乳酸乳球菌电转化条件的研究
电转化
电转化1.电转化感受态细胞的制备1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。
（同时做培养基和枪头的空白对照）2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。
3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。
4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。
5.弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。
6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min.7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油， 4℃， 4000rpm，离心10min.8. 弃上清，每个离心杯中加入5ml10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。
同时取100 μl 感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。
9.次日观察转化子生长情况，并记录。
2.连接产物纯化1.将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂：10ul of ddH2O2ul of 3M NaAC（PH5.2）50ul of 无水乙醇轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上；2.4℃，top Speed 离心30分钟；3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；4.加入500ul70％的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；5.4℃，top Speed离心5分钟；6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味；7.加入10ulddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用；3.电转化1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；2.取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。
PEDVps420片段乳酸乳球菌表达及免疫中和活性检测
Ａｂ ｔ ａ ｔ ａ ｔｃ ｃ ｕ ａ ｔ ｓ ｓ ｌ ｔｄ ａ ａ ｔ ｒ Ｉｃ ｒｉｒｆ ｒｔｅ ｅ ｐｅ ｓｏ ｆＰ ｒｉｅ ｓ ｒ ｃ ：Ｌ ｃｏ ｏ ｃ ｓ ｌｃｉ ｗａ ｅｅ ｅ ｓ ａ ｂ ｃｅｉ ａ ｒ ｏ ｈ ｘ ｒｓ ｉｎ ｏ ｏｃｎ ｓ ｃ ａ ｅ
ｐ ｏ ｅｎ ｗａ ｃｏｎ ｄ ｎｏ ｔ ｅ Ｌ ｃ ｏ ｏ ｃ ｓ ａｃｉ ｘ ｒ ｓ ｉ ｅ ｔ ｒ ｐＮＺ８ ２．ａ ｄ ｈ ｎ ｔ ｅ ｃ ｓ ｒ ｃｅ ｒ ｔ ｉ ｓ ｌ ｅ ｉｔ ｈ ａ ｔｃ ｃ ｕ ｌ ｔ ｅ ｐ ｅ ｓｏｎ ｖ ｃｏ ｓ １ １ ｎ ｔ ｅ ｈ ｏｎ ｔｕ ｔ ｄ ｒ ｃ ｂｎ ｎ ｅ ｏ ＮＺ８１ 一 ｓ ０ｗａ ｅ ｒ ｔａ ｓｏ ｍｅ ｔ ａ ｔｃ ｃ ｕ ｔ ｅ ｏｍ ｉａ ｔ ｃ ｒｐ ｖｔ ２ ｐ ４２ ｓｅｌｃ ｏ ｒ ｎ ｆ ｒ ｄ ｉ ｏ Ｌ ｃｏ ｏ ｃ ｓ ｌ ｉ ＮＺ９ ００ｇ ｅ ａ ｉｇ ｔｅ １ ｔ ｎ ａｃ ｓ ０ ｅｎ ｒ ｔ ｈ ｎ
ｐ Ｚ １２中，构建 了重组表达载体 ｐ Ｚ １２ ｐ４ ０ Ｎ ８１ Ｎ ８ １一 ｓ２ ，将其 电转化入 乳酸乳球菌 Ｌｃｏｏｃ ｌ ｔ Ｚ ０ ０ ａｔｃｃ ａ ｉＮ ９ ０ ，获得 了 ｃｓ 表达猪流行性腹 泻病 毒 ｓ基 因 ｐ４ ０的重组 乳酸乳球 菌，经乳链茵肽 （ ｉ ｎ 在 Ｇ ７培养基 中诱 导表达 ，Ｓ Ｓ ｓ２ Ｎｓ ） ｉ Ｍ１ Ｄ— ＰＧ Ａ Ｅ检测表 明，约有 大小分别为 ｌ ｕ的蛋 白得到表达 ，与理论 值相符。Ｗｅｔ ｌ 结果和 间接 免疫荧光试验 ５ｋ ｓ ｍｂｏ ｅ ｔ 结果分析 表明 ，表达的蛋 白在 茵体表 面且 可被兔 源 Ｐ Ｄ Ｅ Ｖ抗血 清所识 别。重组菌 口服 免疫接种 家兔 获得抗 血清 ， 进行 Ｐ Ｄ Ｅ Ｖ细胞 中和试验结果表 明重组 茵可诱发 血清中和 ＩＧ产生 ，血清 中和抗体效价达 １ ０ 。 ｇ ： ５ １ 关键词 ：猪流行性腹 泻病毒 ；中和表位 区；乳酸乳球 茵；中和抗原
乳酸杆菌的研究进展
乳酸杆菌的研究进展编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（乳酸杆菌的研究进展）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
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本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为乳酸杆菌的研究进展的全部内容。
乳酸杆菌的研究进展摘要乳酸杆菌是一类近年来研究较多的益生素,大量试验结果表明，乳酸杆菌中的一部分菌种对人和动物的保健和疾病治疗有效果。
本文主要介绍了乳酸杆菌的分离与鉴定，菌种的保藏，代谢产物，生理功能及应用研究，是一种前景广阔的微生态制剂。
乳酸杆菌乳酸杆菌，是一类能使糖类发酵产生乳酸的细菌,是一群生活在机体内益于宿主健康的微生物。
乳酸杆菌存在广泛,其生长温度在20～53℃ ，最适温度为30~40 ℃；嗜酸性，最适合pH5.5～6.0,在pH3.0～4.5中仍然能生存,在无芽胞杆菌中其耐酸力最强。
乳酸杆菌是一群杆状或球状的革兰氏阳性细菌,不形成芽孢，触媒阴性,细胞色素缺失，其DNA中G+C含量少于55%。
乳酸杆菌绝大多数是厌氧菌或者兼性厌氧的化能营养菌，生长繁殖于厌氧或微好氧、矿物质和有机营养物丰富的微酸性环境中。
在污水、发酵生产（如青贮饲料、果酒啤酒、泡菜、酱油、酸奶、干酪)培养物、动物消化道等中乳酸杆菌含量较高。
乳酸菌不仅已广泛应用于畜牧业、食品加工业, 随着研究的深入，也在一些疾病治疗中得以应用，用于增强患者的免疫、营养、生长刺激等。
乳酸杆菌的分离与鉴定1 乳酸杆菌的分离从不同的基质中分离乳酸杆菌时，根据乳酸杆菌所在生长环境的不同以及是否为优势菌可选择不同组分的培养基。
主要有以下几种常用的培养基[1］：（1) MRS 培养基当乳酸杆菌是待分离区系的优势菌时，常用MRS 培养基对其进行分离。
乳酸催化转化制备丙烯酸和2,3戊二酮反应
汇烯酸 • 2，3戊二酮的合成与表征 • 乳酸催化转化制备丙烯酸和2，3戊二酮的反应
机理研究 • 结论与展望 • 参考文献
01
引言
研究背景和意义
乳酸是一种天然的有机酸，具有广泛的用途。近年来，乳酸的催化转化制备丙烯 酸和2，3戊二酮等高附加值化学品引起了科研人员的关注。
动力学研究是探讨反应机理的重要手段。通 过对反应速率常数、活化能等参数的测定和 分析，可以更深入地了解反应的机理和动力 学过程。通过对这些参数的优化和控制，可
以进一步提高产物的收率和性能。
05
结论与展望
研究结论与贡献
01 02
成功合成丙烯酸和2，3戊二酮
通过乳酸催化转化成功合成了丙烯酸和2，3戊二酮两种重要的有机化合 物。这一方法具有较高的转化率和选择性，为有机化学工业提供了新的 合成路线。
2，3戊二酮的表征分析
气相色谱法（GC）
气相色谱法是一种常用的有机化合物分析方法。通过色谱柱将2，3戊二酮分离成不同 的组分，然后通过检测器测定每个组分的含量和纯度。该方法具有灵敏度高、分离效果
好等优点。
质谱法（MS）
质谱法是一种用于确定有机化合物分子结构和组成的方法。通过将2，3戊二酮离子化 后，在电场或磁场中运动并分裂成不同的碎片离子，从而确定其分子结构和组成。该方
02
乳酸催化转化制备丙烯酸
乳酸的性质和用途
乳酸的性质
乳酸是一种有机酸，具有羧酸基团和羟基基团。它具有较低的熔点和较高的溶 解度，易溶于水。乳酸具有酸性和酯化性质，广泛应用于食品、医药、化工等 领域。
乳酸的用途
乳酸是一种重要的化工原料，主要用于食品、医药、化工等领域。它可用于生 产乳酸盐、乳酸酯等化合物，也可用于合成丙烯酸等有机化合物。此外，乳酸 还可作为防腐剂、保湿剂等用于食品和医药领域。
乳酸菌分离制作酸奶的实验报告
乳酸菌分离制作酸奶的实验报告实验报告：乳酸菌分离制作酸奶摘要：本实验旨在通过分离乳酸菌并制作酸奶的方法，检验其对牛奶的发酵作用及产酸能力。
首先，使用MRS琼脂培养基筛选出乳酸菌，然后将筛选得到的乳酸菌培养至稳定并筛选出最优菌株。
在石蜡油浴中控制发酵温度，制作乳酸酸奶。
结果显示，乳酸菌具有发酵能力，并能将牛奶转化为酸奶。
本实验结果可为酸奶生产工艺提供一定的理论依据。
关键词：乳酸菌、酸奶、分离、发酵、牛奶引言：酸奶是一种由牛奶经乳酸菌发酵制成的乳制品。
它具有很高的营养价值和保健功效，对人体健康有益。
酸奶的制作过程主要依赖于乳酸菌的发酵作用将牛奶中的乳糖转化为乳酸。
因此，充分了解乳酸菌的发酵特性对于酸奶的生产具有重要意义。
实验目的：1.分离筛选具有较高产酸能力的乳酸菌。
2.探索乳酸菌对牛奶的发酵作用。
3.制作乳酸酸奶并评估其质量。
材料与方法：1.材料：酸奶、牛奶、MRS琼脂培养基、蒸馏水。
2.仪器：培养皿、试管、恒温培养箱、石蜡油浴。
3.方法：a.分离乳酸菌：取适量酸奶和牛奶混合，均匀地涂抹在MRS琼脂培养基上，培养于恒温培养箱中37℃下48小时。
b.从培养基上选择纯培养基成独立菌落的乳酸菌，接种于MRS培养基中，再次传代定植。
c.选择最优菌株：通过观察不同菌落的形态和产酸量，在接种过程中筛选出最优菌株。
d.制作酸奶：取适量最优菌株培养物，加入5%的牛奶中，加入酸奶中的菌株用于酸奶制作。
将牛奶菌株混合物放入石蜡油浴中，保持恒温（42℃）发酵约12小时。
e.评估酸奶质量：检测酸奶的质地、味道和酸度。
结果与讨论：通过上述实验步骤，我们成功地分离出多株产酸能力较高的乳酸菌，并筛选出最优菌株。
经过发酵，最优菌株能够将牛奶发酵为酸奶，酸奶的质地、味道和酸度也得到了良好的保持。
这说明最优菌株的发酵作用有效，并能将牛奶中的乳糖转化为乳酸。
酸奶的产酸性能使其具有更好的口感和营养特性。
结论：本实验成功地分离出产酸能力较高的乳酸菌，并以之制作了酸奶。
乳酸乳球菌中的表达
乳酸乳球菌中的表达在食品方面，乳酸乳球菌可是大功臣。
比如说在制作酸奶的时候，它就在里面悄悄地发挥着自己的魔力。
它可以把牛奶里的乳糖变成乳酸，这就是为啥酸奶会有那种酸酸的口感啦。
而且呀，这个过程还让酸奶变得更加健康，因为对于那些乳糖不耐受的小伙伴来说，经过乳酸乳球菌作用后的酸奶就更容易被接受了。
在医药领域呢，乳酸乳球菌也有它的一席之地。
科学家们就想着能不能让它携带一些对人体有益的基因或者药物成分呢。
这就像是让它当一个小小的快递员，把好东西送到人体需要的地方。
不过这个过程可不容易，要让乳酸乳球菌好好地表达出那些我们想要的东西，就像是教一个小孩子学习一门新的语言一样难。
再讲讲在生物技术研究里的情况。
研究人员在实验室里，拿着各种各样的仪器，就为了搞清楚乳酸乳球菌的表达机制。
他们得知道在什么条件下，乳酸乳球菌能更好地表达出特定的蛋白质或者其他生物活性物质。
是温度影响大呢，还是营养物质的种类和含量影响大呢？这都是他们要探索的问题。
有时候，为了让乳酸乳球菌按照我们的想法来表达，得给它创造一个超级舒适的环境。
就像是给它盖一个专属的小房子，里面的温度、湿度、营养都得恰到好处。
而且还要防止其他不速之客微生物来捣乱。
从基因层面来说，乳酸乳球菌的基因就像是一本神秘的密码本。
研究人员得慢慢去解读这个密码本，找到那些控制表达的关键基因片段。
要是能破解这些密码，那就能更好地操纵乳酸乳球菌的表达了。
在工业生产中，如何大规模地让乳酸乳球菌稳定地表达也是个头疼的问题。
因为工业生产可不是像在实验室里小打小闹，要考虑成本、效率、质量等好多好多因素。
如果能解决这个问题，那就能让乳酸乳球菌在更多的产品中发挥作用，给我们带来更多的惊喜。
不过呢，虽然现在我们对乳酸乳球菌中的表达有了一些了解，但是还有好多未知的领域等着我们去探索。
就像在一个巨大的宝藏岛上，我们只找到了一点点小财宝，还有更多的财宝在等着我们去挖掘呢。
说不定哪一天，我们就能利用乳酸乳球菌创造出超级厉害的产品，让我们的生活变得更加美好。
谷氨酸棒杆菌中高效电转化机制的研究
谷氨酸棒杆菌中高效电转化机制的研究
乳酸胺酸棒杆菌(Lactate permeability rod，LPR)是一种生物燃料电池中最常用的微生物。
它可以有效的将乳酸转化成二氧化碳和氢气，用于高效电转化。
因此，关于乳酸胺酸棒杆菌中高效电转化机制的研究具有重要的理论意义和应用价值。
乳酸胺酸棒杆菌通过氧化/还原过程来转化乳酸。
它具有两种多细胞巴氏微生物体，可分别用来进行电子传递和空气氧化的乙醛的过程。
在电子传递的过程中，乳酸可以被还原并转化成乙酰乙酸，然后再经由乙二醇还原成乙醇；在空气氧化过程中，乙醇可被氧化转化成乙酸和水。
最后，乙酸可以被还原转化成二氧化碳和氢气，从而实现高效的电转化。
根据上述介绍，可以看出，乳酸胺酸棒杆菌能够通过氧化/还原过程转化乳酸A并实现高效的电转化，这是一个复杂的化学过程。
因此，深入研究乳酸胺酸棒杆菌中的高效电转化机制，可能为燃料电池的优化和应用提供重要的理论依据。
总之，乳酸胺酸棒杆菌能够有效转化乳酸并实现高效的电转化，深入研究其中的高效电转化机制，可能为提高燃料电池性能和应用价值提供指导。
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第４０卷 Ｖｏ１．４０第３期 Ｎｏ． ３山东大学学报（理学版）
ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＨＡＮＤＯＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ２００５年６月
Ｊｕｎ． ２００５
文章编号：１６７１－９３５２（２００５）０３－０１２１－０４
乳酸乳球菌电转化条件的研究孙磊，孔文涛，孔健‘（山东大学微生物技术国家重点实验室，山东济南２５０１００）
摘要：以质粒ｐＴＲＫＨ２为材料，对乳酸乳球菌ＭＧ１６１４进行电转化条件的研究．实验结果表明，在电转化过程中，电场强度、电阻大小、细胞生长状态和电击后菌株复苏时间均对转化效率有明显影响，得到了乳酸乳球菌的最适电转化条件为：对数生长中期的细胞，经１％甘氨酸处理，在１０ ｋＶ／ｃｍ电场强度、４００ Ｓ２电阻下电转化，转化后细胞在ＳＧＭ １７培养液中培养２ｈ后涂布选择性培养基，转化率（转化子个数与ＤＮＡ质量之比）可达１．２ｘ１０，个／ｌｋｇ，比优化前的转化效率提高近１００倍．关键词：乳酸乳球菌；电转化；转化效率中图分类号：Ｑ９３３文献标识码：Ａ
Ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｃ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ
ＳＵＮ Ｌｅｉ，ＫＯＮＧ Ｗｅｎ－ｔａｏ＆ＫＯＮＧ Ｔａｎ（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖ． ，Ｊｉｎａｎ ２５０１００， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＴＲＫＨ２ ｉｎｔｏ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｃ ＭＧ１６１４． Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈｐｈａｓｅ， ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｓｔｒｅｎｇｔｈ， ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｌｌ ａｆｅｃｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｆａｃｔｏｒｓ ａｒｅ ｔｈｅ ｃｅｌｌｈａｒｖｅｓｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｍｉｄｄｌｅ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ， ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｔ １０．０ ｋＶ／ｃｍ ａｎｄ ４００ｎ，２ ｈ ｃｅｌｌ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓ－ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｇｏｅｓ ｕｐ ｔｏ １ ．２ ｘ １Ｊｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｐｅｒ ｊｉｇ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｆａｃｔｏｒｓ， ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｏｐｔｉｍｉｚ ｔｈｏｓｅ
ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｂｅｆｏｒｅ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｃ ； ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ； ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
乳酸乳球菌（Ｌａｃｔｌａｃｔｉｓ）是乳品工业发酵的重要菌种〔‘〕，也是腌制蔬菜、肉制品的常用菌种【’〕，在食品加工中有着重要的作用．因此，乳酸乳球菌成为基因工程研究的模式菌株．人们利用ＤＮＡ重组技术，使其携带外源基因并表达外源基因产物，从而发挥更大应用价值〔’〕． 乳酸乳球菌的转化需要一套稳定方便的转化方法．目前乳酸乳球菌的转化方法主要有原生质体转收稿日期：２００４－１２－３１基金项目：山东省中青年科学家奖励基金资助项目（ＯＩＢＳ１２）作者简介：孙磊（１９７６－），女，硕士研究生，从事微生物技术研究．＊通讯作者化法和电转化法两种．原生质体转化法存在耗时长、转化效率低、稳定性差等缺点闭，故广泛采用的是电转化法［１５１．但在当前的实验条件下电转化法并不十分完善，主要存在转化效率低、重复性差等缺点．本文就影响乳酸乳球菌电转化的几个主要因素进行了研究，建立了稳定的优化条件，获得了可靠的较高的电转化效率．１２２山东大学学报（理学版）第４０卷１材料与方法 固定电阻为４００ Ｓ２，电容为２５ ｔＡＦ，改变电场强度进行电转化．电场强度对转化效率的影响结果如图１所示．
叮．二・分。１认ｕ口。「。旧
。
１．１菌株与质粒 乳酸乳球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ） ＭＧ１６１４，为本实验室保藏． ｐＴＲＫＨ２质粒［［６］，带有红霉素抗性基因，分子量
６．９ ｋｂ，为大肠杆菌一乳酸菌穿梭质粒．１．２培养基与缓冲液 Ｍ１７培养基：英国Ｏｘｏｉｄ公司生产；ＧＭ １７培养基：Ｍ１７＋０．５％葡萄糖；ＳＧＭ １７培养基：１０ ｍＬ Ｍ１７ ＋１ ５２６ ｔｔＬ ５０％蔗糖＋２００ ｐ．Ｌ ５０％葡萄糖十１００ ｔｔＬ ２ ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌｚ＋４０ ［ＬＬ ０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２； 溶液１ ：５０ ｍＬ ２ ｘ Ｍ１７ ＋ １ ｍＬ ５０％葡萄糖＋３４ ｍＬ ５０％蔗糖＋１０ ｍＬ １０％甘氨酸＋５ｍＬｄｄ从０； 溶液ＩＩ ： ３４ ｍＬ ５０％蔗糖＋１０ ｍＬ甘油＋５６ ｍＬ ｄｄＨ２ ０． 上述葡萄糖、蔗糖浓度均为质量体积比．１．３实验仪器 电脉冲仪：美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司生产．
１．４实验方法［７ｌ１．４．１感受态细胞的制备 将Ｌ． ｌａｃｔｉｓ ＭＧ１６１４接种到ＧＭ １７培养液中，３０℃培养过夜后，以２％接种量转接到溶液工中，３０℃培养，在６００ ｎｍ下测菌液吸光度．当ＯＤ＊二０．４一０．９时，离心收集细胞，用３０ ｍＬ溶液ＩＩ洗涤细胞２次，离心去上清后用１ ｍＬ溶液ＩＩ悬浮细胞．取４０ ｕＬ于１．５ ｍＬ离心管中，一７０℃冷冻保存待用．１．４．２电转化 取１ ｒ．Ｌ质粒ＤＮＡ与４０ ｐ Ｌ的感受态细胞悬浮液混合，移人电转化杯中，冰浴１０ ｍｉｎ，设置电击参数，然后将转化杯置于电击槽中电击．电击完毕后立即向杯中加入％０ ｔｔＬ的ＳＧＭ １７培养液，冰上放置５ｍｉｎ， ３０℃静止培养一定时间，涂布含有红霉素的ＧＭ １７平板，培养３６－４８ｈ，计数转化子，根据质粒ＤＮＡ的浓度，计算每１ｉ． ｇ ＤＮＡ所得的转化子个数，即为转化效率．每项条件优化做３次重复实验．
０ ２．５ ５．０ ７．５ １０．０ １２．５ＥＡＶ・ｃｍ－１图１电场强度对电转化效率的影响Ｆｉｇ． １ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｉｅｌｄ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
由图１可知，在固空电阻为４００ ｆｌ时，转化效率随电场强度的增加而增加，在电场强度为１０ ｋＶ／ｃｍ时达到最大．之后随电场强度的增加转化效率反而下降． 电穿孔作用是利用瞬间高压击打细胞膜，使之形成孔洞，使ＤＮＡ分子得以进人细胞［１８１．在电击过程中，如电压过低，细胞难以极化产生孔洞，ＤＮＡ不能进人；如电压过高，细胞会因细胞膜损伤过大而死亡，从而导致转化效率的降低．２．２电阻大小对转化效率的影响 固定电场强度为１０ ｋＶ／ｃｍ，电容为２５ ｐｔＦ，改变电阻大小进行电转化．电阻大小对转化效率的影响结果见图２．
１２１０ ８ ６ ４ ２ ０
呼．盆・令ＮＯ工认
。昌叫ｕ妇。
２结果与讨论２．１电场强度对转化效率的影响
０ １００ ２００ ３００ ４００ ５００ 双尹０ 图２电阻对电转化效率的影响 Ｆｉｇ． ２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｉｃｉｅｎｃｙ
由图２可知，电场强度为１０ ｋＶ／ｃｍ时，转化效率随电阻的增加而增加，在电阻为４０００时达到最大．之后随电阻的增加转化效率反而下降．２．３细胞生长时期对转化效率的影响第３期孙磊，等：乳酸乳球菌电转化条件的研究１２３
固定电场强度为１０ ｋＶ／ｃｍ，电阻为４００ ｎ，电容为２５ ｔ．Ｆ，取不同生长时期的细胞进行电转化．其对转化效率的影响结果见图３．
苏时间长短对转化效率的影响结果如图５所示．
，哭・令Ｎｏｌ飞
ｏｕ。叫。日
。
，‘
０
ＱＵ
６
４２０
，哭・分。［认ｕ口。叫。嗯
６ ６．５．７ ７．５ Ｓ 图３细胞生长时期对电转化效率的影响Ｆｉｇ． ３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｐｈａｓｅ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
细胞的生长曲线见图４．
ｒ／山盛ｎ 图５复苏时间对电转化效率的影响 Ｆｉｇ． ５ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
由图５可知，细胞复苏时间达到２ｈ，才能有比较好的转化效率；；２ｈ以后，转化效率增长不明显，故实际操作中选择２ｈ为比较稳妥的时间．２．５其他因素对转化效率的影响 除上述因素外，下面一些因素也对转化效率构成影响：２．５．１质粒ＤＮＡ浓度 质粒ＤＮＡ浓度过低或过高时转化效率都有所下降．原因可能是当质粒ＤＮＡ浓度过低时，ＤＮＡ分子太少不足以产生高转化效率；而浓度过高时，细胞能吸收的ＤＮＡ分子过饱和，反而不利于转化［１９１．实验中当质粒ＤＮＡ浓度为１ ｔ．ｇ／ｔｋＬ时效率最高．２．５．２筛选培养基中的抗生素浓度 抗生素浓度过高会抑制转化子的生长，导致转化效率的降低〔１０１，而过低则不能保证转化子的可靠性，起不到筛选作用．２．５．３电转化杯的使用次数 初次使用的电转化杯效率最高，重复使用后效率将大幅度降低，故实验中采用新电转化杯进行电击转化．２．５．４质粒和菌株的差异 不同的质粒载体和不同的菌株其转化效率有所不同．原因可能是质粒的大小差异导致了一定电击时间内进人细胞的质粒数量的差异［’‘〕．不同的菌株其细胞膜孔洞形成的难易程度亦不同．
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ｔ／ｈ 图４ ＭＧ１６１４生长曲线 Ｆｉｇ．４ ＭＧ１６１４ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ
由图３可知，转化效率随细胞培养时间的增加而增加，在培养时间为７．５ ｈ达到最大，对照图４可知，此时细胞正处于对数生长中期．之后转化效率随培养时间的延长反而下降．这是由于外源ＤＮＡ是通过孔洞进人细胞的，处于对数生长中期的细胞生长旺盛，细胞壁结构较稳定期细胞相对疏松，因此有利于孔洞的形成，从而提高电转化效率．２．４细胞复苏时间对转化效率的影响 由于电击使细胞膜产生孔洞，致使细胞在非高渗溶液中容易破裂，因此细胞在电击后必须在高渗培养液ＳＧＭ １７中进行一段时间的复苏，以利于细胞膜孔洞闭合复原，提高细胞的存活率，从而提高转化效率． 固定电场强度为１０ ｋＶ／ｃｍ，电阻为４００ ｄＺ，电容为２５ ｕＦ，进行电转化．改变电击后细胞复苏时间，复
参考文献：［１］杨洁彬，凌代文，郭兴华，等．乳酸菌—生物学基础及 应用仁Ｍ］．北京：中国轻工业出版社，１９９６．５一２６，９０一９１．仁２］ Ｄａｅｓｃｈｅｌ Ｍ Ａ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅ－ ｒｉａ ｆｏｒ ｕｓｅ ａｓ ｆｏｏｄ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ［ Ｊ ］．Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ，１９８９，４３：