乳酸乳球菌作为黏膜免疫活载体疫苗传递抗原的研究进展

［1］ 疫小鼠的抗 ’’?> 皮肤感染能力强 。这些实验均证实了乳
! 表达外源抗原的乳酸乳球菌是理想的黏膜免疫 活载体疫苗
黏膜免疫作为机体的第一道屏障阻止经口腔、 呼吸道、 生殖道等途径感染的病原微生物入侵， 是预防感染的最佳途 径。 理想的黏膜免疫活载体疫苗可以促进抗原和免疫系统 之间的有效接触、 刺激体液和细胞免疫反应、 在单剂量免疫 以后产生长期的免疫保护作用， 并且稳定、 无毒性。目前研 究得最多的是致弱病原菌载体， 因其仍可能保持侵袭性和毒 表"
［O% 2 OO］ 。这些探索为其他外源分泌蛋白在乳酸 的信号肽系列 ［ON］ 菌 中 的 大 量 表 达 奠 定 了 基 础。 MD<-IHDLV4I-A<A! 等 （O%%N） 通过插入 1 个氨基酸残基的合成肽使 $5 型人乳头状 瘤病毒 )9 蛋白和 /IF 融合蛋白的分泌效率显著提高。实验 证明， 来源于乳酸乳球菌的 P#3R& 信号肽 （ P#38J） 为目前已 知提高外源蛋白分泌效率最高的信号肽。 在细胞内表达的外源抗原不能充分地与黏膜免疫系统 接触而影响免疫应答强度是目前的一个主要问题。我们将 细胞内表达 ’()* 核衣壳蛋白的重组乳酸乳球菌经口服途 径免疫小鼠后， 可以在小鼠粪便中检测到抗 ’()* 的特异性 但是抗体滴度不高。这可能正是由于在细胞内表 @+7 抗体， 达的外源核衣壳蛋白不能充分的刺激黏膜免疫系统产生特 异性免疫应答。因此， 如何使表达在细胞胞浆中的外源抗原 ［OR］ 暴露于黏膜表面很关键。 6"=A 等 （O%%R） 在乳酸乳球菌中 该基因编码的金 成功表达来源于粪便肠球菌的 )!=. 基因， 属内切蛋白酶肠溶素 7 为一种乳酸乳球菌自溶酶， 可以调 控乳酸乳球菌的自溶。/@>) 系统表达该基因的乳酸乳球菌
［’］ 能正常发挥； 最后， 乳酸乳球菌基本不在胃肠道内定植 ， 这
乳酸菌 （ /6?,7+ 6?7B N6?,.C76， 是一群能大量发酵碳水 J(O） 化合物并产生乳酸的革兰氏阳性细菌， 包括乳酸球菌、 乳酸 杆菌、 双歧杆菌等十几个属。乳酸菌是人和大多数动物肠道 内的常见细菌， 在食品工业各个领域中的长期应用已证明其 无致病性， 被公认为安全级 （ *.:.C6//8 C.?=*:7D.B 6+ +6E.， FG(H） 微生物。#$ 世纪 %$ 年代， 为更好的控制其参与食品加工的 过程， 人们开始致力于对乳酸菌生物学性质和分子机制的研 究。分子生物学技术的不断进步为探索其新的应用潜力提 供了基础： 如利用基因工程乳酸菌在生物反应器内发酵食品 或直接在人和动物消化道内生产蛋白等， 其中最有前景的应 用即是乳酸菌作为活载体将治疗性蛋白或抗原传递至黏膜 表面， 继 而 同 时 诱 导 黏 膜 免 疫 和 系 统 免 疫。乳 酸 乳 球 菌 （ !"#$%#%##&’ ("#$)’ ） 是乳酸菌的一个重要菌种， 以其生长迅速、 易于操作等优点成为表达外源蛋白、 作为活载体疫苗传递抗 原的理想选择。
一特点可以避免因其长期定植而导致的免疫耐受。 近年来， 对于乳酸乳球菌外源蛋白表达系统的研究逐渐
［!］ 深入。T)7Q.C+ 等 先后用组成型和诱导型启动子实现了外
源蛋白在乳酸乳球菌的高效表达。针对蛋白过量表达对细 胞造成的毒害作用， 开发出多种含有不同诱导型启动子的表 达系统， 通过诱导物、 抑制物或环境因素的控制将外源基因 的表达限定在需要的范围内。 （233!） 构建的以乳糖操纵子为基础的乳糖诱导 B. U=+ 等 转录系统为一种代表性控制型表达系统， 但该系统诱导水平 较低使其应用受到限制。另外， 使用大肠杆菌噬菌体 -K 启 ［2$］ 动子的表达系统也具有同样的弊病。 V’ （233"） H)//7W6: 等 开发了基于乳球菌噬菌体的表达系统， 此系统将噬菌体诱导 使外源蛋白表达效率增加 ’$ SX( 扩增和基因表达结合起来， 倍以上， 但最终会导致不可控制的细胞溶解， 因此仍不能成 为理想的外源蛋白表达系统。 针对以上问题， （233"） 开发了一种基于乳酸 B. G)8,.C 等 乳球菌 :7+( 启动子的可调控表达系统 （ XYI40+8+,.5， ,<. :7+7: 。 :7+( 启 动 子 的 活 性 由 :7+G 和 ?=:,C=//.B .ZQC.++7=: +8+,.5） （膜结合感应蛋白） 接 :7+T 组成的双组分调节系统调节： :7+T 受外源 :7+7: 肽信号， 自身磷酸化后激活 :7+G （胞浆内反应调 启动下游基因的表达。该 节子） ， 之后 :7+G 激活 :7+( 启动子， 表达系统与其它表达系统比较具有明显的优势： 首先诱导物 在一些国家是作为天然安全的保鲜 :7+7: 为一种生物安全肽， 剂应用于食品工业中； 更重要的是可以根据需要严格控制外
’ABCD $ 7!="+D!# MAF=D<"AC A!="+D!# J<;=D"! ’’?> >J8 P<DM .9,.$O 83A7 *"<AC A!="+D!# M>* D3"=;3D /#3R )9 7$,7N ;U *J$ JA<A#"="FAC A!="+D!# (CI<3VE#3N
酸乳球菌可有效提高黏膜免疫系统提呈抗原及诱导特异性 免疫应答的能力， 具有成为新型口服疫苗诱导黏膜免疫应答 的潜力。 迄今为止， 已有多种病原微生物抗原在乳酸乳球菌中得
!
乳酸乳球菌是一种理想的外源蛋白表达主菌
乳酸乳球菌是乳酸菌中的典型菌种， 其全部基因组序列
［2］ 已经获得 。乳酸乳球菌作为表达外源蛋白的理想菌株有
其独特的优势
［#］
： 首先， 该菌长期以来一直被应用于食品发
酵和保存中， 实践证明是安全的。这就有别于其它未被归于 安全范围内的活疫苗载体 （如沙门氏菌， 大肠杆菌和痘病毒 等） ； 而且与上述载体不同的是， 乳酸乳球菌抗原性弱， 载体 本身不会引起强烈的免疫应答， 可以利用同一载体对动物进 行多次免疫； 其次， 乳酸乳球菌本身分泌蛋白较少， （一 P+Q!1 种分子量为 !1RS6 的未知蛋白） 是迄今唯一可检测的由乳酸 乳球菌分泌的蛋白。这一特点减少了载体微生物的自身蛋 白对外源分泌蛋白的干扰。外源性分泌蛋白容易发生细胞
史
达等： 乳酸乳球菌作为黏膜免疫活载体疫苗传递抗原的研究进展 W , 微生物学报 （O%%5） （R） R5
5:$
源蛋白的表达量。研究表明， 该启动子的活性与培养基中的 并且其诱导效率可达 $%%% 倍以上 。 !"#"! 浓度成线形关系， 近年来由乳球菌表达的外源蛋白大多数都是在此系统的基 础上实现的。我们实验室在利用该系统表达猪传染性胃肠 炎病毒 （’()*） 核衣壳蛋白的研究中， 也证实了培养基中的 诱导物 !"#"! 浓度达到 $!+,-. 时， 即可以有效诱导 ’()* 核 衣壳蛋白在乳酸乳球菌 /01%%% 中表达。但是未发现培养基 外源蛋白的表达量与 中的诱导物浓度在 $ 2 &!+,-. 之间时， 诱导物浓度之间存在明显线形关系。 与此同时， 也相继开发出一些根据环境条件 （如 34 值， 温度或离子浓度等） 调节乳球菌启动子的外源蛋白表达系 统。
［$% 2 $1］ 到有效表达 （表 $） 。 乳酸乳球菌表达的微生物抗原
E"F<;B"AC A!="+D!# DG3<D##DH "! .AF=;F;FFI# CAF="# ’"-D $11N O%%% O%%$ O%%N O%%R $111 O%%$ O%%O O%%& K<"+"! >C;#=<"H"I- =D=A!" 8=<D3=F;FFI#3!DI-;!"AD 4DC"F;BAF=D< 3QC;<" M<IFDCCA AB;<=I# )<Q#"3DC;=S<"G <SI#";3A=S"AD M;T"!D F;<A!AT"<I# M;T"!D <;=AT"<I# 4I-A! 3A3"CC;-AT"<I# =Q3D $5 )!=D<;T"<I# 9$ .;FAC"LA=";! 8 8 > 8,>,7 8 8 > 8,7 7 8
" 通讯作者。 -./： %"0!12011232!2$； 40567/： 8797:*/7; 86<==> ?=5
作者简介： 史
达 （23%2 @ ） ， 女， 黑龙江人， 硕士研究生， 主要研究方向为兽医微生物学。 40567/： A=+<7+<7B6; <=,567/ > ?=5
收稿日期： 接受日期： 修回日期： #$$10$30#$； #$$"0$’0$3； #$$"0$’0$’
随着分子生物学技术的不断进步和各种乳酸乳球菌外 源蛋白表达系统的成功开发， 利用乳酸乳球菌表达外源蛋白 已经相对容易， 但仅能够实现外源蛋白表达是远远不够的。 活载体细菌以什么方式向黏膜免疫系统提呈抗原， 如何使所 表达的外源抗原与免疫系统充分接触继而诱导有效免疫应 答是巨大的挑战， 也是目前该领域研究的热点。 #$" 准确定位外源蛋白在乳酸乳球菌中的表达位置 目前为止多数乳酸乳球菌表达的外源抗原都是以分泌 ， 因此提高重组乳酸乳球菌外源蛋白的分 形式表达的 （表 $） 泌效率对于促进黏膜免疫反应是必要的。 .D .;"< 等 （$11:） 将 1 个氨基酸残基的合成肽插入信号肽切割位点之后， 使外 源蛋白 /IF 在乳酸乳球菌中的分泌效率增加了 :%X 。随后 的几年中， .D .;"< 和 6AY! 等开发出多种适合于乳酸乳球菌