A重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则-Biotechn
蛋白质纯化知识详解
蛋白质纯化知识详解一、蛋白纯化原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。
蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。
一般蛋白纯化采用的方法为树脂法。
粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽，并可以迅速将蛋白与污染物分开，必要时可加入相应的保护剂（例如蛋白酶抑制剂），防止目的蛋白被降解。
精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。
选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。
仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。
二、纯化程序分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。
1、前处理分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。
为此，动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。
然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。
动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。
植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。
细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。
第八章 重组蛋白的分离与纯化-修改
fusion protein
IMAC
Purification of Trx-PLA2-9 fusion protein
Purified protein
Functional expression and characterization of a recombinant phospholipase A2 from sea snake Lapemis hardwickii as a soluble protein in E. coli. Toxicon 41 (2003) 713–721
为人们克隆与表达外源基因的首选。
但在外源基因的表达过程中，常常会遇到表达效率不高和 产率较低等困难。以往的研究表明，影响外源基因表达效率 的因素主要有密码子的选用、目的基因的量、载体的选择、
宿主菌的培养控制等。
大肠杆菌基因表达载体
1 启动子的强度
诱导型启动子： 原核生物启动子 组成型启动子：
启动子的分离
Purification of the soluble fusion protein and mature rPLA2-9. (A) Affinity chromatography of the bacterial cell lysates in a Ni2+-chelating sepharose column. (Flow rate 5 ml/min): 1, flow-through peak; 2, eluted peak of 50 mM Tris (pH 7.0), 500 mM NaCl, 150 mMimidazole; 3, eluted peak of 50 mM Tris (pH 7.0), 500 mM NaCl, 400 mM imidazole. (B) DEAE-sepharose chromatography of the fusionprotein resulted from affinity chromatography. (Flow rate 4 ml/min): 4, flow-through peak with 50 mM Tris (pH 8.0), 100 mM NaCl; 5, eluted peak of 50 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl. (C) DEAE-sepharose chromatography of the fusion protein after EK cleavage. (Flow rate 3 ml/min): 6, flow-through peak (purified rPLA2-9); 7, eluted peak of 50 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl. The three selected fractions were indicated by arrows.
重组蛋白药物纯化与质量控制
Contents
1 2
蛋白纯化原则与方法 蛋白质量控制方法
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蛋白纯化原则
基因重组 技术
生化分离 技术
免疫检测 技术
现代生物 技术
给人类带来了抗体和药物。
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蛋白纯化原则
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蛋白纯化原则 Guidelines for Protein Purification • • • 确定目标 – purity, quantity, biological activity, economy 充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性 – to simplify technique selection and optimisation 确定活性测定方法 – fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants 尽量减少纯化步骤 – extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically
Resolutio n
Spee d Recover y
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Capacit y
纯化流程
一般生产纯化不超过4个步 骤。
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分离纯化机制
不同的大小和尺寸 带电基团 疏水基团 极性不同 相互作用
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分离纯化机制
不同层析介质的成本：离子交换，金属螯合，疏水层析，分子筛，亲和层析
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纯化总结
用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）
中未知抗体或抗原的方法。 优点：快速、灵敏、定性、定量、定位，是目 前应用最广泛的免疫学检测技术。
(生物化学)蛋白质分离纯化技术
蛋白质分离纯化技术摘要：蛋白质分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键之一。
本文分析了蛋白质分离纯化的特点及一般原则；综述了蛋白质分离纯化的传统技术：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水作用层析、高效液相色谱层析(HPLC)、电泳法等及新型技术：亲和超滤、内含肽介导的蛋白质亲和纯化。
关键词：蛋白质分离纯化蛋白质是生命的物质基础,是生命活动的最终控制者和直接执行者,它参与生物体内几乎所有的生命活动过程,如生长、发育、遗传、代谢、应激、能量转换、信号传导等。
以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向。
对蛋白质进行纯化，得到高纯度的"高活性的蛋白质是生物学科研人员经常要面对的问题。
蛋白质的分离纯化主要包括4个步骤：预处理、蛋白质的抽提、蛋白质的粗分级和蛋白质的分离纯化[1]。
本文针对近年来有关蛋白质的分离纯化技术所取得的进展进行了综述,为今后的理论和应用研究提供依据。
1 蛋白质分离纯化的特点及一般原则1.1蛋白质分离纯化的特点1）大多数蛋白质产品是生物活性物质,在分离纯化过程中,有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。
2）蛋白质产品在物料中含量很低,且物料组成非常复杂。
例如,利用基因工程菌发酵生产蛋白质,物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等,目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1%。
有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体,为获取蛋白质,还需进行细胞破碎,结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。
3）含蛋白质产品的物料不稳定,蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。
4）很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用,因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的,产品无菌、无致热源等[2]。
1.2蛋白纯化的一般原则1）蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
蛋白纯化原则和技术介绍
蛋白纯化原则和技术概览无论是蛋白研究还是应用，通常需要将蛋白利用不同的生物系统表达出来，然后进行分离和纯化。
研究实验室通常需要纯化微克或毫克级别的蛋白质，而工业上需要纯化数千克甚至数吨的蛋白质。
因此，蛋白纯化非常重要。
纯化过程中，主要需要考虑宿主污染、样品的可溶性、蛋白结构的完整性和生物活性。
蛋白的纯化可大致分为样品捕获、中度纯化阶段和精细纯化阶段3个阶段。
✓样品捕获：分离、浓缩和稳定化处理；✓中度纯化：去除核酸等其他细胞成分，可使用硫酸铵沉淀法；✓精细纯化：将靶蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，常用方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
蛋白纯化指导原则1. 明确目标，避免过度纯化或者纯化不够；表1. 对蛋白样本纯度要求的例子。
2、明确样本特性和主要的杂质，选择合适的纯化方法；可以通过检测蛋白稳定性窗口（如pH值、离子强度）和蛋白基础数据（如蛋白大小、等电点pl、疏水性、可溶性等）快速确定纯化技术组合。
3、能够快速检测蛋白的回收率、活性和杂质情况；4、尽量减少步骤，从而避免样本损失过多和活性降低过多；5、尽早除去蛋白酶等对样品有损害的杂质；6、尽量少使用添加剂，否则可能需要额外的步骤去除添加剂。
蛋白纯化方法由于样品和蛋白的性质各异，所含杂质也不尽相同，因此需要采用不同的蛋白纯化策略。
目前主要有六种蛋白纯化方法：凝胶过滤层析、离子交换层析、标签纯化、亲和层析、疏水作用层析、电泳等。
其他方法也可用于蛋白纯化，比如利用蛋白的热稳定性、蛋白酶解稳定性、溶解度等特性纯化蛋白。
1 凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种高效的蛋白分离纯化方法，根据分子大小的差异分离蛋白质混合物。
在蛋白溶液通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时，由于不同蛋白的分子大小不同，扩散进入特定大小孔径颗粒的能力也因此各不相同，大分子蛋白率先被洗脱出来，分子量越小，洗脱越晚，从而达到蛋白分离和纯化的目的。
一般来说，越细、越长的凝胶过滤层析柱的纯化效果越好。
分离纯化蛋白质的方法及原理-推荐下载
（2）利用溶解度差别影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。
但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。
1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。
因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。
在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。
不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。
当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。
这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。
5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。
球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。
当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。
当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。
盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。
此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。
蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。
盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。
盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。
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影响盐析的因素
1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般 可在室温中进行。
2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最 低。
周质蛋白质浓缩
收集菌体，重溶细胞沉淀于 30mM Tris-HCl pH8.0 20%的蔗糖中。加入EDTA, pH8.0（终浓度 为1mM）。加入磁力搅拌棒，室温下缓慢搅拌10分 钟。
离心收集细胞，去除上清液。 加入预冷的5mM MgSO4 中彻底重溶沉淀，在冰上
缓慢搅拌悬液10分钟。此时周质蛋白被释放入缓 冲液中。 收集上清以备活性分析
注意： 处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。、 超声破碎细菌一般不宜超过10分钟，溶液变澄清即可停止破碎
蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐 浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此
称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不 同程度下降并先后析出，这种现象称盐析。
蛋白质技术专题
重组蛋白分离与纯化技术
Mcstone
重组蛋白的富集
原核表达（pET载体）
诱导时间 诱导体积（溶氧量） 温度 IPTG用量 转速
酵母表达
温度 时间
分泌蛋白质浓缩
指溶质 从半透 膜的一 侧透过淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可 使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐 析高，但易导致蛋白质变性，应在低温下进行。
蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常 数。
蛋白质分离纯化的目的
生物制药技术中的蛋白质纯化方法详解
生物制药技术中的蛋白质纯化方法详解蛋白质纯化是生物制药技术中的重要一环，其目的是从复杂的混合物中分离出目标蛋白质，并获取高纯度的产物。
这是一项挑战性的工作，涉及到许多不同的技术和方法。
本文将详细介绍几种常见的蛋白质纯化方法。
蛋白质纯化的第一步通常是通过细胞破碎将目标蛋白质从混合物中释放出来。
最常用的方法是机械破碎，通过高速离心或超声波处理来打破细胞壁。
这会导致细胞的破碎和溶解，释放出细胞内的蛋白质。
接下来，需要选择一种适合的分离方法来将目标蛋白质与其他组分分离开来。
以下是几种常见的蛋白质纯化方法：1. 亲和纯化：这种方法利用目标蛋白质与一种亲和剂之间的特异性结合，并通过这种结合关系来将蛋白质从混合物中分离出来。
亲和剂可以是抗体、配体或金属离子等。
例如，可以通过免疫亲和纯化来利用抗体与目标蛋白质结合，然后使用柱层析等技术来分离蛋白质。
2. 柱层析：柱层析是一种常用的蛋白质纯化方法，利用目标蛋白质与柱填充物之间的物理或化学相互作用来分离蛋白质。
常用的柱层析方法包括离子交换层析、逆向相层析、尺寸排阻层析等。
离子交换层析是基于蛋白质带电性质的分离原理，逆向相层析则是利用蛋白质与柱填充物之间的亲水性差异来分离。
3. 凝胶电泳：凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离方法，通过目标蛋白质在凝胶电场中的迁移速率差异来实现分离。
常见的凝胶电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺-硬脂酸凝胶电泳等。
凝胶电泳还可以与其他纯化方法结合使用，例如将目标蛋白质从凝胶中剪切下来进行后续纯化。
4. 超滤：超滤是一种基于分子量的蛋白质纯化方法。
通过选择合适的膜孔径和操作条件，可以将目标蛋白质从较大分子量的杂质分离出来。
超滤适用于蛋白质与其他组分大小相差较大的情况，例如将蛋白质从蛋白质复合物或聚合物中纯化出来。
5. 透析：透析是一种常用的蛋白质纯化和浓缩方法，通过将混合物置于透析膜中，根据蛋白质与其他组分之间的分子量差异来实现分离。
透析可以用于去除小分子杂质、盐溶液等，从而获得高纯度的蛋白质。
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疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的； 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的； 径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种 复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。
电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快 既有离子交换作用，又有分子筛效应 因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换葡聚糖： 常用的离子交换葡聚糖包括： 阳离子交换剂 CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50 Sephadex C-25，Sephadex C-50 阴离子交换剂 DEAE-Sephadex A-25，DEAE-Sephadex A-50 QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50
采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体； 采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选 用亲和层析进行纯化 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶 菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。
针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型
等电点处于极端区域（pI≤5 或 pI≥8）的重组蛋白应首选离子 交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；
10 外源基因表达产物的分离纯化
D 亲和层析
亲和层析的基本概念 亲和层析载体的性质与选择 亲和层析配基的性质与选择 亲和层析的基本操作
亲和层析的基本概念
亲和层析的基本特点
亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力 进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点：
纯化过程简单、迅速，且分离效率高 特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子 纯化倍数大，产物纯度高 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件
10 20 30 40 50 60 70 80 90
10 外源基因表达产物的分离纯化
C 凝胶层析
凝胶层析的基本原理 凝胶介质的基本性质 凝胶介质的选用原则 凝胶层析的基本操作
凝胶层析的基本原理
凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合 物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛
弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子 交换能力逐渐减弱
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换树脂： 最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯
乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物 离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大，
因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换纤维素：
离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水 性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大 分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大
阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等 阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤 维素）
吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋白质失去 电荷而解离下来
不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大 小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个 洗脱下来，达到分离纯化的目的
离子交换介质的基本性质
离子交换剂的分类
阳离子交换剂：强酸型和弱酸型
可电离的基团
亲和层析载体的性质与选择
因此应用范围受到一定的限制
亲和层析的基本概念
具有特异性亲和作用的生物分子
抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体 维生素于其特异性结合蛋白 糖蛋白与其相应的植物凝集素
亲和层析的基本概念
亲和层析的基本原理
亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连 作为固定相吸附剂 当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有 和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结 合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出 然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来
分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之 外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们 下行速度快
分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙 即使大小不同也不能分开；它们的下行速度慢
鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定 以及分离纯化。
磺酸基（-SO3H） 磷酸基（-PO3H2） 羧酸基（-COOH）
酚羟基（-OH）
阴离子交换剂：强碱型和弱碱型
可电离的基团
伯胺基（-NH2） 仲胺基（-NHCH3 ） 叔胺基（-N(CH3)2） 季胺基（-N+(CH3) 3 ）
离子交换介质的基本性质
离子交换剂的分类
强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽 弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小
为准，其中pH值最重要
样品进柱
离子交换层析的基本操作
为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20% 为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高
交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数
离子交换层析的基本操作
样品洗脱
分子浓度 离子强度
pH值
恒定洗脱
阶段洗脱
梯度洗脱
多种分离纯化技术的联合运用
在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来 说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：
应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法 应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段
合适分离纯化介质的选择
常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分 离纯化介质应具有下列性质：
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换葡聚糖：
离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三 维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G） Sephadex的优点如下：
亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核 酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小
离子交换介质的选择原则
一般而言： 酸性物质用阴离子交换剂分离 碱性物质用阳离子交换剂分离 氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化
曲线来选择
离子交换介质的选择原则
对pI=5的某酸性蛋白质
当蛋白质为阴离子时， 在pH5.5-9.0的范围内， 应首选DEAE纤维素；
当蛋白质为阳离子时， 在pH3.5-4.5的范围内， 应首选C凝胶（ Sephadex ）
葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G 150、G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升
葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解 湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温 Sephadex LH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既 可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶 质的凝胶过滤
离子交换介质的基本性质
常用的离子交换剂
离子交换琼脂糖：
离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B DEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型） 的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点 尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因 此具有稳定的外形体积
凝胶介质的基本性质
琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose （ Sepharose 2B、4B、6B，数字代表干胶的百分比 ）和Bio-Gel-A等 （Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，数字X106代表排 阻限度。
当温度高于50℃时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。 琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大 分子物质（如蛋白质和DNA）。 Sepharose CL是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围 与普通琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。
凝胶介质的基本性质
聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联 而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交 联剂越多，孔隙越小。
聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种 （ 数字X1000就相当于该凝胶的排阻限度）
凝胶介质的选用原则
组别分离
将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分 离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。
组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50，对于小肽和低分子量 的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用Sephadex G-10、G15、Bio-Gel P-2或P-4
离子交换介质的基本性质
离子交换剂的基本性能
离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物 如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；
离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳 离子或阴离子起交换作用
如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗 脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数