现代分子生物学课件-第六章上课讲义
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2024版年度现代分子生物学(全套课件180P)ppt课件
2024/2/3
链的延伸
RNA聚合酶沿DNA模板 移动，催化RNA链的延
伸。
转录终止
RNA聚合酶在特定信号 作用下停止转录，释放
RNA链。
16
转录后修饰
包括5’端加帽、3’端 加尾等修饰过程。
RNA的加工与成熟
剪接
去除内含子，连接外显子，形成成熟的 mRNA。
编辑
对某些核苷酸进行修饰或替换，改变RNA的 编码信息。
DNA复制和修复过程中的突变 和重组为生物进化提供了原材
料。
疾病发生与发展
DNA复制和修复异常可能导致 基因突变和基因组不稳定，进
而引发疾病的发生和发展。
2024/2/3
14
04
RNA转录与加工
2024/2/3
15
RNA转录的过程与机制
转录起始
RNA聚合酶与DNA模板 结合，形成转录起始复
合物。
疗。
基因治疗
通过导入正常基因或修复突变基 因，恢复细胞功能，达到治疗疾
病的目的。
精准医疗
结合基因诊断与治疗，为患者提 供定制化的治疗方案，提高治疗
效果和生活质量。
2024/2/3
26
07
分子生物学技术与应用
2024/2A重组技术
利用限制性内切酶、DNA连接酶等工具酶，实现 DNA片段的切割、连接和重组，构建重组DNA分子。
8
基因组的组成与特点
基因组的定义
基因组是一个生物体所有 基因的总和，包括核基因 组和细胞器基因组。
2024/2/3
基因组的组成
基因组由DNA序列、RNA 序列和蛋白质序列等组成， 其中DNA序列是主要的遗 传物质。
基因组的特点
链的延伸
RNA聚合酶沿DNA模板 移动，催化RNA链的延
伸。
转录终止
RNA聚合酶在特定信号 作用下停止转录，释放
RNA链。
16
转录后修饰
包括5’端加帽、3’端 加尾等修饰过程。
RNA的加工与成熟
剪接
去除内含子，连接外显子，形成成熟的 mRNA。
编辑
对某些核苷酸进行修饰或替换，改变RNA的 编码信息。
DNA复制和修复过程中的突变 和重组为生物进化提供了原材
料。
疾病发生与发展
DNA复制和修复异常可能导致 基因突变和基因组不稳定，进
而引发疾病的发生和发展。
2024/2/3
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04
RNA转录与加工
2024/2/3
15
RNA转录的过程与机制
转录起始
RNA聚合酶与DNA模板 结合，形成转录起始复
合物。
疗。
基因治疗
通过导入正常基因或修复突变基 因，恢复细胞功能，达到治疗疾
病的目的。
精准医疗
结合基因诊断与治疗，为患者提 供定制化的治疗方案，提高治疗
效果和生活质量。
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07
分子生物学技术与应用
2024/2A重组技术
利用限制性内切酶、DNA连接酶等工具酶，实现 DNA片段的切割、连接和重组，构建重组DNA分子。
8
基因组的组成与特点
基因组的定义
基因组是一个生物体所有 基因的总和，包括核基因 组和细胞器基因组。
2024/2/3
基因组的组成
基因组由DNA序列、RNA 序列和蛋白质序列等组成， 其中DNA序列是主要的遗 传物质。
基因组的特点
《现代分子生物学》课件
02
当G蛋白偶联受体与信号分子结合后，会导致G蛋白的活化，进而触发一系列级 联反应，包括磷脂酶C的激活、Ca2+的释放和K+通道的调节等。
03
G蛋白偶联受体介导的信号转导在神经、心血管、内分泌和免疫等多个系统中 发挥重要作用。
酶联受体介导的信号转导
酶联受体是一类能够识别并结合信号分子的跨膜蛋白 ，这些信号分子通常是肽类生长因子或细胞因子。
分子生物学的重要性
分子生物学是现代生物学和医学研究 的基础，它为疾病诊断、预防和治疗 提供了重要的理论基础和技术手段， 对人类健康和生物产业发展具有重要 意义。
分子生物学的发展历程
19世纪末至20世纪初
科学家开始研究生物大分子的结构和 功能，如蛋白质、核酸和糖类的研究 。
1953年
DNA双螺旋结构被发现，开启了分 子生物学时代。
DNA的组成与结构
总结词
DNA由四种不同的脱氧核糖核苷酸组成，它们以特定的序列排列，形成双螺旋 结构。
详细描述
DNA由腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）四种碱基 组成，它们以特定的序列排列，形成双螺旋结构。DNA的双螺旋结构具有稳定 性和遗传信息的存储能力。
DNA的复制、转录和翻译过程
基因组学是研究生物体基因组的学科，通过全基因组测序等技术，可以揭示基因组的序列、结构和功能，为疾病诊断 和治疗提供新的思路和方法。
蛋白质组学研究
蛋白质组学是研究生物体蛋白质组的学科，通过蛋白质组学的研究，可以深入了解蛋白质的结构、功能和相互作用， 为药物研发和疾病治疗提供新的策略和技术。
基因组学与蛋白质组学的技术进展
表观遗传学的研究方法
表观遗传学的研究方法包括基因组测序、甲基化测序、染色质免疫沉淀 等技术，这些技术可以用来检测基因表达的调控变化，为表观遗传学的 研究提供有力支持。
2024年《分子生物学》全册配套完整教学课件pptx
2024/2/29
运输功能
如载体蛋白，血红蛋白等 ，在生物体内运输各种物 质。
免疫功能
如抗体蛋白，参与生物体 的免疫应答。
18
蛋白质的功能与调控
调节功能
如激素，生长因子等，调节生物 体的生长发育和代谢过程。
2024/2/29
储存功能
如植物种子中的贮藏蛋白，动物体 内的肌红蛋白等，储存能量和营养 物质。
个性化医疗
根据患者的基因信息，制定个 性化的治疗方案。
药物基因组学
预测患者对药物的反应和副作 用，指导合理用药。
30
基因治疗的原理与应用
基因治疗的原理
通过导入正常基因或修复缺陷基因， 从而治疗由基因突变引起的疾病。
遗传性疾病的治疗
如视网膜色素变性、腺苷脱氨酶缺乏 症等。
2024/2/29
癌症治疗
利用基因编辑技术，修复或敲除癌症 相关基因，抑制肿瘤生长。
基因表达调控的层次
基因表达调控可分为转录前调控、转录水平调控、转录后调控和翻 译水平调控等多个层次。
基因表达调控的意义
基因表达调控对于生物体的生长发育、代谢、免疫应答等生理过程具 有重要意义，同时也是疾病发生发展的重要因素。
2024/2/29
22
原核生物的基因表达调控
1 2 3
原核生物基因表达调控的特点
26
DNA损伤的修复机制
直接修复
针对某些简单的DNA损伤，如碱 基错配，可通过特定的酶直接进行 修复。
碱基切除修复
通过识别并切除受损碱基，再合成 新的DNA片段进行修复。
2024/2/29
核苷酸切除修复
针对较严重的DNA损伤，如嘧啶 二聚体，通过切除一段包含受损部
运输功能
如载体蛋白，血红蛋白等 ，在生物体内运输各种物 质。
免疫功能
如抗体蛋白，参与生物体 的免疫应答。
18
蛋白质的功能与调控
调节功能
如激素，生长因子等，调节生物 体的生长发育和代谢过程。
2024/2/29
储存功能
如植物种子中的贮藏蛋白，动物体 内的肌红蛋白等，储存能量和营养 物质。
个性化医疗
根据患者的基因信息，制定个 性化的治疗方案。
药物基因组学
预测患者对药物的反应和副作 用，指导合理用药。
30
基因治疗的原理与应用
基因治疗的原理
通过导入正常基因或修复缺陷基因， 从而治疗由基因突变引起的疾病。
遗传性疾病的治疗
如视网膜色素变性、腺苷脱氨酶缺乏 症等。
2024/2/29
癌症治疗
利用基因编辑技术，修复或敲除癌症 相关基因，抑制肿瘤生长。
基因表达调控的层次
基因表达调控可分为转录前调控、转录水平调控、转录后调控和翻 译水平调控等多个层次。
基因表达调控的意义
基因表达调控对于生物体的生长发育、代谢、免疫应答等生理过程具 有重要意义，同时也是疾病发生发展的重要因素。
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22
原核生物的基因表达调控
1 2 3
原核生物基因表达调控的特点
26
DNA损伤的修复机制
直接修复
针对某些简单的DNA损伤，如碱 基错配，可通过特定的酶直接进行 修复。
碱基切除修复
通过识别并切除受损碱基，再合成 新的DNA片段进行修复。
2024/2/29
核苷酸切除修复
针对较严重的DNA损伤，如嘧啶 二聚体，通过切除一段包含受损部
分子生物学第六章
Taq DNA 聚合酶 3D结构
嗜热水生细菌 (Thermus aquaticus)
PCR 过程
1. 模板变性 (Denaturation) 双链 DNA 模板在 95C 变 性为单链 DNA。 2. 引物退火 (Annealing) 引物与单链 DNA 互补并退 火。 3. 延伸反应 (Extention) 热稳定 DNA 聚合酶催化子 链的合成。
3. 基因动、植物的检测 (1) 转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。 (2) 转基因植物的检测：玉米、大豆等。
正常人血红蛋白 亚基源自镰刀型贫血病人血红蛋白 亚基
PCR
正常人血红蛋白 亚基编码基因
DdeI 酶切
琼脂糖凝胶电泳
镰刀型贫血病人血红蛋白 亚基编码基因
核酸分子杂交 (Hybridization of nucleic acids)
具有高度敏感性：用于检测微量的 DNA 或 RNA 样品； 检测每一次 PCR 循环中产物的积累； 扩增反应结束后不需要对PCR 产物进行电泳。
CYCLE NUMBER 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
PCR 反应体系
• • 缓冲液 (Tris-HCl, KCl) MgCl2 或 MgSO4
•
• • • •
DNA 模板
上游引物 (upstream primer, sense primer) 下游引物 (downstream primer, antisense primer) 底物 dNTPs 热稳定 DNA 聚合酶
核酸分子杂交
第六章分子生物学研究法
5
第一节 基因表达研究技术
2 RNA的选择性剪接技术
❖ RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前 体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为：平衡剪 切、5’选择性剪 切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及 相 互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基 因是否存在 选择性剪切。
负对照， mRNA的 同义 链, 无杂交 信号
2020/8/14
9
正对照， UBQ10杂交信 号遍布于 整个 胚珠
第一节 基因表达研究技术
3. 原位杂交技术
❖ 荧光原位杂交（FISH）
❖ 首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记， 然后用原位杂 交法与靶染色体或DNA上特定 的序列结合，再通过与荧光 素分子相耦联的 单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上 的 位置。
2020/8/14
11
寡核苷酸 介导的 DNA 突变技 术
2020/8/14
12
重叠延伸介导的定点诱变
2020/8/14
13
大引物诱变法
第二节 基因敲除技术
1. 基本原理
❖ 经典遗传学（Forward genetics）是从一 个突变体的表型 出发，研究其基因型，进而 找出该基因的编码序列。
❖ 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传 学）首先从基 因序列出发，推测其表现
❖ T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最 为广泛的基 因敲除手段。
❖ 利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报 告基因的 DNA序列整合到基因组DNA上，如 果这段DNA插入到目 的基因内部或附近，就 会影响该基因的表达，从而使该 基因“失 活”。
❖ LongSAGE技术。标签来自转录物3’端一段21bp的序列， 可 以进行快速分析并与基因组序列数据相匹 配。其原理与 ShortSAGE方法类似，只是 用了不同的IIS类标签酶（ MmeI），并将程 序做了相应修改。
分子生物学(全套课件557P)
分子生物学（全套课件557P）简介分子生物学是研究生物分子结构、功能和相互作用的学科。
它涉及到核酸、蛋白质和其他生物分子的研究，以及它们在细胞和生物体中的功能。
本文档是一套全面的分子生物学课件，共有557页。
本课件旨在帮助读者系统地了解分子生物学的各个方面，包括基本的分子生物学原理、实验技术、研究方法以及应用等。
目录1.第一章：分子生物学概述2.第二章：DNA结构与功能3.第三章：RNA结构与功能4.第四章：蛋白质结构与功能5.第五章：基因表达调控6.第六章：基因突变与遗传变异7.第七章：分子生物学实验技术8.第八章：分子生物学研究方法9.第九章：分子生物学的应用领域第一章：分子生物学概述1.1 什么是分子生物学分子生物学是研究生物体内分子的结构、功能以及相互作用的学科。
它涉及到DNA、RNA、蛋白质等生物分子的研究，以及它们在细胞和生物体中的功能。
1.2 分子生物学的历史与发展分子生物学起源于20世纪50年代，当时发现DNA是物质遗传信息的携带者后，科学家们开始研究DNA的结构和功能，从而奠定了现代分子生物学的基础。
1.3 分子生物学的重要性分子生物学的研究对于了解生命的本质和机理至关重要。
它不仅有助于解释遗传现象，还可以揭示细胞的结构、功能和调控机制，甚至为疾病的诊断和治疗提供理论基础。
2.1 DNA的组成与结构DNA是由基因序列组成的生物分子，它由核苷酸组成。
本节将介绍DNA的基本结构、双螺旋结构和碱基对的配对方式。
2.2 DNA复制与遗传信息传递DNA复制是细胞分裂过程中最重要的事件之一，它确保了遗传信息的传递和稳定性。
本节将介绍DNA复制的过程和机制。
2.3 DNA修复与突变DNA在生物体内容易受到各种外界因素的损伤，因此细胞拥有多种修复机制来修复DNA损伤。
本节将介绍DNA修复的方式和维护基因组稳定性的重要性。
3.1 RNA的种类与功能RNA是DNA转录的产物，它在细胞内发挥着多种功能，包括mRNA的编码信息传递、tRNA的氨基酸运载和rRNA的构建核糖体等。
2024版《现代分子生物学》朱玉贤第五版北大课件
翻译后加工
新生肽链经过加工修饰，如剪切、 折叠、修饰等，成为具有生物活性 的蛋白质。
20
蛋白质翻译后加工修饰类型举例
2024/1/28
N-端fMet或Met的切除
新生肽链N-端的甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸通常被切 除。
二硫键的形成
半胱氨酸残基之间可以形成二硫键，对蛋白质的稳 定性和活性有重要作用。
化学修饰
生物工程
表观遗传学机制可以影响细胞的分化和发育，因此通过表观遗传学手段来改造细胞或生物体可能成为一种新 的生物工程技术。例如，利用表观遗传学手段来实现细胞重编程和再生医学应用。
26
06
现代分子生物学技术应用与 发展趋势
2024/1/28
27
DNA测序技术原理及应用领域拓展
DNA测序技术原理
通过特定的生物化学方法，将 DNA片段化并逐一测定其碱基序 列，从而获得完整的基因序列信
组修复等。
DNA损伤修复对于维持细胞基 因组稳定性和防止突变具有重要
意义。
2024/1/28
11
基因突变与遗传多样性
基因突变是指DNA序列中碱基的替换、 插入或缺失。
基因突变是生物进化的原材料，对于 生物适应环境和进化具有重要意义。
2024/1/28
基因突变可以产生新的等位基因，增 加遗传多样性。
序列比对与注释
01
利用生物信息学方法对基因序列进行比对和注释，揭示基因功
能和进化关系。
基因表达谱分析
02
通过高通量测序技术，研究基因在不同条件下的表达谱变化，
解析基因调控网络。
蛋白质结构与功能预测
03
利用生物信息学方法预测蛋白质的三维结构和功能，为药物设
计和蛋白质工程提供理论支持。
新生肽链经过加工修饰，如剪切、 折叠、修饰等，成为具有生物活性 的蛋白质。
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蛋白质翻译后加工修饰类型举例
2024/1/28
N-端fMet或Met的切除
新生肽链N-端的甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸通常被切 除。
二硫键的形成
半胱氨酸残基之间可以形成二硫键，对蛋白质的稳 定性和活性有重要作用。
化学修饰
生物工程
表观遗传学机制可以影响细胞的分化和发育，因此通过表观遗传学手段来改造细胞或生物体可能成为一种新 的生物工程技术。例如，利用表观遗传学手段来实现细胞重编程和再生医学应用。
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06
现代分子生物学技术应用与 发展趋势
2024/1/28
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DNA测序技术原理及应用领域拓展
DNA测序技术原理
通过特定的生物化学方法，将 DNA片段化并逐一测定其碱基序 列，从而获得完整的基因序列信
组修复等。
DNA损伤修复对于维持细胞基 因组稳定性和防止突变具有重要
意义。
2024/1/28
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基因突变与遗传多样性
基因突变是指DNA序列中碱基的替换、 插入或缺失。
基因突变是生物进化的原材料，对于 生物适应环境和进化具有重要意义。
2024/1/28
基因突变可以产生新的等位基因，增 加遗传多样性。
序列比对与注释
01
利用生物信息学方法对基因序列进行比对和注释，揭示基因功
能和进化关系。
基因表达谱分析
02
通过高通量测序技术，研究基因在不同条件下的表达谱变化，
解析基因调控网络。
蛋白质结构与功能预测
03
利用生物信息学方法预测蛋白质的三维结构和功能，为药物设
计和蛋白质工程提供理论支持。
现代分子生物学课件
DNA聚合酶
▪ DNA分子切割
限制性内切酶
▪ DNA片段与载体连接
DNA连接酶
▪ DNA凝胶电泳
▪ 细胞转化及重组子的筛选与鉴定等
2020/12/8
16
分子生物学的研究内容
DNA重组技术
三大基本工具: ➢ “分子手术刀” 限制性核酸内切酶 ➢ “分子缝合针” DNA连接酶 ➢ “分子运输车” 基因进入受体细胞的载体
（4）基因组、功基因组与生物信息学研究
基因组（genome): 生物有机体的单倍体细胞中的所有DNA，包括
核中的染色体DNA和线粒体、叶绿体等亚细胞器中 的DNA。
P. 456
2020/12/8
24
分子生物学的研究内容 基因组、功能基因组与生物信息学研究
基因组计划: 测定基因组序列。
- 人类基因组计划 目的是揭开人类所有的遗传结构, 包括所有的基因(尤其是与疾病相关的基因)和基因外 序列的结构。1990年-2001年，美、英、法、德、 日、中 6 国的合作已完成人类基因的全部序列测定工 作。见表2-1, P. 19. - 小家鼠、果蝇、线虫、拟南芥、水稻、啤酒酵母，以 及多种真菌、细菌的基因组研究相继展开，其中拟南 芥基因组的全序列测定已完成。
结构分子生物学
结构分子生物学就是研究生物大分子特定的空间结 构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。
主要包括三个研究方向： ✓ 结构的测定 采用X射线衍射、二维或多维核磁共振等方法 ✓ 结构运动变化规律的探索 ✓ 结构与功能相互关系的建立
2020/12/8
23
分子生物学的研究内容 基因组、功能基因组与生物信息学研究
(3.2 108bp)。 ➢2001年, 完成人类基因组全序列测定(3.5 109bp)。
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AAAAAA TTTTTT
锚 定 酶 （ 设 为 Nla)酶 切 ， 磁 珠 吸 附
AAAAAA TTTTTT
分 成 两 池 ， 加 入 接 头 A， B
AAAAAA TTTTTT
AAAAAA TБайду номын сангаасTTTT
标签酶酶切，释放标签，末端补平
B
CATG GTAC
平端连接
CATG GTAC
B
PCR扩 增 ， 锚 定 酶 酶 切
6.1.1 基因表达系列分析技术
基因表达系列分析技术（SAGE）是一种 以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达 模式的技术。
SAGE的操作过程如下图或书中图6-1所示。
CATG GTAC
A
CATG GTAC
B
CATG GTAC
A
CATG GTAC
A
CATG GTAC
CATG
CATG GTAC
mRNA 生 物 素 酰 化 的 Oligo-dT引 导 合 成 cDNA双 链
策略与步骤
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
6.3.1 酵母单杂交系统(yeast one-hybrid system)
20世纪90年代发展，用于研究蛋白质—DNA相 互作用。在酵母细胞内研究真核生
用途：研究DNA-蛋白质之间的相互作用， 筛选转录调控因子。
第六章 分子生物学研究法（下）
——基因功能研究技术
本章主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技 术和方法，比如通过这些方法研究：
（1）单个或多个基因在生物体的某些特定发育阶 段或在不同环境下的表达模式；
（2）某基因缺失后生物体表型变化分析该基因 功能；
（3）蛋白质相互作用认识信号转导通路等。
6.1 基因表达研究技术
6.1.4 基因定点突变技术
基因定点突变技术常用于研究某个（些） 氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结 合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元 件特征序列，修饰表达载体，引入新的酶切位 点等。
主要采用PCR法：重叠延伸技术和大引物诱变 法。
6.2 基因敲除技术
6.2.1 基本原理
*经典遗传学：从表型出发，研究基因型。 *现代遗传学：从基因序列出发，推测表型， 从而推导出该基因功能。
图6-15 酵母单杂交的基因原理示意图
6.3.2 酵母双杂交系统
酵母双杂技术主要用于研究蛋白质之间的 相互作用。
酵母双杂系统利用了真核生物转录调控因 子的组件式结构特征：DNA结合结构域；转录 激活结构域。
酵母双杂原理示意图：图6-17。
GTAC 连接，形成多联体
CATG GTAC
克隆，测序
计算机数据分析
6.1.2 RNA的选择性剪接技术
RNA选择性剪接是指用不同的剪接方式从一 个mRNA前体产生不同的mRNA剪接体的过程。
选择性剪接一般分为：平衡剪接，5’ 选择性剪接， 3’选项择性剪接，外显子遗漏和相互排斥实现
真核生物的转录因子大多是由两个结构 上分开、功能上独立的结构域组成的。如 GAL4的N端1-147aa是DNA结合域（BD）， 其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般 情况下，BD能与GAL4效应基因启动子上游 的 特 定 DNA 区 段 （ UAS ） 相 结 合 ， AD 则 推 动了转录起始。
特点：可识别稳定。
原理：
将已知的特定顺式作用元件构建到带 有报告基因最基本启动子(pmin)的上游， 然后编码待测转录因子cDNA与已知酵母 转录激活结构域(AD)融合表达载体导入酵 母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用 元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报 告基因得到表达。
激光共聚焦观察DsRed2和GFP在转染细胞的分布
6.1.3 原位杂交技术
原位杂交是用标记的核酸探针，经过放射 自显影或放射检测体系，在组织、细胞、间期 核及染色体上对核酸进行定位和相对定量的一 种方法。
RNA原位杂交：在mRNA水平上，用标记 的探针与固定的组织切片反应后进行显色反应， 从而对该基因的表达进行定性定量分析。
基因敲除：又称为基因打靶，该技术通过外源 DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确 的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色 体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
1、完全基因敲除
完全基因敲除：通过同源重组法完全消除细胞 或动物个体中的靶基因活性。
一般采用取代型或插入型载体在ES细胞中根据 正负双向选择原理进行完全基因敲除。
荧光原位杂交（FISH）
荧 光 原 位 杂 交 (fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世纪80年代末在放 射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非 放射性分子细胞遗传技术。FISH的基本原理是 首先对寡核苷酸探针进行特殊的修饰和标记， 然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的 序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克 隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。
发现新的可变剪接体（splice variant），确 定每个异构体（isoform）的独特功能和生物学意 义并阐明其调节机制，是功能基因组时代的一个 重要特征。
BTLAs（BTLA splice variant）
BTLA剪接体基因的结构分析 RT-PCR法克隆人BTLA编码区基因电泳结果
BTLAs编码的异构体蛋白BTLAi序列分析及其预测
异构体BTLAi（BTLA isoform）的氨基酸序列比对及其结构分析
BTLAi和BTLA跨膜预测
BTLA和BTLAi的跨膜螺旋段预测结果
A: BTLAi; B: BTLA
融合蛋白BTLAs-DsRed2和BTLAs-DsRed2的 在转染细胞膜上表达的检测
图3.5 流式细胞术检测HVEM-Fc融合蛋白和单抗MIH26与基因转染细胞结合的结果
图6-9；图6-10。
2、条件型基因敲除
条件型基因敲除：通过定位重组系统实现特定 时间和空间的基因敲除。
对有重要生理功能的基因，完全基因敲除使有 关基因功能的研究无法开展。
Cre/LoxP和FLP/FRT系统，具有可调节性。 图6-11。
图6-11 条件型基因敲除策略
图6-12 基因敲除 的主要技术
锚 定 酶 （ 设 为 Nla)酶 切 ， 磁 珠 吸 附
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分 成 两 池 ， 加 入 接 头 A， B
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标签酶酶切，释放标签，末端补平
B
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平端连接
CATG GTAC
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PCR扩 增 ， 锚 定 酶 酶 切
6.1.1 基因表达系列分析技术
基因表达系列分析技术（SAGE）是一种 以DNA序列测定为基础定量分析全基因组表达 模式的技术。
SAGE的操作过程如下图或书中图6-1所示。
CATG GTAC
A
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CATG GTAC
CATG
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mRNA 生 物 素 酰 化 的 Oligo-dT引 导 合 成 cDNA双 链
策略与步骤
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
6.3.1 酵母单杂交系统(yeast one-hybrid system)
20世纪90年代发展，用于研究蛋白质—DNA相 互作用。在酵母细胞内研究真核生
用途：研究DNA-蛋白质之间的相互作用， 筛选转录调控因子。
第六章 分子生物学研究法（下）
——基因功能研究技术
本章主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技 术和方法，比如通过这些方法研究：
（1）单个或多个基因在生物体的某些特定发育阶 段或在不同环境下的表达模式；
（2）某基因缺失后生物体表型变化分析该基因 功能；
（3）蛋白质相互作用认识信号转导通路等。
6.1 基因表达研究技术
6.1.4 基因定点突变技术
基因定点突变技术常用于研究某个（些） 氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结 合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元 件特征序列，修饰表达载体，引入新的酶切位 点等。
主要采用PCR法：重叠延伸技术和大引物诱变 法。
6.2 基因敲除技术
6.2.1 基本原理
*经典遗传学：从表型出发，研究基因型。 *现代遗传学：从基因序列出发，推测表型， 从而推导出该基因功能。
图6-15 酵母单杂交的基因原理示意图
6.3.2 酵母双杂交系统
酵母双杂技术主要用于研究蛋白质之间的 相互作用。
酵母双杂系统利用了真核生物转录调控因 子的组件式结构特征：DNA结合结构域；转录 激活结构域。
酵母双杂原理示意图：图6-17。
GTAC 连接，形成多联体
CATG GTAC
克隆，测序
计算机数据分析
6.1.2 RNA的选择性剪接技术
RNA选择性剪接是指用不同的剪接方式从一 个mRNA前体产生不同的mRNA剪接体的过程。
选择性剪接一般分为：平衡剪接，5’ 选择性剪接， 3’选项择性剪接，外显子遗漏和相互排斥实现
真核生物的转录因子大多是由两个结构 上分开、功能上独立的结构域组成的。如 GAL4的N端1-147aa是DNA结合域（BD）， 其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般 情况下，BD能与GAL4效应基因启动子上游 的 特 定 DNA 区 段 （ UAS ） 相 结 合 ， AD 则 推 动了转录起始。
特点：可识别稳定。
原理：
将已知的特定顺式作用元件构建到带 有报告基因最基本启动子(pmin)的上游， 然后编码待测转录因子cDNA与已知酵母 转录激活结构域(AD)融合表达载体导入酵 母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用 元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报 告基因得到表达。
激光共聚焦观察DsRed2和GFP在转染细胞的分布
6.1.3 原位杂交技术
原位杂交是用标记的核酸探针，经过放射 自显影或放射检测体系，在组织、细胞、间期 核及染色体上对核酸进行定位和相对定量的一 种方法。
RNA原位杂交：在mRNA水平上，用标记 的探针与固定的组织切片反应后进行显色反应， 从而对该基因的表达进行定性定量分析。
基因敲除：又称为基因打靶，该技术通过外源 DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确 的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色 体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
1、完全基因敲除
完全基因敲除：通过同源重组法完全消除细胞 或动物个体中的靶基因活性。
一般采用取代型或插入型载体在ES细胞中根据 正负双向选择原理进行完全基因敲除。
荧光原位杂交（FISH）
荧 光 原 位 杂 交 (fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世纪80年代末在放 射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非 放射性分子细胞遗传技术。FISH的基本原理是 首先对寡核苷酸探针进行特殊的修饰和标记， 然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的 序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克 隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。
发现新的可变剪接体（splice variant），确 定每个异构体（isoform）的独特功能和生物学意 义并阐明其调节机制，是功能基因组时代的一个 重要特征。
BTLAs（BTLA splice variant）
BTLA剪接体基因的结构分析 RT-PCR法克隆人BTLA编码区基因电泳结果
BTLAs编码的异构体蛋白BTLAi序列分析及其预测
异构体BTLAi（BTLA isoform）的氨基酸序列比对及其结构分析
BTLAi和BTLA跨膜预测
BTLA和BTLAi的跨膜螺旋段预测结果
A: BTLAi; B: BTLA
融合蛋白BTLAs-DsRed2和BTLAs-DsRed2的 在转染细胞膜上表达的检测
图3.5 流式细胞术检测HVEM-Fc融合蛋白和单抗MIH26与基因转染细胞结合的结果
图6-9；图6-10。
2、条件型基因敲除
条件型基因敲除：通过定位重组系统实现特定 时间和空间的基因敲除。
对有重要生理功能的基因，完全基因敲除使有 关基因功能的研究无法开展。
Cre/LoxP和FLP/FRT系统，具有可调节性。 图6-11。
图6-11 条件型基因敲除策略
图6-12 基因敲除 的主要技术