亲和层析纯化重组蛋白
重组蛋白生产的工艺设计
重组蛋白生产的工艺设计
重组蛋白的生产工艺设计是一个复杂的过程，需要考虑到多个因素，例如表达系统的选择、蛋白纯化的方法、工作条件以及产品质量控制等。
以下是一个常见的重组蛋白生产工艺设计的步骤：
1. 基因克隆：首先，选择一个适当的表达宿主系统，例如大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞。
然后，将目标蛋白的基因克隆到表达载体中，这个载体通常包含启动子、选择性抗生素标记以及其他必要元件。
2. 表达和培养：将表达载体导入宿主细胞中，并通过培养条件使其表达目标蛋白。
对于大肠杆菌或酵母表达系统，培养通常在摇瓶或发酵罐中进行；对于哺乳动物细胞表达系统，通常需要采用培养皿或生物反应器。
3. 收获和破碎：当目标蛋白在培养过程中达到一定的表达水平后，培养液被收获并通过离心或其他方法分离细胞。
然后，使用适当的方法（例如超声波、高压或化学方法）将细胞破碎，以释放目标蛋白。
4. 蛋白纯化：破碎的细胞溶液包含大量的非目标蛋白质和其他杂质，需要通过蛋白纯化步骤进行分离和纯化。
常用的蛋白纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤和透析等。
5. 产品质量控制：对于重组蛋白的生产，产品质量控制是非常重要的。
常见的
质量控制测试包括目标蛋白的纯度、活性、空载体和副产物的水平、杂质的水平以及生物活性的测试等。
这些测试可以通过各种分析方法进行，例如SDS-PAGE、Western blot、ELISA等。
总结来说，重组蛋白的生产工艺设计包括基因克隆、表达和培养、收获和破碎、蛋白纯化以及产品质量控制等环节。
这些步骤需要根据目标蛋白的特性和生产要求进行定制化设计，以达到高产和高纯度的重组蛋白产量。
细菌的重组蛋白质表达系统
细菌的重组蛋白质表达系统蛋白质是构成生物体及细胞的重要组成部分，也是细胞功能的核心执行者。
为了研究和应用不同类型的蛋白质，科学家发展出了各种蛋白质表达系统。
其中，细菌的重组蛋白质表达系统是最常用的一种方法之一。
本文将详细介绍细菌重组蛋白质表达系统的原理、优势和应用。
一、原理细菌重组蛋白质表达系统利用细菌作为宿主来表达外源蛋白质。
这个系统主要包括以下几个重要组成部分：表达载体、宿主菌株、诱导系统和纯化方法。
1. 表达载体表达载体是指带有外源蛋白质编码序列的质粒。
这些质粒通常包括启动子、反义密码子和终止子等参与蛋白质表达的元件。
其中，启动子通过结合转录因子来启动蛋白质合成的过程。
反义密码子则能够增强蛋白质的长效稳定性，并促进其在细菌中的高效表达。
2. 宿主菌株宿主菌株在蛋白质表达系统中起到重要的作用，通常选择大肠杆菌作为宿主，主要因为大肠杆菌具有较高的生长速度、易于培养和常用的遗传工具。
此外，大肠杆菌本身产生的内切酶活性较低，有利于保护外源蛋白质的稳定性。
3. 诱导系统诱导系统是细菌重组蛋白质表达系统中的一个重要组成部分。
通常使用化学诱导或者温度诱导来启动表达载体中蛋白质编码序列的转录和翻译。
化学诱导通常通过添加一种诱导剂，如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），来激活载体中的启动子。
温度诱导则是通过改变培养温度来调节蛋白质表达。
4. 纯化方法纯化是细菌重组蛋白质表达系统中最关键的环节之一。
常用的纯化方法包括亲和纯化、碳水化合物基负载层析和凝胶过滤等。
这些方法能够根据蛋白质的特性和亲和性实现高效纯化。
二、优势与其他蛋白质表达系统相比，细菌重组蛋白质表达系统具有以下优势：1. 高效性细菌重组蛋白质表达系统是目前各种表达系统中最高效的一种方法之一。
通过优化表达条件和使用高效的诱导系统，可以实现高产量的蛋白质表达。
此外，细菌本身的生长速度也有助于高效表达。
2. 便捷性相比其他表达系统，细菌重组蛋白质表达系统的操作更为简便。
第7章亲和层析
结合能力的测定
06.05.2021
用溴化氰活化载体
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四、特异性吸附
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时， 配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲 和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的 复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影 响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有关。
物大分子之间的亲和力。
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专一性结合的生物体系
常用配体
分离对象
酶蛋白
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等
抗体
抗原、病毒、细胞
外源凝集素 核酸 激素及维生素
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白
互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
细胞
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利用生物大分 子和固定相表面 存在某种特异性 吸附而进行选择 性分离的一种生 物大分子分离的 层析方法。
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海南大学农学院wss7
亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一 般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激 素等）组成固定相, 配体高选择地吸附与其有生物特性 的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析 柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。
亲和层析应用
一、纯化特异性生物分子
1.纯化抗原、抗体及其结合物； 2.分离糖蛋白、各种凝集素； 3.含巯基蛋白质的分离； 4.用寡聚核苷酸分离核酸； 5.凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。
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镍柱亲和层析
镍柱亲和层析1. 什么是镍柱亲和层析？镍柱亲和层析是一种分离和纯化蛋白质的技术方法。
通过利用镍离子和组织特异性传感器结合矩阵的亲和性，目标蛋白质可以被高效地捕获和分离。
2. 镍柱亲和层析的原理镍柱亲和层析的原理基于镍离子与组织特异性传感器结合矩阵的亲和性。
通常使用一种名为Ni-NTA的亲和树脂，其中镍离子与某些氨基酸残基（例如组氨酸，组氨酸是蛋白质中可以与金属离子结合的常见残基）具有高度的亲和力。
将该亲和树脂充填在柱子中，然后将混合物（通常是细胞裂解液或纯化液）通过柱子进行分离和纯化。
3. 镍柱亲和层析的步骤镍柱亲和层析通常包括以下步骤：3.1 树脂的准备将亲和树脂（例如Ni-NTA树脂）洗净并充填到柱子中。
在使用之前，需要以适当的缓冲液洗涤和平衡树脂。
3.2 样品的制备将要进行分离和纯化的蛋白质样品进行处理和制备。
通常，这包括细胞的裂解和去除杂质。
3.3 样品的加载将处理好的样品溶液加载到柱子中。
样品中的目标蛋白质与镍离子结合并与亲和树脂发生相互作用。
3.4 洗脱目标蛋白质通过用含有一定浓度的络合剂（例如组氨酸）的缓冲液进行洗脱，使目标蛋白质从柱子上洗脱下来。
3.5 验证纯化蛋白质对洗脱得到的蛋白质样品进行验证，通常通过SDS-PAGE凝胶电泳或其他定量方法进行。
3.6 进一步纯化（可选）如果需要进一步纯化目标蛋白质，可以使用其他的层析方法或技术进行。
4. 镍柱亲和层析的应用镍柱亲和层析是常用的蛋白质分离和纯化方法，被广泛应用于生物医学、生物技术和生命科学研究领域。
4.1 重组蛋白的纯化镍柱亲和层析在重组蛋白的纯化中具有重要作用。
许多重组蛋白在表达系统中被融合到带有镍结合标签的载体上，通过镍柱亲和层析可以高效地纯化目标蛋白质。
4.2 酶的纯化许多酶也可以通过镍柱亲和层析进行纯化。
例如，组氨酸残基在许多酶中较为常见，可以与镍离子结合，从而实现酶的有效纯化。
4.3 蛋白质结构研究在蛋白质结构研究中，镍柱亲和层析可用于纯化特定蛋白质或蛋白质复合物，以获取足够纯净的样品进行晶体学和其他结构分析方法。
抗原亲和层析
抗原亲和层析抗原亲和层析（Antigen Affinity Chromatography）引言：抗原亲和层析是一种基于抗原-抗体相互作用原理的层析技术，广泛应用于生物制药领域中的蛋白质纯化过程。
本文将介绍抗原亲和层析的原理、操作步骤以及其在蛋白质纯化中的应用。
一、原理抗原亲和层析是利用抗原与特异性抗体之间的高亲和力进行蛋白质纯化的技术。
在此技术中，抗原通常是目标蛋白质，特异性抗体则通过共价或非共价结合于纯化介质上，如琼脂糖或磁珠。
当混合物经过纯化介质时，目标蛋白质与特异性抗体发生特异性结合，而非目标蛋白质则被洗脱。
最终，目标蛋白质通过改变条件（如改变pH 或离子强度）或添加竞争性抗原来解离与特异性抗体的结合。
二、操作步骤1. 制备特异性抗体固定化纯化介质：将特异性抗体固定于纯化介质上，常用的固定化方法包括共价键结合、亲和键结合和离子键结合等。
2. 样品处理：对待纯化的混合物进行预处理，如去除细胞碎片、离心沉淀等。
3. 样品加载：将样品溶液加载到预处理后的纯化介质上，使目标蛋白质与特异性抗体结合。
4. 洗脱非特异性结合物：通过洗脱缓冲液，去除与纯化介质非特异性结合的蛋白质。
5. 解离目标蛋白质与特异性抗体结合：通过改变条件（如改变pH 或离子强度）或添加竞争性抗原来解离目标蛋白质与特异性抗体的结合。
6. 收集目标蛋白质：将目标蛋白质从洗脱液中收集。
三、应用抗原亲和层析在蛋白质纯化中具有广泛的应用。
以下列举几个常见的应用领域：1. 生物药物研发：抗原亲和层析用于纯化重组蛋白、单克隆抗体等生物药物。
通过选择适当的特异性抗体，可以高效地纯化目标蛋白质并去除杂质。
2. 诊断试剂制备：抗原亲和层析常用于制备用于临床诊断的试剂盒。
例如，通过将特异性抗体固定于纯化介质上，可以高效地捕获临床样本中的特定抗原。
3. 生物学研究：抗原亲和层析在生物学研究中也得到了广泛应用。
例如，可以利用特异性抗体纯化相互作用蛋白复合物，从而研究蛋白质相互作用网络。
亲和层析
样品制备
样品浓度
尽量适度，即有利于充分交换，又节省操作时间
样品组成
离子组成尽量与上样缓冲液相同，如果不同，可以 通过过滤、脱盐或者透析更换。
层析柱的规格
装柱体积适于蛋白的样品量 5-40% 可用载样量 柱长 5-10 cm
Short, fat
洗涤
样品吸附上柱后，要用几倍起始缓冲液的体 积过柱洗去杂质，可以适当增加离子强度洗 去静电吸附的非特异性结合物。当OD280吸光 值回到基线时，停止洗涤。
洗脱液中含量较少
1、咪唑浓度低 2、降低pH洗脱（低于pH3.5以下，离子会有大量脱落） 3、+4 °C洗脱过夜
优化条件
1、起始缓冲液中加入咪唑，如20mM，以减少杂蛋白。 2、线性洗脱，探索纯度高的洗脱梯度。 3、使用其他离子，如Zn（吸附较弱）或Cu（吸附较强）等
亲和层析的应用? 亲和层析的应用
声前加融菌酶） 2、柱子平衡液以及样品缓冲液中没有EDTA、DTT等 使用过的柱，是否已经再生。 3、降低起始缓冲液中咪唑的浓度有利于融合蛋白的吸 附 4、是否过载，chelating sepharose 大约12mg/ml。 5、融合蛋白可能是包涵体表达，破菌上清不含融合蛋 白 6、Ni离子是否已经鳌和好了。
Protocols for cleaning-in-place (CIP), 清洁和灭菌
去除沉淀蛋白 4个柱体积的0.5-1.0 M NaOH ，线性流速40 cm/h ，然后使用水清洗2-3 个柱体积 。 去除强结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂类 4-10 个柱床体积的70% ethanol 或30% isopropanol ，然后使用3-4个柱 体积或1-2个柱体积的0.5% non-ionic detergent (e.g. in 1 M acetic acid) ， 然后使用5个柱体积的70% ethanol 去除去污剂，最后3-4个柱体积的水。 清洁 0.5-1.0 M NaOH 接触时间 30-60min. 灭菌 高压介质 121 °C 15 min.
重组结核杆菌融合蛋白的使用方法
重组结核杆菌融合蛋白的使用方法一、引言重组蛋白技术是现代生物技术领域的重要研究方向之一。
其中，重组结核杆菌融合蛋白作为一种新型的免疫原，具有广泛的应用前景。
本文旨在介绍重组结核杆菌融合蛋白的制备方法以及其在临床和实验室中的应用。
二、制备重组结核杆菌融合蛋白1. 基因克隆首先，需要将目标基因克隆到表达载体中。
常用的表达载体有pET等。
将目标基因PCR扩增后与表达载体进行连接，并经过酶切和连接等步骤构建成完整的表达载体。
2. 转染细胞将构建好的表达载体转染到宿主细胞（如大肠杆菌）中，使其能够产生目标蛋白。
3. 蛋白纯化通过离心、超滤等步骤，将含有目标蛋白的细胞裂解液进行初步分离。
接下来，可采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对目标蛋白进行纯化。
4. 鉴定通过SDS-PAGE、Western blot等方法对目标蛋白进行鉴定，确保其纯度和活性。
三、重组结核杆菌融合蛋白的应用1. 临床应用重组结核杆菌融合蛋白可作为一种新型的免疫原，用于结核病的诊断和预防。
例如，在结核病的血清学检测中，可采用重组结核杆菌抗原作为诊断试剂。
此外，重组结核杆菌抗原还可用于疫苗开发。
2. 实验室应用在实验室中，重组结核杆菌抗原可作为一种重要的实验工具。
例如，在免疫学研究中，可采用重组结核杆菌抗原来激活T细胞，并进一步探究T细胞的功能。
此外，在药物筛选方面，还可以利用重组结核杆菌抗原来筛选可能的药物靶点。
四、使用注意事项1. 在制备过程中，应注意操作规范，避免交叉污染。
2. 在使用前应对制备的重组结核杆菌融合蛋白进行鉴定，确保其纯度和活性。
3. 在应用过程中，应注意实验条件的控制，避免影响结果的准确性。
五、总结重组结核杆菌融合蛋白是一种新型的免疫原，在临床和实验室中具有广泛的应用前景。
通过基因克隆、转染细胞、蛋白纯化等步骤，可以制备出高纯度的重组结核杆菌抗原。
在使用过程中，应注意操作规范和实验条件控制，以保证结果的准确性。
细胞培养法重组蛋白生产上下游工艺流程__概述及解释说明
细胞培养法重组蛋白生产上下游工艺流程概述及解释说明1. 引言1.1 概述细胞培养法重组蛋白生产是一种常用的生物技术手段，可以通过调控细胞代谢过程来大规模制造特定蛋白质。
这种技术在医药、农业、工业等领域都有广泛应用，为我们提供了丰富的蛋白质资源。
然而，在实际应用过程中，要保证高产量和纯度的蛋白质产出并不容易，因此需要建立完善的上下游工艺流程以及有效的控制策略。
1.2 文章结构本文将从引言开始，逐步深入介绍细胞培养法重组蛋白生产的上下游工艺流程及其相关要点。
首先，在第二节中，我们会详细讨论细胞培养步骤以及蛋白表达和分泌过程。
然后，在第三节中，我们会重点关注收获和破碎细胞的步骤以及蛋白纯化和精制过程。
接着，在第四节中，我们将讨论实施中可能遇到的挑战并提出解决方案。
最后，在第五节中，我们将总结重要观点、结果和发现，并给出未来的展望和建议。
1.3 目的本文的目的是为读者提供一份详尽且清晰的细胞培养法重组蛋白生产上下游工艺流程的概述以及相关解释说明。
通过深入了解每个步骤的原理和关键要点，读者将能够更好地理解这种生产方法，并在实际操作中拥有更高的成功率。
我们希望该文可以为相关领域的研究人员、工程师和学生提供有价值的参考，从而推动细胞培养法重组蛋白生产技术在各个领域的进一步应用和发展。
2. 细胞培养法重组蛋白生产上下游工艺流程2.1 细胞培养步骤：在细胞培养法中，重组蛋白的生产需要经历一系列的步骤。
首先，需要选择适合的宿主细胞进行培养。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌（E. coli）、哺乳动物细胞等。
然后，将目标基因导入宿主细胞中，并通过合适的启动子和调控元件来实现基因的表达。
接下来是对宿主细胞进行预处理，包括建立种子库、优化培养基和培养条件等。
种子库是为了确保有足够数量和活力的宿主细胞可供后续扩展使用。
针对不同类型的宿主细胞，对培养基成分和配方进行优化可以提高蛋白表达效率和产量。
在进入正式培养阶段之前还需要进行预培养步骤，以使得宿主细胞适应新的环境并增加生长速度。
谷胱甘肽亲和层析
谷胱甘肽亲和层析谷胱甘肽亲和层析（Glutathione Affinity Chromatography）引言：谷胱甘肽（Glutathione，简称GSH）是一种三肽，由谷氨酸（glutamic acid）、半胱氨酸（cysteine）和甘氨酸（glycine）组成。
作为重要的抗氧化剂和细胞内还原剂，谷胱甘肽在细胞内起着重要的生理功能。
谷胱甘肽亲和层析是一种常用的蛋白质纯化方法，利用谷胱甘肽与其结合的特异性，实现对目标蛋白的富集和纯化。
一、谷胱甘肽亲和层析原理谷胱甘肽亲和层析基于谷胱甘肽与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）之间的特异性结合。
GST是一种广泛存在于真核生物和原核生物中的酶，可催化谷胱甘肽与多种底物之间的转移反应。
利用GST与谷胱甘肽的结合特性，可以构建谷胱甘肽亲和层析柱，将GST标记的蛋白与目标蛋白结合，并通过洗脱步骤将目标蛋白从柱上洗脱得到纯化的目标蛋白。
1.构建谷胱甘肽亲和层析柱将GST基因克隆到表达载体中，并在其N-或C-末端加入适当的标签，如His标签或Flag标签，以便于后续的检测和纯化。
然后，将重组的GST融合蛋白表达于适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
细胞经诱导表达后，收获细胞并通过超声波破碎等方法裂解细胞获得细胞裂解液。
接下来，使用谷胱甘肽亲和树脂将目标蛋白与GST融合蛋白结合，通过洗脱步骤将目标蛋白从树脂上洗脱得到纯化的目标蛋白。
2.样品加载与洗脱将裂解液或其它蛋白样品加载到谷胱甘肽亲和层析柱中，目标蛋白与GST融合蛋白结合。
然后，使用洗脱缓冲液进行洗脱，去除非特异性结合的蛋白质。
最后，使用洗脱缓冲液中的高浓度谷胱甘肽竞争结合位点，将目标蛋白从树脂上洗脱得到纯化的目标蛋白。
3.纯化目标蛋白通过洗脱步骤，将目标蛋白从谷胱甘肽亲和层析柱上洗脱得到纯化的目标蛋白。
可以通过检测目标蛋白的光谱特性、活性测定或Western blot等方法确认目标蛋白的纯度和活性。
三、谷胱甘肽亲和层析的应用谷胱甘肽亲和层析广泛应用于蛋白质纯化领域，特别适用于GST标记的重组蛋白的纯化。
mabselect sure蛋白a亲和层析树脂
mabselect sure蛋白a亲和层析树脂"MabSelect Sure蛋白A亲和层析树脂——用于纯化单克隆抗体的效果和应用"引言：亲和层析是一种常用的蛋白质纯化方法，用于从复杂的混合物中富集目标蛋白。
蛋白A是一种来源于蓝链球菌的重组蛋白，具有较高的亲和力和选择性，尤其适用于单克隆抗体的纯化。
MabSelect Sure蛋白A亲和层析树脂是一种经充填、扩展和交联处理后的亲和层析介质，具有高的结合容量和效率。
本文将介绍MabSelect Sure蛋白A亲和层析树脂的原理、特点及其在单克隆抗体纯化中的应用。
第一部分：MabSelect Sure蛋白A亲和层析树脂的原理1. 树脂结构MabSelect Sure蛋白A亲和层析树脂是由高度压缩的纤维素基质与表面修饰的蛋白A亲和配体组成的。
树脂具有均匀的粒径分布和高度的中孔洞结构，有助于保持高通量纯化的速度和效率。
2. 蛋白A亲和层析原理蛋白A与免疫球蛋白G（IgG）和G绳霉素（IgM）等常见免疫球蛋白家族成员的Fc区域结合。
MabSelect Sure蛋白A亲和层析树脂通过静电作用和范德华力与Fc区域结合，实现目标蛋白的选择性富集。
第二部分：MabSelect Sure蛋白A亲和层析树脂的特点1. 高结合容量MabSelect Sure蛋白A亲和层析树脂具有高的结合容量，能够在保持有效富集效果的同时处理高浓度的样品。
这使得该树脂适用于大规模的单克隆抗体纯化。
2. 高选择性MabSelect Sure蛋白A亲和层析树脂能够高效地与IgG和IgM结合，而对其他蛋白质几乎不起作用。
这种高选择性可以减少非特异结合物的干扰，从而提高目标蛋白纯化的纯度。
3. 耐受广泛的工艺条件MabSelect Sure蛋白A亲和层析树脂可以耐受多种不同的工艺条件，包括不同的pH值、温度和盐浓度。
这使得其在复杂的制备工艺中的应用更加灵活可行。
第三部分：MabSelect Sure蛋白A亲和层析树脂在单克隆抗体纯化中的应用1. 预处理对于细胞培养上清液等复杂样品，可以使用前处理步骤，如超速离心、滤除悬浮固体等，以去除不需要的杂质物质。
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亲和层析纯化重组蛋白
【实验目的】
学习利用镍离子螯合树脂亲和纯化带有多聚组氨酸标签(His-tag)的重组蛋白。
【实验原理】
利用镍离子螯合树脂特异结合多聚组氨酸的特性,(Q往圣科技3452125268提供Science 的CRISPR/cas9免费送)若外源基因编码的目的蛋白在其N-末端或C-
末端融合了His-tag,则具有His-tag的重组蛋白可特异结合在镍离子树脂上而将
其纯化,经过低浓度咪唑溶液洗涤后,可用高浓度的咪唑溶液将重组蛋白从树脂上洗脱下来,纯化蛋白的纯度可用SDS-PAGE
法进行检测。
【器材与试剂】
1.实验仪器摇床,高速冷冻离心机,超声波细胞破碎仪,微量移液器,电泳仪,蛋白电泳槽
2.实验试剂蛋白胨,酵母提取物,NaCl,1 mol/L NaOH,氨苄青霉素钠,1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 0.1 mol/L NiCl2,镍离子螯合树脂(His.Bind Resin,美国Novagen公司),结合缓冲溶液:0.5 mol/L NaCl,5 mmol/L咪唑,20 mmol/L
Tris-Cl,pH8.0;洗涤缓冲液: 0.5 mol/L NaCl,60 mmol/L咪唑,20 m mol/L Tris-Cl,pH8.0;洗脱缓冲液:0.5 mol/L NaCl,0.5 mol/L咪唑,20 mmol/L Tris-
Cl,pH8.0;30%凝胶贮液:29% 丙烯酰胺,1% N,N-亚甲双丙烯酰胺;10% 十二烷基硫酸钠(SDS),N,N, N’,N’-四甲基乙烯二胺(TEMED), 10%过硫酸铵,标准分子量蛋
白,(Q往圣科技3452125268提供张峰Nature biotechnology的CRISPR/cas9免费)蛋白电泳缓冲溶液:25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸,0.1% SDS,pH8.3;1.5
mol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mol/L Tris-Cl(pH6.8),蛋白栽样缓冲液(2×):50
mmol/L Tris-Cl(pH6.8),100 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT),2% SDS, 10%甘油,0.1%溴酚蓝;染色液:0.2%考马斯亮蓝 R250,40%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸;脱色液:40%(v/v)甲醇,10%(v/v)乙酸
3.实验材料转化了pET-15bcrtE的E.coli BL21(DE3)(工程菌)
【实验步骤】(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)
1.取2 mL左右的树脂装入一小层析柱内,待凝胶沉淀且保护剂流净后,用10 mL蒸馏水冲洗凝胶,然后加入10 mL 0.1 mol/L NiCl2溶液,待其流干净后,用10 mL结合缓冲溶液平衡层析柱。
2.接种工程菌于20 mL含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基
中,37℃,振荡培养(250 r/min)过夜。
3.将过夜培养物转接到500 mL含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养
基中,37℃,振荡培养(250 r/min)3 h,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,继续培养
4h。
4. 培养物在4℃,5 000×g离心10 min,收集菌体。
5.菌体重新悬浮于冰冷的20 mL结合缓冲溶液中,冰浴条件下用超声波破碎细胞15次(800W,工作时间10 s,间隔时间60 s)。
6.细胞裂解液于4℃,12 000×g离心30 min,取上清液,保留50 μL以备电
泳分析。
7.将其余上清液加到层析柱内,让其自然流过层析介质。
8.先用10 mL结合缓冲液冲洗层析柱,再用8 mL洗涤缓冲液洗涤层析柱。
9.用4 mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白,收集洗脱液。
10.分别取10 μL细胞裂解液、洗脱液与10 μL蛋白载样缓冲液(2×)混合,煮沸5 min, SDS-PAGE分析,观察纯化效果。
【注意事项】(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装。
)层析过程中所使用的溶液不应含有EDTA、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇等能敖合金属离子的试剂,以免将树脂上的Ni2+洗掉,导致无法纯化出蛋白。