可以分为不同级别，如食品级、医疗级和环保级等。
三、乳酸杆菌的应用1.食品工业中的应用：乳酸杆菌在食品工业中具有广泛应用，如制作酸奶、豆腐乳、泡菜等发酵食品。
乳酸杆菌不仅可以改善食品口感，还能增加营养价值和保健功能。
2.医疗保健中的应用：乳酸杆菌在医疗保健领域也有广泛应用，如生产乳酸杆菌制剂，用于调节肠道菌群、预防肠道疾病等。
3.环保产业中的应用：乳酸杆菌在环保产业中的应用逐渐受到重视，如降解有机污染物、净化水质等。
四、乳酸杆菌的发展趋势1.菌株选育与改良：随着科学技术的进步，乳酸杆菌的菌株选育与改良工作将得到加强，以满足不同领域的应用需求。
2.技术创新与产品研发：乳酸杆菌在食品、医疗和环保等领域的新技术和新产品将不断涌现，推动相关产业发展。
乳酸菌的应用及原理
乳酸菌的应用及原理乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，其主要特点是产酸能力强。
乳酸菌广泛应用于食品加工、医药健康、环境修复等领域。
下面将着重介绍乳酸菌的应用及其原理。
1.酸奶的制作乳酸菌可将乳糖发酵为乳酸，酸度由原来的6.5pH下降到4.0pH以下，从而使得牛奶变酸。
乳酸菌中的一些菌种，如嗜酸乳杆菌和乳酸杆菌，还能产生丰富的芳香物质和多种风味物质，为酸奶赋予独特的风味。
2.醋的制作乳酸杆菌通过发酵过程中产生的乳酸，在适宜的条件下进一步被其他微生物（醋酸杆菌）氧化，生成醋酸，从而制成醋。
醋酸具有抗菌作用和促进消化的功能，因此酸奶对身体健康有益。
3.面包的酸化处理乳酸菌能够将粮食中的淀粉和糖分解为各种有机酸，进而改变面粉的pH值和味道，从而提高面包的口感和保鲜性。
酸化处理还可以抑制面筋的形成，使得面包口感更为松软。
4.腌制食品的制作乳酸菌通过产生乳酸，改变食品的酸碱度，从而实现腌制食品的保鲜和增加风味。
如酸菜、泡菜等就是利用乳酸菌的发酵作用制成的。
1.维护肠道健康乳酸菌在人体肠道中生活，并与肠道细菌形成竞争关系，抑制有害细菌的生长，维护肠道菌群的平衡。
乳酸菌还能通过产酸、产生抗菌物质、增强免疫力等多种途径，促进肠道蠕动，增强肠道屏障功能，防止肠道感染和炎症发生。
2.增强免疫力乳酸菌能够激活人体的免疫系统，促进免疫细胞的生成和活性，增强机体的抵抗力。
此外，乳酸菌还能够抑制病原微生物的生长，减少感染的风险。
3.改善消化功能乳酸菌在肠道内生长发酵过程中产生大量的有机酸和多种酶类，可以帮助人体分解食物中的蛋白质、脂肪和碳水化合物，促进食物的消化和利用，改善胃肠道功能，减少胃肠道疾病的发生。
1.污水处理乳酸菌具有分解有机物质和吸附重金属的能力，可以有效地减少污水中有机物和重金属的含量，促进高效生物处理。
2.土壤修复乳酸菌通过发酵代谢过程中产生的有机酸，可以调节土壤的pH值，提供适宜的环境条件，促进其他有益微生物的生长，并分解土壤中的有机物，修复受污染土壤。
乳酸杆菌表达系统的研究进展
乳酸杆菌表达系统的研究进展丁轲程安春(四川农业大学动物科技学院四川雅安625014)乳酸杆菌是一种常见的益生菌，它的应用已有几百年的历史，是一种公认的具有GRAS(Generally Regarded As Safe)有益微生物。
该菌广泛存在于人、动物和植物中，可以产生多种物质，如短链脂肪酸、过氧化氢、细菌素、蛋白质和各种酶类等。
尤其重要的是它是人和动物肠道中最重要的优势菌群之一，对于机体的代谢、免疫调节等方面起着极其重要的作用。
但随着基因工程技术的发展日趋完善，人们已不再满足于乳酸杆菌自身固有的功能，特别是当前由于疫苗免疫和菌(毒)株的残留毒力之间的矛盾，促使人们寻求能良好表达外源抗原且安全的疫苗载体候选菌株，乳酸杆菌便自然成为最佳选择菌株之一，因此近年来在疫苗载体的研究中日益受到重视，但其研究却远远落后于病原微生物。
现就这一方面作一综述。
1 乳酸杆菌表达载体的优点乳酸杆菌作为表达载体有许多独特的优势，这主要是因为乳酸杆菌是人和动物体内最优势的益生菌株之一，许多研究都表明它的有无和多寡都对机体有着至关重要的影响，以它为表达系统有其它菌株不可比拟的优点，主要表现在以下方面：①乳酸杆菌是至今发现的唯一没有致病性的一个种；②它在人和动物体内占绝对优势，以它为表达系统，较其它菌株更易达到较高的表达量；③若选择非抗性标记，则该表达系统中的菌体、选择性标记、诱导物均为食品级，为生产绿色安全的食品提供了可能；④乳酸杆菌菌体本身就对机体有益生作用，其分泌多种物质更是机体必不可少的，若再在其载体上克隆入外源基因，这样就可集菌体、自泌物质和外源蛋白于一体；⑤乳酸杆菌对机体粘膜有极强的粘附作用，因此构建的乳酸杆菌基因工程菌就可在粘膜处不断繁殖，持续向机体释放目的蛋白；⑥乳酸杆菌可直接口服，能够耐受胃液中的强酸和小肠上段的胆盐，这样就免去了目的蛋白的体外提纯等后加工。
2 乳酸杆菌质粒1976年Chassy[1]首先发现乳酸杆菌中存在质粒，质粒在不同的乳酸杆菌中分布不均，Vescovo等[2]对159株乳酸杆菌进行质粒抽提，发现L. reuteri、L. helveticus 和L. acidophilus 含质粒的比率较高，分别为63%、27%和20%，L. casei仅有4%的菌株含有质粒，L.plantarum、L. brevis 和L. coryniformis没有发现质粒。
矿产
矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。
乳酸杆菌在细菌性阴道炎中的影响
乳酸杆菌在细菌性阴道炎中的影响乳酸杆菌是阴道微生态系统中的有益菌群，它能有效地抑制阴道致病菌的生长，对多种阴道炎均有显著疗效，本文旨在探讨乳酸杆菌在细菌性阴道炎中的影响。
标签：乳酸杆菌；阴道炎；菌群平衡细菌性阴道炎是妇科常见病，常规治疗应用抗生素，它虽然能抑制致病菌生长，但同时它也打乱了阴道内菌群平衡状态，从而出现耐药性，易复发，二重感染等问题，乳酸杆菌制剂在促进阴道乳酸菌定植繁殖的同时能抑制阴道致病菌的生长，从而恢复阴道菌群平衡，所以是一种安全，有效，复发率低的治疗阴道炎的药物。
细菌性阴道炎主要是由于宿主受到分娩，手术，性生活等的损伤或卵巢功能低下，大量使用抗生素，抗肿瘤药物，免疫抑制剂的应用，或全身其他疾病的影响，破坏了阴道微生物防线和解剖的屏障结构，导致阴道内微生态平衡破坏，从而出现细菌性阴道炎。
主要病原菌：大肠埃希氏菌，类杆菌，消化球菌，链球菌，沙门氏菌葡萄球菌，念珠菌，滴虫，衣原体，支原体等，表现为细菌性阴道炎BV，念珠菌性阴道炎，滴虫性阴道炎及老年性阴道炎等。
目前临床上常用甲硝唑治疗细菌性阴道炎，滴虫性阴道炎。
用咪康唑酮康唑等抗真菌的药物治疗念珠菌性阴道炎。
对于老年性阴道炎的治疗除了局部或全身抗感染外，还适当补充少量雌激素以促进阴道粘膜上皮增生，用抗生素治疗阴道炎疗效肯定，但由于抗生素在抑制致病菌的同时破坏了阴道正常菌群，容易引起二重感染并产生耐药性，对反复发作的阴道炎的治疗效果较差，而且长期大量应用容易引起头疼，恶心，味觉异常，肝脏损害等副反应，特别是妊娠期，许多的抗真菌药物不排除致畸的可能性，多不被妊娠患者所接受，急需找到一种更安全有效，复发率低的替代药物。
而使用乳酸杆菌制剂安全有效。
乳酸杆菌是阴道微生态系统中的优势菌群，目前的研究表明乳酸菌在阴道内的分离率最高，在健康妇女的阴道的分离率达50%～80%，其数量占阴道微生物的95%以上，对于维持阴道微生态平衡具有重要的作用。
对健康妇女和BV患者阴道内产生过氧化氢的乳酸杆菌检出率的比较研究显示，92%的健康妇女阴道内都能检出产过氧化氢的乳酸杆菌，明显高于BV患者的检出率4.1%，说明BV 的发生与过氧化氢的降低密切相关，乳酸菌可以粘附于阴道上皮细胞，维持阴道上皮细胞的定植能力，从而阻止病原微生物的入侵；可以分解阴道粘膜上皮细胞内的糖原，产生一定量的乳酸，使阴道保持酸性环境，有利于阴道的自净作用；还可以产生细菌素，溶菌酶等物质抑制致病菌的生长；所产生的过氧化氢可抑制或殺灭其他细菌；产生的表面活性剂，可阻止大肠杆菌的粘附。
乳酸菌的发酵过程
乳酸菌的发酵过程乳酸菌发酵过程是一种微生物发酵技术，利用乳酸菌（主要是乳酸杆菌和乳酸菌）将葡萄糖或其他碳水化合物转化为乳酸。
这是一种广泛应用于食品和饮料工业中的发酵过程，用于制造酸奶、酸乳酪等乳制品，同时也是食品和饮料工业中的一种重要发酵技术。
1. 选择合适的乳酸菌菌种：乳酸菌菌种的选择是发酵过程的关键。
常用的乳酸菌菌种有乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）、乳酸菌（Lactococcus lactis）等。
这些菌种通常是通过纯培养的方法从自然界中分离出来或由商业培养基提供。
2.培养乳酸菌：在培养基中培养乳酸菌。
培养基的选择通常要考虑到乳酸菌的生长和代谢需求，通常包括碳源、氮源、矿物质和维生素等。
培养条件通常包括pH、温度、氧气含量和培养时间等方面。
3.糖的代谢：乳酸菌通过糖的代谢产生乳酸和气体。
乳酸菌先将葡萄糖或其他碳水化合物分解成丙酮酸，再将丙酮酸转化为乳酸。
乳酸的生成是通过乳酸脱氢酶催化丙酮酸脱羧反应完成的。
此外，乳酸菌还会产生少量的乳酸外的其他有机酸，如乙酸和乳酸。
4.pH的变化：乳酸的产生会导致发酵培养基的pH值下降。
这个过程被称为酸化。
乳酸菌会产生足够的乳酸来降低环境的pH，从而创造出适合其自身生长的环境。
pH的变化也会影响其他微生物的生长。
5.其他代谢产物的生成：除了乳酸外，乳酸菌在发酵过程中还会产生其他代谢产物。
这些产物包括乳酸菌培养基的风味物质和气体。
乳酸杆菌发酵出来的风味物质有助于提升产品的风味。
6.结果分离和处理：当乳酸发酵完成后，乳酸菌会被通过离心等方式分离出来。
通常会有一些控制发酵的因素，如发酵时间、发酵温度和培养基的成分等。
总结起来，乳酸菌的发酵过程是一种利用乳酸菌将碳水化合物转化为乳酸的发酵技术。
这个过程包括乳酸菌菌种选择、培养乳酸菌、糖的代谢、pH的变化、其他代谢产物的生成以及结果分离和处理。
这种过程广泛应用于食品和饮料工业中，用于制造酸奶、酸乳酪等乳制品，同时也有助于提高产品的风味。
酸菜食品发酵中防腐乳杆菌的检测与筛选
酸菜食品发酵中防腐乳杆菌的检测与筛选酸菜是一种以青菜为原料，经过盐腌、发酵而成的食品，具有浓郁的口感和酸爽的味道，深受人们喜爱。
而在酸菜的发酵过程中，乳酸菌是一种非常重要的菌种，它不仅有利于酸菜的发酵和保存，还对人体健康有益，因此在酸菜食品发酵中防腐乳杆菌的检测与筛选成为了一个重要的研究课题。
一、乳酸菌对酸菜的重要性乳酸菌是一类革兰氏阳性菌，主要包括嗜酸乳杆菌、乳酸杆菌等多种，它们具有优良的发酵能力，能够将蔬菜中的糖类发酵成乳酸，从而降低pH值，产生特有的酸味。
在酸菜的发酵过程中，乳酸菌不仅能够提高食品的风味和营养，还能够抑制有害菌的生长，达到保鲜和防腐的作用，因此它是酸菜发酵中不可或缺的菌种。
二、乳酸菌的检测方法乳酸菌的检测方法主要包括传统的培养法和分子生物学方法两种。
1.培养法培养法是最为常见和传统的乳酸菌检测方法。
首先是样品的处理，将酸菜样品加入生理盐水中进行搅拌，再进行一定的稀释，将样品接种在适宜的培养基上，通过一定的温度和时间进行培养。
最后通过肉眼观察和显微镜检查菌落的数量和形态特征，来判断样品中乳酸菌的含量和种类。
2.分子生物学方法分子生物学方法是近年来发展起来的一种新型检测方法，其主要包括PCR技术、实时荧光定量PCR技术和基因测序技术。
这些方法通过检测样品中特定的乳酸菌基因序列，来确定其种类和含量，具有准确、灵敏、高通量等优点。
三、乳酸菌的筛选方法酸菜的发酵中选择适宜的乳酸菌菌种至关重要，而乳酸菌的筛选主要包括筛选菌株、筛选菌种、筛选发酵工艺三个方面。
1.筛选菌株筛选菌株是乳酸菌筛选的第一步，通常可以通过对多种来源的酸菜样品进行采样和分离，然后在适宜的培养条件下进行发酵，并观察其酸度、口感、保存性等指标，最终选出具有较好特性的菌株。
2.筛选菌种在确定了优良的菌株后，还需要通过分子生物学手段对其进行鉴定和分类，进而确定其属于哪种菌种，这有助于更好地掌握和利用其生物特性。
3.筛选发酵工艺在确定了优秀的乳酸菌菌种后，还需要对其进行发酵工艺的优化和选择，包括发酵温度、发酵时间、发酵pH值等因素，以期使其发挥出最佳的发酵效果。
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与hCG序列比较：
agacaaggcaggggacgcaccaaggatggagatgttccaggggctgctgctgttgctgct 237 agacaaggcaggggacgcaccaaggatggagatgttccaggggctgctgctgttgctgct 60 gctgagcatgggcgggacatgggcatccaaggagccgcttcggccacggtgccgccccat 297 gctgagcatgggcgggacatgggcatccaaggagccgcttcggccacggtgccgccccat 120 caatgccaccctggctgtggagaaggagggctgccccgtgtgcatcaccgtcaacaccac 357 caatgccaccctggctgtggagaaggagggctgccccgtgtgcatcaccgtcaacaccac 180 catctgtgccggctactgccccaccatgacccgcgtgctgcagggggtcctgccggccct 417 catctgtgccggctactgccccaccatgacccgcgtgctgcagggggtcctgccggccct 240 gcctcaggtggtgtgcaactaccgcgatgtgcgcttcgagtccatccggctccctggctg 477 gcctcaggtggtgtgcaactaccgcgatgtgcgcttcgagtccatccggctccctggctg 300 cccgcgcggcgtgaaccccgtgggtctcctacgccgttggctcttagctgtcaatgtgca 537 cccgcgcggcgtgaaccccgt-ggtctcctacgccg-tggctctcagctgtcaatgtgca 358
EcoRI KpnI
Lb DNA pUC18 PCR
BamHI XbaI HindIII
EcoRI/KpnI双酶切
EcoRI KpnI
670bpS-层蛋白表达信号
连接
EcoRI
pUC18A
S-层蛋白表达信号
KpnI
S-层蛋白表达信号序列测序及blast 结果
agctgaagcagtcgttgaaacggcagcaacaccagcaaagctcaatgcggcaaggcccaa agctgaagcagtcgttgaaacggcagcaacaccagcaaagctcaatgcggcaaggcccaa gtaaagagatttctttaaacttgattgcataatttttcttcctccaaacataaaatatgc gtaaagagatttctttaaacttgattgcataatctttcttcctccaaacataaaatatgt aatttatcaagcaagaatagtataaccgaagttagcgcttttgttaagaaatttattcga aatttatcaagcaagaatagtataaccgaagttagcgcttttgttaagaattttatttca taacatcagcggacccgatcagctatcccctaactacgaagataagtatagcgatttcct taacattagcggacccgatcagctatcccctaactacgaagataagtatagcgatttcct taaggagatacaaggattacgccctgattgtcgttggattgaaacaattatgggtatcct taaggagatacaaggattacgctctgattgtcgttggattgaaacaattatgggtgtcct gtaatgttattgttacataactaaaagtctactaacctgcttaaagcctttgtaa gtaatgttattgttacataactaaaacgtcactaacctgcttaaagcctttgtaa
技术路线:
PCR扩增670bp片段并测序 与hCG基因连接
构建质粒pIlac-hCG 电穿孔转化乳酸杆菌
PCR扩增信号肽+ hCG 将信号肽+ hCG克隆入pIlac, 得到 pIlac hCG
获得重组hCG 乳酸杆菌稳定表达株
pIlac-hCG 的构建:
扩增670bp的S-层蛋白表达信号
共同粘膜免疫机制
MALT 血液 抗原
M cell
归巢
Dome
T cell zone CD4+ T-naï ve CD4+ T activated CD4+ T memory B cell zone
lympoepithelium
粘膜效应部位： 胃肠道 上呼吸道 泌尿生殖道 腺体
Surface IgA+ B Activated B Resting B
pIlac质粒在不同电压下的转化效率
pIlac hCGβ和pIlac 的转化效率比较：
250000 200000
CFU/ugDNA
150000 100000 50000 0
1200v 200000 1500v 100000
pIlac pIlac hCG¦ Â
V
乳酸杆菌基因组hCGβ整合基因鉴定
2000 750 500 250 100
mIU/ml
É å Ï Ç Ö Ð Ä µ hCG¦ Â · ° Ï û Ñ Á ½ â ¹ Ò Ö Ð µ Ä hCG¦ Â
重组hCG乳酸杆菌培养上清免疫印渍分析
97KDa 66 KDa 45 KDa 30 KDa 20.1 KDa 14.4 KDa
红霉素耐药基因的重组缺失及建立稳定表达株
在无红霉素的MRS传50代后
pIlac 4895bp
Ap
ori
基因组DNA
目的基因
基因组DNA
目的基因 目的基因
pIlac
Ery
Ery pIlac
基因组DNA
目的基因
研究目的：
构建乳酸杆菌hCG 稳定表达株
乳酸杆菌在小鼠阴道内表达hCG抗原
经阴道免疫小鼠，以在生殖道局部刺激产生抗hCG抗体
第一部分
hCGβ抗原在乳酸杆菌的分泌性表达
NdeI
SmaI
EcoRI
TAAAAAGGAGGCTGCAGCATATGCCCGGGGAATTCAATCGGAGGGAATG
LacF LacG
Em
优点：
可在大肠杆菌中高拷贝 的扩增，便于基因克隆； 获得大量纯化质粒，使 得转化方便 介导外源基因整合入宿 主菌的基因组中，稳定 表达；红霉素耐药基因 可自发缺失，安全
重组hCGβ乳酸杆菌对小鼠阴道粘 膜免疫的效果
李大金
复旦大学妇产科研究所
研究现状:
避孕疫苗：安全、方便、不影响生殖内分泌 精子抗原、 hCG 、卵透明带、FSH Talwar, hCGβ-HSD疫苗 有效：50ng/ml hCG结合力 可逆： 35ng/ml, 内源性hCG无免疫原性 有效率：80-85% 原因：载体；免疫途径 系统免疫(1/10)、粘膜免疫
CD8+ CTLs
活疫苗载体在粘膜部位持续表达抗原
细菌/ 病毒减毒株：减毒沙门氏菌、Bordetella pertussis，呼吸道合孢病毒等
细菌/ 病毒减毒株有潜在致病能力
乳酸杆菌是人体正常菌群，具有GRAS(generally regarded as safe)特性
乳酸杆菌表达抗原经粘膜免疫
pH
葡萄糖对乳酸杆菌hCGβ表达的影响
300 250 200
0.75%Æ Ï Ì Ñ Ì Ç £ ¬ 0.5%È é Ì Ç 0.5%Æ Ï Ì Ñ Ì Ç £ ¬ 0.5%È é Ì Ç 0.25%Æ Ï Ì Ñ Ì Ç £ ¬ 0.5%È é Ì Ç 0%Æ Ï Ì Ñ Ì Ç £ ¬ 0.5% é Ì È Ç
P
SD
pIlac
PstI NdeI SmaI EcoRI
NdeI 信号肽 hCGβ EcoRI
NdeI/EcoRI ligate
P
NdeI 信号肽 + hCGβ EcoRI
pIlac hCGβ
pIlac hCGβ的构建
1.00E+06 1.00E+05
CFU/ugDNA
1.00E+04 1.00E+03 1.00E+02 1.00E+01 1.00E+00 600 900 1200 1500 Voltage 1800 2100 2400
mIU/ml
pH值对乳酸杆菌hCGβ表达的影响
400 350 300
mIU/ml
250 200 150 100 50 0 0 9 16 小时 23 32
pH7，乳糖0.5% pH6，乳糖0.5% pH5，乳糖0.5% pH4，乳糖0.5%
小结1：
Lactobacillus casei CECT5267稳定、分泌、高效 表达了hCGβ蛋白： 在无选择压力下培养50代并经2次冻存、复苏后， 上清中hCGβ浓度仍可达到 250 mIU/ml
乳酸杆菌基因工程的挑战：
优势 G＋细菌
不存在周质空间，可直接从上清中 获得分泌性表达的目的蛋白 不易裂解，质粒抽提效率低 外源基因导入困难(不接受连接混 合物；需大量纯化的质粒：电转 一次，500ng)
劣势
无商品化工具
整合型表达载体pIlac、表达菌Lb casei CECT5276
RBS
PstI
在5μg/ml红霉素的MRS平板上无生长 而未经传代的细菌可生长 说明红霉素耐药基因已自发缺失
Lb. casei hCGβ稳定菌株体外分泌hCGβ动态观 察
300 250 200
mIU/ml
150 100 50 0 0 13 21 24 ¡ Ê Ð ± 38 45 60
外源基因hCGβ整合对 Lb. casei 生长状态的影响